CN107164490A - 一种用于鉴定浙贝母的引物对及其应用 - Google Patents
一种用于鉴定浙贝母的引物对及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴定浙贝母的引物对及其应用,所述引物对及其序列为:P1,SEQ ID NO.1~2;P2,SEQ ID NO.3~4;P3,SEQ ID NO.5~6。(1)本发明所述引物对能够直接对单一样品进行鉴定,因此该方法操作简单、准确、应用范围广等优点;(2)本发明所述引物对特异性好,结果重复性好,灵敏度高,适合开发成检测试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域,涉及一种采用分子生物学手段鉴定中药的方法,具体为一种用于鉴定浙贝母的引物对及其应用。
背景技术
浙贝母为道地药材“浙八味”之一,具有润肺止咳的功效,用药历史悠久。贝母品种较多,除了浙贝母外,贝母主要品种还包括川贝母、湖北贝母、平贝母和伊贝母,另外流通领域还存在较多贝母伪品。不同品种的贝母药效差异显著,而且价格相差较大,需要建立一种准确、高效的鉴定方法。目前,较多学者利用RAPD技术对浙贝母及其它药材进行分子鉴定,但是由于RAPD实验应用的是随机引物,导致实验结果重复性差,无法推广应用。
中药的基源鉴定是中药研究工作的基础和关键。品种混乱现象是目前贝母类药材在实际应用中较难以克服的问题,而传统的鉴别方法又有一定的主观性,特别是对一些开花前的新鲜贝母药材、干燥或破碎药材,鉴定时更为困难,不仅如此,贝母属植物种间的化学成分差异较大,用理化方法鉴定时也比较困难。
核糖体DNA的内转录间隔区基因与5SrDNA转录间隔区基因是目前研究中应用较多的序列片段之一,是被子植物进化研究中重要的DNA分子标记。
针对目前贝母类药材基源混乱,部分资源短缺的状况,为了建立有效的鉴别方法,同时了解贝母属植物的种系关系,并从中寻找出可利用的药用贝母资源,对贝母的样品进行高效、准确的分子鉴定尤为重要。
发明内容
本发明的目的是:为了克服现有技术的缺陷,获得一种适用于浙贝母,且能够特异性识别浙贝母的基因片段,准确、快速进行贝母品种区分的方法,本发明提供了一种用于鉴定浙贝母的引物对及其应用。
技术方案:一种用于鉴定浙贝母的引物对,所述引物对及其序列为:P1,SEQ IDNO.1~2;P2,SEQ ID NO.3~4;P3,SEQ ID NO.5~6。
优选的,所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构,所述发卡结构的长度为40bp,序列为SEQ ID NO.7。
表1引物对及发卡结构序列
名称 | 序列(5’-3’) | SEQ ID NO. |
P1-F | GGACAGTACTGGGGGAGAAGTC | 1 |
P1-R | GCCAAATGGAGGGTATGTGTCG | 2 |
P2-F | CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA | 3 |
P2-R | TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG | 4 |
P3-F | GGATCCGTGCTTGGGCGAGAGTAGTA | 5 |
P3-R | GGATCCTTAGTGCTGGTATGATCGCA | 6 |
发卡结构 | CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG | 7 |
所述引物对在制备鉴定中药浙贝母试剂盒中的应用。
优选的,所述试剂盒的组分包括:引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
优选的,所述试剂盒鉴定中药浙贝母的步骤为:
(1)提取浙贝母样品的基因组DNA;
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板,以P1为特异性引物,进行第一轮PCR扩增;
(3)取步骤(2)的扩增产物,稀释100~1000倍后作为第二轮PCR的模板,以P2作为特异性引物,进行第二轮PCR扩增;
(4)取第二轮PCR扩增的产物,稀释10~100倍后作为第三轮PCR的模板,以P3作为特异性引物,进行第三轮PCR扩增;
(5)收集第三轮PCR扩增的产物,并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
优选的,所述浙贝母样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
优选的,所述PCR扩增的程序为:95℃,2min;95℃,30s,52℃,30s,72℃,55s,35个循环;72℃,7min。
有益效果:(1)本发明所述引物对能够直接对单一样品进行鉴定,因此该方法操作简单、准确、应用范围广等优点;(2)本发明所述引物对特异性好,结果重复性好,灵敏度高,适合开发成检测试剂盒。
附图说明
图1是实施例1~3PCR鉴定结果电泳图;
其中M为分子量为2000的Maker;1为实施例1PCR产物鉴定结果;2为实施例2PCR产物鉴定结果;3为实施例3PCR产物鉴定结果;4~7为市售其他品种贝母。
具体实施方式
实施例1
一种用于鉴定浙贝母的引物对,所述引物对及其序列为:P1,SEQ ID NO.1~2;P2,SEQ ID NO.3~4;P3,SEQ ID NO.5~6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构,所述发卡结构的长度为40bp,序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定中药浙贝母试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括:引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定中药浙贝母的步骤为:
(1)提取浙贝母样品的基因组DNA;
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板,以P1为特异性引物,进行第一轮PCR扩增;
(3)取步骤(2)的扩增产物,稀释1000倍后作为第二轮PCR的模板,以P2作为特异性引物,进行第二轮PCR扩增;
(4)取第二轮PCR扩增的产物,稀释10倍后作为第三轮PCR的模板,以P3作为特异性引物,进行第三轮PCR扩增;
(5)收集第三轮PCR扩增的产物,并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述浙贝母样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为:95℃,2min;95℃,30s,52℃,30s,72℃,55s,35个循环;72℃,7min。
实施例2
一种用于鉴定浙贝母的引物对,所述引物对及其序列为:P1,SEQ ID NO.1~2;P2,SEQ ID NO.3~4;P3,SEQ ID NO.5~6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构,所述发卡结构的长度为40bp,序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定中药浙贝母试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括:引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定中药浙贝母的步骤为:
(1)提取浙贝母样品的基因组DNA;
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板,以P1为特异性引物,进行第一轮PCR扩增;
(3)取步骤(2)的扩增产物,稀释100倍后作为第二轮PCR的模板,以P2作为特异性引物,进行第二轮PCR扩增;
(4)取第二轮PCR扩增的产物,稀释100倍后作为第三轮PCR的模板,以P3作为特异性引物,进行第三轮PCR扩增;
(5)收集第三轮PCR扩增的产物,并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述浙贝母样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为:95℃,2min;95℃,30s,52℃,30s,72℃,55s,35个循环;72℃,7min。
实施例3
一种用于鉴定浙贝母的引物对,所述引物对及其序列为:P1,SEQ ID NO.1~2;P2,SEQ ID NO.3~4;P3,SEQ ID NO.5~6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构,所述发卡结构的长度为40bp,序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定中药浙贝母试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括:引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定中药浙贝母的步骤为:
(1)提取浙贝母样品的基因组DNA;
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板,以P1为特异性引物,进行第一轮PCR扩增;
(3)取步骤(2)的扩增产物,稀释500倍后作为第二轮PCR的模板,以P2作为特异性引物,进行第二轮PCR扩增;
(4)取第二轮PCR扩增的产物,稀释50倍后作为第三轮PCR的模板,以P3作为特异性引物,进行第三轮PCR扩增;
(5)收集第三轮PCR扩增的产物,并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述浙贝母样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为:95℃,2min;95℃,30s,52℃,30s,72℃,55s,35个循环;72℃,7min。
如图1所示,将实施例1~3的扩增产物进行电泳检测,条带清晰可见,产物单一。其余品种无扩增条带。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州市李良济健康产业有限公司
<120> 一种用于鉴定浙贝母的引物对及其应用
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggacagtact gggggagaag tc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gccaaatgga gggtatgtgt cg 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgtaacaagg tttccgtagg tgaa 24
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttattgatat gcttaaactc agcggg 26
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggatccgtgc ttgggcgaga gtagta 26
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggatccttag tgctggtatg atcgca 26
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg 40
Claims (7)
1.一种用于鉴定浙贝母的引物对,其特征在于,所述引物对及其序列为:P1,SEQ IDNO.1~2;P2,SEQ ID NO.3~4;P3,SEQ ID NO.5~6。
2.根据权利要求1所述的一种用于鉴定浙贝母的引物对,其特征在于,所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5,端加上特异性的GC发卡结构,所述发卡结构的长度为40bp,序列为SEQ ID NO.7。
3.权利要求1或2所述引物对在制备鉴定中药浙贝母试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述试剂盒的组分包括:引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述试剂盒鉴定中药浙贝母的步骤为:
(1)提取浙贝母样品的基因组DNA;
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板,以P1为特异性引物,进行第一轮PCR扩增;
(3)取步骤(2)的扩增产物,稀释100~1000倍后作为第二轮PCR的模板,以P2作为特异性引物,进行第二轮PCR扩增;
(4)取第二轮PCR扩增的产物,稀释10~100倍后作为第三轮PCR的模板,以P3作为特异性引物,进行第三轮PCR扩增;
(5)收集第三轮PCR扩增的产物,并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述浙贝母样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
7.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述PCR扩增的程序为:95℃,2min;95℃,30s,52℃,30s,72℃,55s,35个循环;72℃,7min。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111575273A (zh) * | 2020-04-08 | 2020-08-25 | 康美华大基因技术有限公司 | 一种中药贝母dna提取试剂及提取方法 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6569625B1 (en) * | 1999-07-14 | 2003-05-27 | The Hong Kong University Of Science & Technology | Fritillaria species identification |
CN1438326A (zh) * | 2003-03-20 | 2003-08-27 | 中国药科大学 | 中药浙贝母聚合酶链反应鉴定引物及鉴定方法 |
CN1487092A (zh) * | 2003-07-30 | 2004-04-07 | 中国药科大学 | 中药伊贝母分子生物学鉴定方法 |
CN101104868A (zh) * | 2005-07-11 | 2008-01-16 | 香港赛马会中药研究院有限公司 | 基于5S rRNA间隔序列的草药鉴定方法 |
CN102899409A (zh) * | 2012-09-20 | 2013-01-30 | 浙江工业大学 | 浙贝母pcr鉴定试剂盒及鉴定方法 |
CN105861663A (zh) * | 2016-04-15 | 2016-08-17 | 广西壮族自治区梧州食品药品检验所 | 一种定量鉴别浙贝母的方法 |
CN106191294A (zh) * | 2016-08-26 | 2016-12-07 | 中山市中智药业集团有限公司 | 一种利用dgge鉴定混合中药粉末组成物种的方法 |
-
2017
- 2017-06-07 CN CN201710421453.5A patent/CN107164490A/zh active Pending
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6569625B1 (en) * | 1999-07-14 | 2003-05-27 | The Hong Kong University Of Science & Technology | Fritillaria species identification |
CN1438326A (zh) * | 2003-03-20 | 2003-08-27 | 中国药科大学 | 中药浙贝母聚合酶链反应鉴定引物及鉴定方法 |
CN1487092A (zh) * | 2003-07-30 | 2004-04-07 | 中国药科大学 | 中药伊贝母分子生物学鉴定方法 |
CN101104868A (zh) * | 2005-07-11 | 2008-01-16 | 香港赛马会中药研究院有限公司 | 基于5S rRNA间隔序列的草药鉴定方法 |
CN102899409A (zh) * | 2012-09-20 | 2013-01-30 | 浙江工业大学 | 浙贝母pcr鉴定试剂盒及鉴定方法 |
CN105861663A (zh) * | 2016-04-15 | 2016-08-17 | 广西壮族自治区梧州食品药品检验所 | 一种定量鉴别浙贝母的方法 |
CN106191294A (zh) * | 2016-08-26 | 2016-12-07 | 中山市中智药业集团有限公司 | 一种利用dgge鉴定混合中药粉末组成物种的方法 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
于浩 等: "《生物信息学实验指导》", 30 September 2009, 吉林大学出版社 * |
孙军 等: "《医学生物化学与分子生物学实验》", 30 April 2008, 华中科技大学出版社 * |
彭昕: "分子生物学方法鉴定药用贝母的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》 * |
徐传林 等: "川贝母药材分子鉴定方法研究", 《中国药科大学学报》 * |
李敏 等: "浙贝母特异性PCR鉴定方法研究", 《中草药》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111575273A (zh) * | 2020-04-08 | 2020-08-25 | 康美华大基因技术有限公司 | 一种中药贝母dna提取试剂及提取方法 |
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