CN106755396A - 一种用于构建枸杞dna指纹图谱的引物组合以及应用和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合以及应用和方法，属于DNA指纹图谱技术领域。本发明在枸杞基因测序结果基础上首次开发筛选出了具有多态性的15个SSR引物对，该15个SSR引物对可用于构建枸杞DNA指纹图谱，并结合毛细管电泳技术构建得到的枸杞DNA指纹图谱，具有电泳分辨率高、灵敏度高、数据分析处理便捷等特点，为DNA指纹图谱的在枸杞上的进一步应用研究提供了坚实的理论支持。

Description

一种用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合以及应用和方法
技术领域
本发明涉及DNA指纹图谱技术领域，具体而言，涉及一种用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合以及应用和方法。
背景技术
枸杞是我国传统的中药材，在中药材领域具有重要的地位。宁夏作为枸杞地道产区，枸杞种植历史悠久，在枸杞育种、栽培、加工等方面成果颇丰。近年来，随着枸杞育种方法的不断进步，新的枸杞品种也不断涌现，这些枸杞种质资源有许多优异品种未能被合理利用。因此，将这些枸杞种质资源进行有效分类和鉴定，对枸杞种质资源的研究、品种创新尤为重要。
DNA指纹图谱技术对植物品种进行分离和鉴定的有效手段。DNA指纹图谱是指DNA样品用特定分子标记技术处理显示出具有特定DNA片段的总称。DNA指纹图谱技术最早用于在刑侦或亲子鉴定上确定人的身份，而后随着生物技术的进步与发展，DNA指纹图谱技术在很多植物上得到广泛的应用。目前，常用于构建DNA指纹图谱的分子标记有SSR、AFLP、SRAP、SCoT、RAPD、SNP以及ISSR。不同分子标记构建的DNA指纹图谱各有其特点。其中，以ISSR、SSR、SRAP应用最广泛。
目前，DNA指纹图谱的在枸杞上的应用研究并不多，由其是以SSR分子标记技术来构建枸杞DNA指纹图谱的更未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合，该引物组合可用于构建出枸杞DNA指纹图谱。
本发明的另一目的在于提供上述引物组合在构建枸杞DNA指纹图谱中的应用。
本发明的另一目的在于提供构建枸杞DNA指纹图谱的方法，该方法所构建出的枸杞DNA指纹图谱能够准确反应出枸杞DNA指纹图谱的信息。
本发明的另一目的在于提供采用上述方法得到的枸杞DNA指纹图谱在鉴定枸杞种质资源中的应用。
本发明是这样实现的：
一种用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合，其包括第1-15引物对，上述第1-15引物对的碱基序列分别如SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ ID NO.15-16、SEQ ID NO.17-18、SEQ ID NO.19-20、SEQ ID NO.21-22、SEQ ID NO.23-24、SEQ ID NO.25-26、SEQ IDNO.27-28、SEQ ID NO.29-30所示。
上述的用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合在构建枸杞DNA指纹图谱中的应用。
一种构建枸杞DNA指纹图谱的方法，其包括：用上述的用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合的第1-15引物对分别对多个枸杞种质的DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；
将上述扩增产物分别进行电泳，得到扩增带型数；
将上述扩增带型数进行编码处理，得到每一种上述枸杞种质的DNA对应上述第1-15引物对的第1-15编号，串联上述第1-15编号形成字符串。
上述的构建枸杞DNA指纹图谱的方法所得到的枸杞DNA指纹图谱在鉴定枸杞种质资源中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的通过SSR分子标记技术对枸杞基因组序列进行分析筛选，得到可用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合，该引物组合包括SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ IDNO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ IDNO.15-16、SEQ ID NO.17-18、SEQ ID NO.19-20、SEQ ID NO.21-22、SEQ ID NO.23-24、SEQID NO.25-26、SEQ ID NO.27-28、SEQ ID NO.29-30所示的15个引物对，该15个引物对可用于构建枸杞品种或枸杞种质的DNA指纹图谱，所得到的枸杞DNA指纹图谱可以是以电泳图谱表示的或者是以字符串表示的，其反应的指纹信息准确可靠，该枸杞DNA指纹图谱作为枸杞种质资源鉴定的参考依据，为枸杞的市场流通、栽培管理等领域得到进一步的推广利用提供支持。同时也为为DNA指纹图谱的在枸杞上的进一步应用研究提供了坚实的理论支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明用第3引物对对宁杞1号扩增后的毛细管电泳图谱；
图2为本发明用第5引物对对宁杞1号扩增后的毛细管电泳图谱；
图3为本发明用第7引物对对宁杞1号扩增后的毛细管电泳图谱；
图4为本发明用第11引物对对宁杞1号扩增后的毛细管电泳图谱；
图5为本发明用第13引物对对宁杞1号扩增后的毛细管电泳图谱；
图6为本发明用第8引物对对宁杞1号扩增后的毛细管电泳图谱；
图7为本发明用第10引物对对宁杞1号扩增后的毛细管电泳图谱；
图8为本发明用第14引物对对宁杞1号扩增后的毛细管电泳图谱；
图9为本发明用第1引物对对宁杞1号扩增后的毛细管电泳图谱；
图10为本发明用第15引物对对宁杞1号扩增后的毛细管电泳图谱；
图11为本发明用第12引物对对宁杞1号扩增后的毛细管电泳图谱；
图12为本发明用第4引物对对宁杞1号扩增后的毛细管电泳图谱；
图13为本发明用第2引物对对宁杞1号扩增后的毛细管电泳图谱；
图14为本发明用第9引物对对宁杞1号扩增后的毛细管电泳图谱；
图15为本发明用第6引物对对宁杞1号扩增后的毛细管电泳图谱；
图16为本发明用第10引物对对宁杞5号扩增后的毛细管电泳图谱；
图17为本发明用第10引物对对宁杞7号扩增后的毛细管电泳图谱；
图18为本发明用第10引物对对宁农杞9号扩增后的毛细管电泳图谱；
图19为本发明用第10引物对对蒙杞1号扩增后的毛细管电泳图谱；
图20为本发明用第10引物对对宁夏黄果扩增后的毛细管电泳图谱；
图21为本发明用第10引物对对宁杞菜1号扩增后的毛细管电泳图谱；
图22为本发明用第10引物对对黑果扩增后的毛细管电泳图谱；
图23为本发明用第10引物对对中国扩增后的毛细管电泳图谱；
图24为本发明用第10引物对对北方扩增后的毛细管电泳图谱；
图25为本发明用第10引物对对云南扩增后的毛细管电泳图谱；
图26为本发明用第10引物对对蔓生扩增后的毛细管电泳图谱；
图27为本发明用第10引物对对新疆扩增后的毛细管电泳图谱；
图28为本发明用第10引物对对红枝扩增后的毛细管电泳图谱；
图29为本发明用第10引物对对柱筒扩增后的毛细管电泳图谱；
图30为本发明用第10引物对对截萼扩增后的毛细管电泳图谱；
图31为本发明用第10引物对对CJ扩增后的毛细管电泳图谱；
图32为本发明用第10引物对对HB扩增后的毛细管电泳图谱；
图33为本发明用第10引物对对SC扩增后的毛细管电泳图谱；
图34为本发明用第10引物对对AN扩增后的毛细管电泳图谱；
图35为本发明用第10引物对对W30扩增后的毛细管电泳图谱；
图36为本发明用第10引物对对HZ01扩增后的毛细管电泳图谱；
图37为本发明用第10引物对对ZH08扩增后的毛细管电泳图谱；
图38为本发明用第10引物对对W27扩增后的毛细管电泳图谱；
图39为本发明用第10引物对对W15扩增后的毛细管电泳图谱；
图40为本发明用第10引物对对ZH02扩增后的毛细管电泳图谱；
图41为本发明用第10引物对对W13扩增后的毛细管电泳图谱；
图42为本发明用第10引物对对W26扩增后的毛细管电泳图谱；
图43为本发明用第10引物对对W37扩增后的毛细管电泳图谱；
图44为本发明用第10引物对对白花扩增后的毛细管电泳图谱；
图45为本发明实施例8得到的宁杞1号的DNA指纹图谱的二维码图片。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合以及应用和方法进行具体说明。
SSR标记，又称微卫星标记(microsatellite)，又称为短串联重复序列(shorttandem repeats，STRs)或简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)，是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由2～6个核苷酸的串联重复片段构成，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，因此微卫星标记的应用非常广泛。每个微卫星DNA都有核心序列和侧翼序列组成，侧翼DNA序列位于核心序列两端，是保守的特异性单拷贝序列。根据微卫星DNA两端的侧翼序列的保守性，设计一对特异性的引物，利用荧光标记的PCR引物对微卫星位点进行扩增，然后通过高分辨率的凝胶电泳对扩增片段进行分离，通过荧光检测系统确定扩增片段的长度以检测分析微卫星序列的多态性。微卫星序列的多态性即可反应不同物种或相似物种之间的差异性。
基于此，本发明的发明人在对枸杞基因组的测序结果的基础上开发并筛选得到具有多态性的可用于构建枸杞DNA指纹图谱的核心SSR引物。据此，提出了如下几方面的内容请求保护。
一方面，本发明提供了用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合，其包括第1-15引物对(即SSR引物)，第1-15引物对的碱基序列分别如SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ IDNO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ IDNO.15-16、SEQ ID NO.17-18、SEQ ID NO.19-20、SEQ ID NO.21-22、SEQ ID NO.23-24、SEQID NO.25-26、SEQ ID NO.27-28、SEQ ID NO.29-30所示。
结合常规的PCR扩增技术和电泳技术，利用引物组合即可实现对多个枸杞种质或枸杞品质的DNA指纹图谱的构建目的。
优选地，第1-15引物对中每个引物对的上游引物的5’端标记有荧光基因；或者第1-15引物对中每个引物对的下游引物的5’端标记有荧光基因。
为了便于后续PCR扩增提高特异性和产物浓度以扩大检测信号，优选地，可在第1-15引物对中每个引物对的上游引物的5’端连接M13通用引物的序列，荧光标记基因标记在M13通用引物的5’端。当然，在其他的实施例中，也可以不用标记荧光基因。
通过对第1-15引物对进行标记荧光基团，使得扩增的产物可通过高分辨率的电泳技术例如毛细管电泳技术进行分离并被自动荧光检测，大大地提高了对扩增产物的分型准确率，确保所得枸杞DNA指纹图谱的所反应的信息也更准确。
优选地，荧光基因为选自FAM、TAMRA、HEX和ROX中的任意一种。
另一方面，本发明提供了用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合在构建枸杞DNA指纹图谱中的应用。
再一方面，本发明还提供了构建枸杞DNA指纹图谱的方法，其其包括：采用上述的用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合的第1-15引物对分别对多个枸杞种质的DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；
将扩增产物分别进行电泳，得到扩增带型数；
将扩增带型数进行编码处理，得到每一种枸杞种质的DNA对应第1-15引物对的第1-15编号，串联第1-15编号形成字符串。
优选地，编码处理是指：将第1-15引物对中每对引物对对应的扩增带型数按照升序排列，并按顺序标号，当序号数小于9时，用数字1-9顺序表示，当序号数大于9时，用英文字母A-Z顺序表示。未扩增出条带的用0表示。
当然，在其他的实施例中，编码处理还可以是指：将第1-15引物对中每对引物对对应的扩增带型数按照降序方式排列，并按顺序标号，用数字9-1顺序表示，当序号数小于1时，用英文字母Z-A顺序表示。未扩增出条带的用0表示。
当然，编码处理的标号规则可根据具体情况进行调整或选择，其并不限于所述的两种编码处理方式。只要是利用本发明提供引物组合或提供构建枸杞DNA指纹图谱的方法来构建枸杞DNA指纹图谱，无论采用何种编码处理方式均属于本发明的保护范围。
此外，优选地，串联第1-15编号形成字符串是指：按第1编号、第2编号、第3编号、第4编号、第5编号、第6编号、第7编号、第8编号、第9编号、第10编号、第11编号、第12编号、第13编号、第14编号、第15编号的顺序进行串联形成字符串。
当然，在其他的优选的实施例中，串联第1-15编号形成字符串还可以是指：按第15编号、第14编号、第13编号、第12编号、第11编号、第10编号、第9编号、第8编号、第7编号、第6编号、第5编号、第4编号、第3编号、第2编号、第1编号的顺序进行串联形成字符串。
同样，串联第1-15编号形成字符串的具体串联顺序也并不限于上述的串联顺序，采用其他的顺序进行串联第1-15编号形式述字符串也属于本发明的保护范围。
进一步地，构建枸杞DNA指纹图谱的方法还包括：利用二维码技术将字符串形成二维码图形。通过以二维码图形表示的DNA指纹图谱，使得所构建的DNA指纹图谱不仅能正确反应枸杞种质的DNA指纹图谱信息，还能在枸杞的市场流通、栽培管理等领域得到进一步的推广利用，并且还可以应用于可追溯体系建设和管理。
进一步地，PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；72℃5min。
再一方面，本发明还提供了上述的构建枸杞DNA指纹图谱的方法所得到的枸杞DNA指纹图谱在鉴定枸杞种质资源中的应用。
综上，本发明首次基于枸杞基因测序结果基础上开发筛选得到具有多态性的核心骨干SSR引物，即可用于构建枸杞DNA指纹图谱的第1-15引物对。且利用SSR分子标记结合毛细管电泳技术构建出了枸杞DNA指纹图谱，并进一步克服了传统琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率低、灵敏度低、数据分析困难等缺点。使得采用发明提供的引物组合或构建枸杞DNA指纹图谱方法在构建的过程具有分辨率高、灵敏度高、数据分析便捷等特点。为DNA指纹图谱在枸杞上的应用研究提供更多的理论支持，同时本发明得到枸杞DNA指纹图谱也为对枸杞种质资源或枸杞加工产品的鉴定、分类、流通以及管理等领域提供便捷可靠的参考依据。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合，其包括第1-15引物对，各引物对的上游引物(F)和下游引物(R)的碱基序列如下表1所示。其中，各引物对的上游引物的5’端连接有M13通用引物，其序列如表1中的下划线部分所示。当然，在其他的实施例中也可以不用连接M13通用引物。
表1.本实施例提供的用于构建枸杞DNA指纹图谱的第1-15引物对的碱基序列
表1中的引物命名SF1、SF3、SF5、SF12、SF13、SF14、SF15、SF20、SF30、SF51、SF61、SF63、SF68、SF92、SF107分别对应于第1引物对、第2引物对、第3引物对、第4引物对、第5引物对、第6引物对、第7引物对、第8引物对、第9引物对、第10引物对、第11引物对、第12引物对、第13引物对、第14引物对、第15引物对。
采用本实施例提供的第1-15引物对构建枸杞DNA指纹图谱的方法如下。
1.1枸杞DNA的提取
1.1.1利用CTAB法提取各枸杞品种的DNA，紫外分光光度计定量后，稀释到50ng/μl，4℃或-20℃保存备用或直接用于后续步骤。
具体步骤如下：
称取枸杞幼嫩叶片0.1g置于2mL离心管中，加液氮研磨至粉末；之后加入800μL预热(65℃)2％CTAB提取液，轻摇混匀；65℃水浴1h，每隔10min轻摇一次；冷却至室温后加入800μL氯仿异戊醇(V:V＝24:1)，混匀20min；1000rpm离心10min；吸取上清液移到1.5mL的离心管中，加入600μL预冷的异丙醇，混匀后置于4℃沉淀1h或-20℃30min；1000rpm离心10min；弃上清液，用70％乙醇洗涤3次，自然晾干；加入100μL ddH2O和1μLRNAase，37℃水浴30min；待充分溶解后，用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和纯度；稀释成工作液-20℃保存备用。
利用上述方法分别提取30份枸杞品种的DNA，它们分别是宁杞1号、宁杞5号、宁杞7号、宁农杞9号、蒙杞1号、宁夏黄果、宁杞菜1号、黑果、中国、北方、云南、蔓生、新疆、红枝、柱筒、截萼、CJ、HB、SC、AN、W30、HZ01、ZH08、W27、W15、ZH02、W13、W26、W37、白花，分别得到30份枸杞品种的DNA模板。
1.2 PCR扩增
采用本实施例提供的引物组合的第1-15引物对，分别对上述步骤得到的30份DNA模板进行单重PCR扩增。
1.2.1 PCR扩增体系15μL：其中10ng/μL DNA模板2μL，10×PCR Buffer 1.5μL，2.5μM的引物各1μL(即单个引物对的上、下游引物)，2.5mM的dNTP 1.2μL，50mM的Mg2+0.4μL，5μM的M13引物0.8μL，5U/μL的Taq HS酶0.1μL，加ddH20至15μL。
1.2.2 PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；72℃5min。
通过上述PCR扩增步骤，分别得到每个枸杞品种所对应的第1-15引物对的扩增产物。
1.3凝胶电泳
将上述每个枸杞品种所对应的第1-15引物对的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，即得到30分别枸杞品种的以电泳图谱表示的DNA指纹图谱。
采用本实施例提供的用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合可对30份枸杞品种构建DNA指纹图谱，所得到的以电泳图谱形式表示的DNA指纹图谱可作为枸杞种质资源鉴定或分类的参考依据。
实施例2
由于在实施例1中采用的是普通的琼脂糖凝胶电泳实现来分离PCR扩增产物的效果，其存在着分辨率低，对于相差碱基数的条带分离效果不明显，容易导致得到的以电泳图谱表示的DNA指纹图谱结果不准确的现象。因此，本实施例本着进一步完善和改进发明的目的，对用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合进行荧光基因的标记，使得本实施例所提供的用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合，所扩增得到的产物能够用于毛细管凝胶电泳，提高电泳图谱的分辨率，保证所得到的DNA指纹图谱更准确。
本实施例所提供的用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合，其包括包括第1-15引物对。第1-15引物对中每个引物对的上游引物的5’端标记有荧光基因，其中，第1-10引物对和第13引物对的上游引物的荧光基因是FAM；第11引物对、第12引物对、第14引物对以及第15引物对的上游引物的荧光基因是HEX。
本实施例提供的第1-15引物对中的各引物对的上游引物(F)和下游引物(R)的碱基序列同实施例1。
实施例3
本实施例所提供的用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合，其包括包括第1-15引物对。第1-15引物对中每个引物对的上游引物的5’端标记有荧光基因，其中，第1-10引物对和第13引物对的上游引物的荧光基因是TAMRA；第11引物对、第12引物对、第14引物对以及第15引物对的上游引物的荧光基因是HEX。
本实施例提供的第1-15引物对中的各引物对的上游引物(F)和下游引物(R)的碱基序列同实施例1。
实施例4
本实施例所提供的用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合，其包括包括第1-15引物对。第1-15引物对中每个引物对的下游引物的5’端标记有荧光基因，其中，第1-10引物对和第13引物对的下游引物的荧光基因是TAMRA；第11引物对、第12引物对、第14引物对以及第15引物对的下游引物的荧光基因是ROX。
本实施例提供的第1-15引物对中的各引物对的上游引物(F)和下游引物(R)的碱基序列同实施例1。
实施例5
本实施例所提供的用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合，其包括包括第1-15引物对。第1-15引物对中每个引物对的下游引物的5’端标记有荧光基因FAM。
本实施例提供的第1-15引物对中的各引物对的上游引物(F)和下游引物(R)的碱基序列同实施例1。
实施例6
本实施例所提供的用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合，其包括包括第1-15引物对。第1-15引物对中每个引物对的上游引物的5’端标记有荧光基因HEX。
本实施例提供的第1-15引物对中的各引物对的上游引物(F)和下游引物(R)的碱基序列同实施例1。
实施例7
本实施例提供了构建枸杞DNA指纹图谱的方法，其包括如下步骤。
7.1分别提取30份枸杞种质DNA，操作步骤参考实施例1中的步骤1。分别得到30份枸杞品种(分别是宁杞1号、宁杞5号、宁杞7号、宁农杞9号、蒙杞1号、宁夏黄果、宁杞菜1号、黑果、中国、北方、云南、蔓生、新疆、红枝、柱筒、截萼、CJ、HB、SC、AN、W30、HZ01、ZH08、W27、W15、ZH02、W13、W26、W37、白花)的DNA模板。
7.2 PCR扩增
采用实施例2提供的引物组合的1-15引物对，分别对上述步骤得到的30份DNA模板进行单重PCR扩增。
7.2.1 PCR扩增体系15μL：其中10ng/μL DNA模板2μL，10×PCR Buffer 1.5μL，2.5μM的引物各1μL(即单个引物对的上、下游引物)，2.5mM的dNTP 1.2μL，50mM的Mg2+0.4μL，5μM的M13引物0.8μL，5U/μL的Taq HS酶0.1μL，加ddH20至15μL。
7.2.2 PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；72℃5min。
通过上述PCR扩增步骤，分别得到每个枸杞品种所对应的第1-15引物对的扩增产物。
7.3毛细管凝胶电泳
在96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺的混合液9μL(其中，分子量内标和甲酰胺的体积比为0.5：8.5)，单份PCR扩增产物1.0μL，95℃变性3min。按上述设置条件，对得到的每个枸杞品种所对应的第1-15引物对的扩增产物在ABI3730仪器上进行毛细管凝胶电泳，并进行荧光检测，检测得到的原始电泳图谱，部分电泳图谱如图1-44所示，其中：图1-图15为用第1-15引物对分别对宁杞1号的DNA进行PCR扩增后的产物进行的毛细管电泳图。图16-图44为第10引物(SF51引物)对29份枸杞种质(不包括宁杞1号)的DNA扩增后的毛细管电泳图。
通过软件对每个枸杞种质的电泳图谱进行分析，得到每个枸杞种质的对应第1-15引物对所扩增的扩增带型数，扩增带型数包括的信息有所扩增的条带数量以及相应条带的大小。
7.4编码处理
将扩增带型数进行编码处理，得到每一种枸杞种质的DNA的对应第1-15引物对的第1-15编号，按预设的顺序串联该第1-15编号形成字符串。
本实施例的编码处理方法具体为：将第1-15引物对中每对引物对对应的扩增带型数按照升序排列，并按顺序标号(也就是编号)，当序号数小于9时，用数字1-9顺序表示，当序号数大于9时，用英文字母A-Z顺序表示。没有出现扩增条带的以数字0表示。
本实施例将第1-15引物对对上述的30份枸杞种质所扩增得到的扩增带型数进行编码处理的结果如表2所示。
表2.第1-15引物对分别对30份枸杞种质扩增得到的扩增带型数的编码处理结果
7.5串联编号得到字符串
通过上述编码处理后根据每个枸杞种质的对应第1-15引物对的扩增带型数，结合表2中的编码处理结果，得到每个枸杞种质的对应第1-15引物对的扩增带型数的第1-15编号(其中，第1编号为第1引物对所扩增得到的扩增带型数的编号，第2编号为第2引物对所扩增得到的扩增带型数的编号，依次类推，第15编号为第15引物对所扩增得到的扩增带型数的编号)。
串联第1-15编号形成字符串，该字符串即为相应枸杞种质的以数字或字母表示的DNA指纹图谱。
本实施例中串联第1-15编号具体为：按第3编号、第5编号、第7编号、第11编号、第13编号、第8编号、第10编号、第14编号、第1编号、第15编号、第12编号、第4编号、第2编号、第9编号、第6编号的顺序进行串联形成字符串。
以宁杞1号为例对上述编号处理进行说明，宁杞1号的DNA用第3引物对进行扩增后的电泳条带大小为176(如图1所示)，根据表2中对应的编号可得到第3编号为1；用第5引物对进行扩增后的电泳条带大小为177，根据表2中对应的编号可得到第5编号为7；用第7引物对进行扩增后的电泳条带有两条，分别是177和180，根据表2中对应的编号可得到第7编号为5；以此类似，即可得到宁杞1号的第1-15编号，按上述的顺序按第3编号(1)、第5编号(7)、第7编号(5)、第11编(6)号、第13编号(9)、第8编号(A)、第10编号(4)、第14编号(A)、第1编号(C)、第15编号(B)、第12编号(9)、第4编号(G)、第2编号(F)、第9编号(4)、第6编号(H)的顺序进行串联形成字符串17569A4ACB9GF4H(也可称为分子身份证编号)，以表示的DNA指纹图谱。
7.6根据步骤6.5的串联编号的方法，分别得到30份枸杞种质的以数字或字母即字符串表示的DNA指纹图谱，结果如表3所示。
表3.本实施得到的30份枸杞种质的以字符串表示的DNA指纹图谱
序号 枸杞种质名称 分子身份证编号(即字符串)
1 宁杞1号 17569A4ACB9GF4H
2 宁杞5号 26339748AAECEAD
3 宁杞7号 26339948BA8CEAE
4 宁农杞9号 1637A74BABDI94I
5 蒙杞1号 1637A759ABAF86D
6 宁夏黄果 1326227BBD37GKL
7 宁杞菜1号 1343A564B6FA338
8 黑果 32571A40074GGII
9 中国 14426713842F54B
10 北方 3383956534H9477
11 云南 3258484515HEBE0
12 蔓生 428434A31673KF2
13 新疆 2639852AB0CDAF
14 红枝 5546871674CECC4
15 柱筒 16549858ABBCHAC
16 截萼 16339848D9ECEAD
17 CJ 618173236818813
18 HB 138395335499185
19 SC 1344951659FFAA6
20 AN 128156332CIH8G1
21 W30 135397829956D5M
22 HZ01 53639777BA64E9K
23 ZH08 13138071BE418HJ
24 W27 267397489ADJI5G
25 W15 16339791995BDJM
26 ZH02 73638271B542KDA
27 W13 1385976342H9285
28 W26 564391B793656B9
29 W37 16339791995D7JM
30 白花 26349848A9BG72D
通过本实施例提供的构建枸杞DNA指纹图谱的方法得到30份枸杞种质的DNA指纹图谱也可称为SSR指纹。该DNA指纹图谱结果准确可靠，可作为枸杞种质资源鉴定的重要依据和参考，或者用于枸杞种质资源鉴定、枸杞加工产品的鉴定等领域中。
综上，本实施例体用构建枸杞DNA指纹图谱的方法，利用实施例2的引物组合，构建出了30份枸杞种质的以字符串表示的DNA指纹图谱，所得到的DNA指纹图谱能够直观正确地反应出30份枸杞种质的DNA指纹图谱信息，该DNA指纹图谱同样可作为枸杞种质资源鉴定或分类的参考依据，或者用于枸杞苗或枸杞加工产品的鉴定中。
实施例8
本实施例提供了构建枸杞DNA指纹图谱的方法，其步骤基本同实施例6，不同之处在于，本实施例提供的构建枸杞DNA指纹图谱的方法还包括：在得到以字符串表示的DNA指纹图谱后，利用二维码技术将字符串形成二维码图形，如图45所示，其为宁杞1号的以二维码图形表示的DNA指纹图谱。这样，通过以二维码图形表示的DNA指纹图谱，使得所构建的DNA指纹图谱不仅能正确反应30份枸杞种质的DNA指纹图谱信息，还能在枸杞的市场流通、栽培管理等领域得到进一步的推广利用，并且还可以应用于可追溯体系建设和管理。
综上，本发明首次基于枸杞基因测序结果基础上开发筛选得到具有多态性的核心骨干SSR引物，即可用于构建枸杞DNA指纹图谱的第1-15引物对。且进一步地利用SSR分子标记结合毛细管电泳技术构建出了以字符串或二维码图形表示的直观化的枸杞DNA指纹图谱，使得采用发明提供的引物组合或构建枸杞DNA指纹图谱方法在构建的过程具有分辨率高、灵敏度高、数据分析便捷等特点，克服了传统琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率低、灵敏度低、数据分析困难等缺点。也为DNA指纹图谱在枸杞上的应用研究提供更多的理论支持，同时本发明得到枸杞DNA指纹图谱也为对枸杞种质资源或枸杞加工产品的鉴定、分类、流通以及管理等领域提供便捷可靠的参考依据。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所
<120> 一种用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合以及应用和方法
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgtaaaacga cggccagtga cacgaaattt aagaaagtag a 41
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cccctaaagt actaaaagga ca 22
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgtaaaacga cggccagtaa ccccatttcg agttttgag 39
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agcacaaaac tttctgattc ttg 23
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgtaaaacga cggccagttc cttattgatt atgctttgga a 41
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gttccatttt acttggccct ta 22
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgtaaaacga cggccagtgt gtgtatatat tgatgcaact ct 42
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
acattatata gtgggatgga gg 22
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgtaaaacga cggccagtca gggacagaaa caaactagga 40
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cattcatcct tccacaaatc ttta 24
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgtaaaacga cggccagttt cagttccctc tcagcca 37
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ttgttcttgc ataagaaatt gg 22
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tgtaaaacga cggccagtca aagaacaaaa gggctagga 39
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tttgttgttg tatcagatcc ca 22
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tgtaaaacga cggccagttg tggaattaca ctgggtatgt 40
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gagaaccgtt tcattgatat ac 22
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tgtaaaacga cggccagtta tttcacgttg ctccagaaag 40
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
atcgccccct gaattaaag 19
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tgtaaaacga cggccagtca gcgaagaatt agaaaaagac 40
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gcaagtgcta atataacctc cat 23
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tgtaaaacga cggccagttt ggaaccaatg ctaatggaag 40
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gggacatcag ttggaaatta g 21
<210> 23
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tgtaaaacga cggccagttg aaaacaaaca aagaaaagc 39
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tcaaggggtt gttagattct 20
<210> 25
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tgtaaaacga cggccagttt ccaccatttt gctactcaa 39
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
aagagatttt tagccgattg a 21
<210> 27
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tgtaaaacga cggccagtcg ggtttctaat ggtacctcta 40
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
tgactctaca aatttgaaaa acaa 24
<210> 29
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
tgtaaaacga cggccagtaa ggaaataagc aaacgcatg 39
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
ggacatgaca tcatcagtca a 21

Claims (10)

1.一种用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合，其特征在于，其包括第1-15引物对，所述第1-15引物对的碱基序列分别如SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6、SEQID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ ID NO.15-16、SEQID NO.17-18、SEQ ID NO.19-20、SEQ ID NO.21-22、SEQ ID NO.23-24、SEQ ID NO.25-26、SEQ ID NO.27-28、SEQ ID NO.29-30所示。
2.根据权利要求1所述的用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合，其特征在于，所述第1-15引物对中每个引物对的上游引物的5’端标记有荧光基因；
或者所述第1-15引物对中每个引物对的下游引物的5’端标记有所述荧光基因。
3.根据权利要求2所述的用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合，其特征在于，所述荧光基因为选自FAM、TAMRA、HEX和ROX中的任意一种。
4.权利要求1-3中任一项所述的用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合在构建枸杞DNA指纹图谱中的应用。
5.一种构建枸杞DNA指纹图谱的方法，其特征在于，其包括：用权利要求1-3中任一项所述的用于构建枸杞DNA指纹图谱的引物组合的第1-15引物对分别对多个枸杞种质的DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；
将所述扩增产物分别进行电泳，得到扩增带型数；
将所述扩增带型数进行编码处理，得到每一种所述枸杞种质的DNA对应所述第1-15引物对的第1-15编号，串联所述第1-15编号形成字符串。
6.根据权利要求5所述的构建枸杞DNA指纹图谱的方法，其特征在于，所述编码处理是指：将所述第1-15引物对中每对引物对对应的所述扩增带型数按照升序排列，并按顺序标号，当序号数小于9时，用数字1-9顺序表示，当序号数大于9时，用英文字母A-Z顺序表示。
7.根据权利要求5所述的构建枸杞DNA指纹图谱的方法，其特征在于，串联所述第1-15编号形成所述字符串是指：按第3编号、第5编号、第7编号、第11编号、第13编号、第8编号、第10编号、第14编号、第1编号、第15编号、第12编号、第4编号、第2编号、第9编号、第6编号的顺序进行串联形成所述字符串。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的构建枸杞DNA指纹图谱的方法，其特征在于，所述构建枸杞DNA指纹图谱的方法还包括：利用二维码技术将所述字符串形成二维码图形。
9.根据权利要求5-7中任一项所述的构建枸杞DNA指纹图谱的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；72℃5min。
10.由权利要求5-9中任一项所述的构建枸杞DNA指纹图谱的方法所得到的枸杞DNA指纹图谱在鉴定枸杞种质资源中的应用。
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