CN107164486A - 一种用于鉴定中药川贝母的引物对及其应用 - Google Patents
一种用于鉴定中药川贝母的引物对及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴定中药川贝母的引物对及其应用，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。(1)本发明所述引物对特异性好，灵敏度高，能够准确识别目标片段；(2)本发明所述方法高效、简便；(3)本发明所述方法能够准确鉴定市售混伪品，为川贝母的鉴定分析提供科学依据。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段鉴定中药的方法，具体为一种用于鉴定中药川贝母的引物对及其应用。
背景技术
川贝母为百合科贝母属多种植物的干燥鳞茎，是最具有代表性的川产名贵药材之一。传统中医药理论认为其具有清热润肺，化痰止咳，散结，降压解痉等功效，主治肺热燥咳、咳痰带血、痰多胸闷等症，为止咳润肺之“圣药”。现代药理学研究表明其具有较好的镇咳、祛痰、平喘、抗菌、镇静、镇痛、心血管活性、抗溃疡、抗血小板聚集、抗肿瘤等作用。由于川贝母生长周期长、资源紧缺，已成为中药材中价格最昂贵的根茎类药材之一。2010版《中华人民共和国药典》中收录川贝母基源植物包括川贝母、暗紫贝母、甘肃贝母、梭砂贝母、太白贝母和瓦布贝母，但我国已查明贝母属植物超过50种，其中伊犁贝母、平贝母、米贝母、轮叶贝母等作为川贝母的混伪品频繁出现，甚至葫芦科有毒植物土贝母的鳞茎也被发现冒充川贝母出售。随着需求量的增加，川贝母基源混乱的现象呈现不断增加的趋势，直接影响到川贝母临床用药的安全、疗效。
因此开展川贝母药材更深入的鉴定研究，针对其制定一种高效、简便的基源物种鉴定方法，对于川贝母临床用药，质量控制以及合理开发利用川贝母属植物资源具有重要意义。
DNA条形码技术是利用基因组中一段标准短序列来进行物种鉴定的分子诊断新技术，由于该技术基于DNA片段进行物种鉴定和亲缘关系的定位，了解其分支来源，甚至可以预知其进化方向等诸多用途，使其成为近年来生物分类学家关注的热点。在中药鉴定领域中，相对传统中药材鉴别方法(性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别)，其具有不受物种外在形状特征、发育阶段等因素影响的特点。目前已有芸香料、蔷薇科、豆科、重楼属等多个药用植物丰富的植物科属展开了DNA条形码研究并取得良好鉴定效果。其中核糖体DNA中的ITS2区具有进化速率快，高度重复、长度适中等优点，成为药用植物DNA条形码研究中最为重要候选序列之一。
发明内容
本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种采用分子生物学手段鉴定川贝母混伪品，具有高效、简便的的特点，本发明提供了一种用于鉴定中药川贝母的引物对及其应用。
技术方案：一种用于鉴定中药川贝母的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
优选的，所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5，端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
表1引物对及发卡结构序列
| 名称 | 序列(5，-3，) | SEQ ID NO. |
| P1-F | GGCATAATAGGCGGGCGAGCTAATC | 1 |
| P1-R | GCGGTGAGATTAGATCATAATTTCGGTG | 2 |
| P2-F | GCTATTAGCATTAATCGATCGAATTC | 3 |
| P2-R | GGGATCGAATTCATGGATTAGTACACAAT | 4 |
| P3-F | GATCCGGGTCTCTTGAGCCCCTTG | 5 |
| P3-R | GTACCGTGTTCACGATTGCCTCAGG | 6 |
| 发卡结构 | CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG | 7 |
所述引物对在制备鉴定中药川贝母试剂盒中的应用。
优选的，所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
优选的，所述试剂盒鉴定中药川贝母的步骤包括：
(1)提取川贝母样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释20～200倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
优选的，所述川贝母样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
优选的，所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
有益效果：(1)本发明所述引物对特异性好，灵敏度高，能够准确识别目标片段；(2)本发明所述方法高效、简便；(3)本发明所述方法能够准确鉴定市售混伪品，为川贝母的鉴定分析提供科学依据。
附图说明
图1是实施例1～3PCR鉴定结果电泳图；
其中M为分子量为2000的Maker；1为实施例1PCR产物鉴定结果；2为实施例2PCR产物鉴定结果；3为实施例3PCR产物鉴定结果。
具体实施方式
实施例1
一种用于鉴定中药川贝母的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5，端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定中药川贝母试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定中药川贝母的步骤包括：
(1)提取川贝母样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述川贝母样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
实施例2
一种用于鉴定中药川贝母的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5，端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定中药川贝母试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定中药川贝母的步骤包括：
(1)提取川贝母样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释80倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释50倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述川贝母样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
实施例3
一种用于鉴定中药川贝母的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5，端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定中药川贝母试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定中药川贝母的步骤包括：
(1)提取川贝母样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释20倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述川贝母样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州市李良济健康产业有限公司
<120> 一种用于鉴定中药川贝母的引物对及其应用
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggcataatag gcgggcgagc taatc 25
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcggtgagat tagatcataa tttcggtg 28
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctattagca ttaatcgatc gaattc 26
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gggatcgaat tcatggatta gtacacaat 29
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gatccgggtc tcttgagccc cttg 24
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gtaccgtgtt cacgattgcc tcagg 25
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg 40
Claims (7)
1.一种用于鉴定中药川贝母的引物对，其特征在于，所述引物对及其序列为：P1，SEQID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
2.根据权利要求1所述的一种用于鉴定中药川贝母的引物对，其特征在于，所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5，端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
3.权利要求1或2所述引物对在制备鉴定中药川贝母试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒鉴定中药川贝母的步骤包括：
(1)提取川贝母样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释20～200倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述川贝母样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
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2017
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