CN107164490A - 一种用于鉴定浙贝母的引物对及其应用 - Google Patents

一种用于鉴定浙贝母的引物对及其应用 Download PDF

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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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Abstract

本发明公开了一种用于鉴定浙贝母的引物对及其应用，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。(1)本发明所述引物对能够直接对单一样品进行鉴定，因此该方法操作简单、准确、应用范围广等优点；(2)本发明所述引物对特异性好，结果重复性好，灵敏度高，适合开发成检测试剂盒。

Description

一种用于鉴定浙贝母的引物对及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段鉴定中药的方法，具体为一种用于鉴定浙贝母的引物对及其应用。
背景技术
浙贝母为道地药材“浙八味”之一，具有润肺止咳的功效，用药历史悠久。贝母品种较多，除了浙贝母外，贝母主要品种还包括川贝母、湖北贝母、平贝母和伊贝母，另外流通领域还存在较多贝母伪品。不同品种的贝母药效差异显著，而且价格相差较大，需要建立一种准确、高效的鉴定方法。目前，较多学者利用RAPD技术对浙贝母及其它药材进行分子鉴定，但是由于RAPD实验应用的是随机引物，导致实验结果重复性差，无法推广应用。
中药的基源鉴定是中药研究工作的基础和关键。品种混乱现象是目前贝母类药材在实际应用中较难以克服的问题，而传统的鉴别方法又有一定的主观性，特别是对一些开花前的新鲜贝母药材、干燥或破碎药材，鉴定时更为困难，不仅如此，贝母属植物种间的化学成分差异较大，用理化方法鉴定时也比较困难。
核糖体DNA的内转录间隔区基因与5SrDNA转录间隔区基因是目前研究中应用较多的序列片段之一，是被子植物进化研究中重要的DNA分子标记。
针对目前贝母类药材基源混乱，部分资源短缺的状况，为了建立有效的鉴别方法，同时了解贝母属植物的种系关系，并从中寻找出可利用的药用贝母资源，对贝母的样品进行高效、准确的分子鉴定尤为重要。
发明内容
本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种适用于浙贝母，且能够特异性识别浙贝母的基因片段，准确、快速进行贝母品种区分的方法，本发明提供了一种用于鉴定浙贝母的引物对及其应用。
技术方案：一种用于鉴定浙贝母的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ IDNO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
优选的，所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
表1引物对及发卡结构序列
名称 序列(5’-3’) SEQ ID NO.
P1-F GGACAGTACTGGGGGAGAAGTC 1
P1-R GCCAAATGGAGGGTATGTGTCG 2
P2-F CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA 3
P2-R TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG 4
P3-F GGATCCGTGCTTGGGCGAGAGTAGTA 5
P3-R GGATCCTTAGTGCTGGTATGATCGCA 6
发卡结构 CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG 7
所述引物对在制备鉴定中药浙贝母试剂盒中的应用。
优选的，所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
优选的，所述试剂盒鉴定中药浙贝母的步骤为：
(1)提取浙贝母样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100～1000倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
优选的，所述浙贝母样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
优选的，所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
有益效果：(1)本发明所述引物对能够直接对单一样品进行鉴定，因此该方法操作简单、准确、应用范围广等优点；(2)本发明所述引物对特异性好，结果重复性好，灵敏度高，适合开发成检测试剂盒。
附图说明
图1是实施例1～3PCR鉴定结果电泳图；
其中M为分子量为2000的Maker；1为实施例1PCR产物鉴定结果；2为实施例2PCR产物鉴定结果；3为实施例3PCR产物鉴定结果；4～7为市售其他品种贝母。
具体实施方式
实施例1
一种用于鉴定浙贝母的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定中药浙贝母试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定中药浙贝母的步骤为：
(1)提取浙贝母样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释1000倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述浙贝母样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
实施例2
一种用于鉴定浙贝母的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定中药浙贝母试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定中药浙贝母的步骤为：
(1)提取浙贝母样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述浙贝母样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
实施例3
一种用于鉴定浙贝母的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定中药浙贝母试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定中药浙贝母的步骤为：
(1)提取浙贝母样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释500倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释50倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述浙贝母样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
如图1所示，将实施例1～3的扩增产物进行电泳检测，条带清晰可见，产物单一。其余品种无扩增条带。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州市李良济健康产业有限公司
<120> 一种用于鉴定浙贝母的引物对及其应用
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggacagtact gggggagaag tc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gccaaatgga gggtatgtgt cg 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgtaacaagg tttccgtagg tgaa 24
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttattgatat gcttaaactc agcggg 26
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggatccgtgc ttgggcgaga gtagta 26
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggatccttag tgctggtatg atcgca 26
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg 40

Claims (7)

1.一种用于鉴定浙贝母的引物对，其特征在于，所述引物对及其序列为：P1，SEQ IDNO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
2.根据权利要求1所述的一种用于鉴定浙贝母的引物对，其特征在于，所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5，端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
3.权利要求1或2所述引物对在制备鉴定中药浙贝母试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒鉴定中药浙贝母的步骤为：
(1)提取浙贝母样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100～1000倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述浙贝母样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
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