CN114854733B - 一种用于构建凡纳滨对虾dna指纹图谱的微卫星标记引物组合以及应用和方法 - Google Patents

一种用于构建凡纳滨对虾dna指纹图谱的微卫星标记引物组合以及应用和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于构建凡纳滨对虾DNA指纹图谱的微卫星标记引物组合以及应用和方法。本发明基于凡纳滨对虾基因组数据开发筛选出具有多态性的13个微卫星标记引物对，该13个微卫星标记引物对可用于构建凡纳滨对虾DNA指纹图谱，并结合毛细管电泳技术构建得到的凡纳滨对虾DNA指纹图谱，具有电泳分辨率高、灵敏度高、数据分析处理便捷等特点，为DNA指纹图谱的在凡纳滨对虾上的进一步应用研究提供了坚实的理论支持。

Description

一种用于构建凡纳滨对虾DNA指纹图谱的微卫星标记引物组 合以及应用和方法
技术领域
本发明属于DNA指纹图谱技术领域，具体涉及一种用于构建凡纳滨对虾DNA指纹图谱的微卫星标记引物组合以及应用和方法。
背景技术
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)，俗称南美白对虾，是世界养殖量最大的对虾品种。其中，2020年我国凡纳滨对虾养殖年产量超过180万吨，占对虾养殖产量90％以上，已然成为我国水产养殖支柱产业之一。近年来，随着凡纳滨对虾育种技术方法不断进步，越来越多凡纳滨对虾品种不断涌现出来。然而，目前并没有对这些凡纳滨对虾种质资源进行有效的鉴定和分类。因此开发有效的鉴定方法，对凡纳滨对虾种质资源的研究、品种创新尤为重要。
DNA指纹图谱是指DNA样品用特定分子标记技术处理显示出具有特定DNA片段的总称。随着生物技术的进步与发展，DNA指纹图谱技术在品种资源多样性和品种鉴定研究中得到广泛的应用。其中，用于构建DNA指纹图谱的微卫星分子标记不仅具有数量丰富、广泛分布于基因组中，而且具有可重复性高、操作简单、省时省力等优点。
目前，DNA指纹图谱技术在凡纳滨对虾上的应用并不多，以微卫星分子标记来构建凡纳滨对虾DNA指纹图谱的更是未见报道。
发明内容
本发明旨在提供一种用于构建凡纳滨对虾DNA指纹图谱的微卫星标记引物组合及其应用，即筛选获得稳定扩增且具有多态性的微卫星分子标记，并应用于凡纳滨对虾DNA指纹图谱构建。
本发明首先提供一种用于构建凡纳滨对虾DNA指纹图谱的微卫星标记引物组合，所述的引物组合包括第1-13引物对，所述第1-13引物对的碱基序列分别如SEQ ID NO.1-26所示。
所述第1-13引物对中每个引物对的上游引物的5'端标记有荧光基团，所述荧光基团为选自FAM、TAMRA和HEX中的任意一种。
本发明的另一目的在于提供上述微卫星标记引物组合在构建凡纳滨对虾DNA指纹图谱中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种构建凡纳滨对虾DNA指纹图谱的方法，该方法所构建出的凡纳滨对虾DNA指纹图谱能够准确反应出凡纳滨对虾DNA指纹图谱的信息。包括以下步骤：用上述的微卫星标记引物组合的第1-13引物对分别对多个凡纳滨对虾群体的DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；将所述扩增产物分别进行电泳，得到扩增带型数；将所述扩增带型数进行编码处理，得到每一种所述凡纳滨对虾群体的DNA对应所述第1-13引物对的第1-13带型编号，串联所述第1-13带型编号形成字符串。
所述编码处理是指：统计所述第1-13引物对中每对引物对对应的所述扩增带型数，以“1”和“0”分别代表某个等位基因位点扩增出的DNA条带的有和无，按照从上到下即由小片段向大片段的读带方向，将其转换为由“1”和“0”组成的带型编号。
串联所述第1-13带型编号形成所述字符串是指：按固定顺序进行串联形成所述字符串。
所述PCR扩增的程序为：96℃预变性3min；96℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃再延伸10min。
本发明的另一目的在于提供一种凡纳滨对虾DNA指纹图谱，是由上述凡纳滨对虾DNA指纹图谱构建方法构建得到。
本发明的另一目的在于提供上述的凡纳滨对虾DNA指纹图谱在鉴定凡纳滨对虾种质资源中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种用于凡纳滨对虾种质资源鉴定的试剂盒，该试剂盒含有权利上述的微卫星标记引物组合。
本发明的有益效果为：
本发明通过微卫星分子标记技术对凡纳滨对虾基因组序列进行分析筛选，得到可用于构建凡纳滨对虾DNA指纹图谱的微卫星标记引物组合，该引物组合包括如SEQ IDNO.1-26所示的13个引物对，该13个引物对可用于构建凡纳滨对虾品种或种质的DNA指纹图谱，所得到的凡纳滨对虾DNA指纹图谱可以是以电泳图谱表示的或者是以字符串表示的，其反应的指纹信息准确可靠，该凡纳滨对虾DNA指纹图谱作为凡纳滨对虾种质资源鉴定的参考依据，为凡纳滨对虾种质种质资源的研究、品种创新提供支持。同时也为DNA指纹图谱的在凡纳滨对虾上的进一步应用研究提供了坚实的理论支持。
附图说明
图1是本发明用第1引物对Lv004对凡纳滨对虾1号样品扩增后的毛细管电泳图谱；带型编号为0100。
图2是本发明用第2引物对Lv005对凡纳滨对虾1号样品扩增后的毛细管电泳图谱；带型编号为100100。
图3是本发明用第3引物对Lv035对凡纳滨对虾1号样品扩增后的毛细管电泳图谱；带型编号为0011。
图4是本发明用第4引物对Lv058对凡纳滨对虾1号样品扩增后的毛细管电泳图谱；带型编号为001100。
图5是本发明用第5引物对Lv082对凡纳滨对虾1号样品扩增后的毛细管电泳图谱；带型编号为000100。
图6是本发明用第6引物对Lv093对凡纳滨对虾1号样品扩增后的毛细管电泳图谱；带型编号为00101。
图7是本发明用第7引物对Lv097对凡纳滨对虾1号样品扩增后的毛细管电泳图谱；带型编号为1010000000。
图8是本发明用第8引物对Lv099对凡纳滨对虾1号样品扩增后的毛细管电泳图谱；带型编号为01000。
图9是本发明用第9引物对Lv130对凡纳滨对虾1号样品扩增后的毛细管电泳图谱；带型编号为00010100000。
图10是本发明用第10引物对Lv131对凡纳滨对虾1号样品扩增后的毛细管电泳图谱；带型编号为001。
图11是本发明用第11引物对Lv165对凡纳滨对虾1号样品扩增后的毛细管电泳图谱；带型编号为0100。
图12是本发明用第12引物对Lv177对凡纳滨对虾1号样品扩增后的毛细管电泳图谱；带型编号为0000010000。
图13是本发明用第13引物对Lv191对凡纳滨对虾1号样品扩增后的毛细管电泳图谱；带型编号为0000100。
图14是45份凡纳滨对虾样品的DNA指纹图谱。(从左到右依次为Lv004、Lv005、Lv035、Lv058、Lv082、Lv093、Lv097、Lv099、Lv130、Lv131、Lv165、Lv177、Lv191)
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
1、根据凡纳滨对虾的基因组筛选微卫星位点，根据微卫星位点设计引物，并检测引物的多态性，共获得具有多态性的引物13对，各引物对的上游引物和下游引物的碱基序列如下表1所示。13个微卫星位点分别为Lv004、Lv005、Lv035、Lv058、Lv082、Lv093、Lv097、Lv099、Lv130、Lv131、Lv165、Lv177和Lv191。
表1.本实施例提供的用于构建凡纳滨对虾DNA指纹图谱的第1-13引物对的碱基序列
Figure BDA0003590539730000051
Figure BDA0003590539730000061
2、实验所用的45份凡纳滨对虾DNA样品提取按照天根海洋动物组织基因组提取试剂盒(TIANGEN，天根生化科技有限公司)方法进行。使用表1所示的第1-13引物对分别对45份凡纳滨对虾DNA样本进行PCR扩增。
PCR扩增体系15μL：其中DNA模板1μL(50-200ng)，2×Taq PCR Master Mix 7.5μL，2.5μM的引物各1μL(即单个引物对的上、下游引物)，加ddH2O至15μL。
PCR扩增的程序为：96℃预变性3min；96℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃再延伸10min。
通过上述PCR扩增步骤，分别得到每个凡纳滨对虾样品所对应的第1-13引物对的扩增产物。每个凡纳滨对虾样品所对应的第1-13引物对的扩增产物在ABI3730XL仪器上进行毛细管凝胶电泳，并进行荧光检测上机检测。
使用GeneMarker软件，导入基因分析仪上的原始结果文件，经分析得到电泳图谱，部分电泳图谱如图1-13所示，分别为第1-13引物对对1号凡纳滨对虾样品DNA进行PCR扩增后的产物进行的毛细管电泳图。
通过软件对每个凡纳滨对虾样品的电泳图谱进行分析，得到每个凡纳滨对虾样品对应的第1-13引物对所扩增的带型数，扩增带型数包括的信息有所扩增的条带数量以及相应条带的大小。
将所述扩增带型数进行编码处理，得到每一种所述凡纳滨对虾样品的DNA对应所述第1-13引物对的第1-13带型编号，串联所述第1-13带型编号形成字符串。
本实施例的编码处理为：统计所述第1-13引物对中每对引物对对应的所述扩增带型数，以“1”和“0”分别代表某个等位基因位点扩增出的DNA条带的有和无，按照从上到下即由小片段向大片段的读带方向，将其转换为由“1”和“0”组成的带型编号。
通过上述编码处理后，得到每个凡纳滨对虾样品的对应第1-13引物对的扩增带型编号，按固定顺序串联形成所述字符串。
以凡纳滨对虾1号样品为例对上述编号处理进行说明：凡纳滨对虾1号样品的DNA用第1引物对进行扩增后的电泳条带大小为187(如图1所示)，第1引物对对所有凡纳滨对虾样品一共可以扩增出4种不同大小的条带，分别为184、187、190和193，因此对应的第1带型编号为0100；用第2引物对进行扩增后的电泳条带大小为217和226(如图2所示)，第2引物对对所有凡纳滨对虾样品一共可以扩增出6种不同大小的条带，分别为217、220、223、226、239和232，因此对应的第2带型编号为100100；以此类似，即可得到凡纳滨对虾1号样品的第1-13编号，按顺序进行串联形成字符串01001001000011000110000001000010110100000000100000010100000001010000000100000000100，以表示的DNA指纹图谱。
根据上述步骤的串联编号的方法，分别得到45份凡纳滨对虾样品以字符串表示的DNA指纹图谱，结果如表2所示。
表2. 45份凡纳滨对虾样品以字符串表示的DNA指纹图谱
Figure BDA0003590539730000081
Figure BDA0003590539730000091
将45份凡纳滨对虾样品的字符串转换成01矩阵形式的指纹图谱，可直观展示每个样品的差异(如图14)。
通过本实施例提供的构建凡纳滨对虾DNA指纹图谱的方法得到45份凡纳滨对虾样品的DNA指纹图谱。该DNA指纹图谱结果准确可靠，可作为凡纳滨对虾种质资源鉴定的参考依据，为凡纳滨对虾种质种质资源的研究、品种创新提供支持。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东省农业科学院动物科学研究所
<120> 一种用于构建凡纳滨对虾DNA指纹图谱的微卫星标记引物组合以及应用和方法
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaagtagtgg tccgactcgc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttgacaccc tcagcaggat 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggtgcacaa gtgtgctgac 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catttgggac aagcgtgg 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccaaccaaat atcgcagatg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcacaacacc actacgacca 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tttactcctg cgtcctagcc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tatgcaacac caggcaacat 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcctatattg gctgtttgcc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcataaacgc cgtcacattg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gagggtaggt aagccacggt 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaacgtgact ccagtctgcc 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgagcaacat cttgttatcg g 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acaccatcag tgggaggaag 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cacggattgc agactgagaa 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
attcttgagg cgattcatgc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaacgttgat aaagcacgca 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gttcgcaaat aacgtcggat 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cactgtctgg accgctaaca 20
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tgttcgggaa cgttctagat att 23
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
taactctgca tttgttgccg 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggaaatgctc ttcaactgcc 20
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gcactgtaag caacaaaagc c 21
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tagtggcgct cccttagtgt 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agagaagaag cgcgagtttg 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ctcgtatgca gggatttcgt 20

Claims (9)

1.一种用于构建凡纳滨对虾DNA指纹图谱的微卫星标记引物组合，其特征在于，所述引物组合包括第1-13引物对，所述第1-13引物对的碱基序列分别如SEQ ID NO.1-26所示。
2.根据权利要求1所述的用于构建凡纳滨对虾DNA指纹图谱的微卫星标记引物组合，其特征在于，所述第1-13引物对中每个引物对的上游引物的5'端标记有荧光基团。
3.根据权利要求2所述的用于构建凡纳滨对虾DNA指纹图谱的微卫星标记引物组合，其特征在于，所述荧光基团为选自FAM、TAMRA和HEX中的任意一种。
4.权利要求1-3中任一项所述的用于构建凡纳滨对虾DNA指纹图谱的微卫星标记引物组合在构建凡纳滨对虾DNA指纹图谱中的应用。
5.一种构建凡纳滨对虾DNA指纹图谱的方法，其特征在于，包括以下步骤：用权利要求1-3中任一项所述的微卫星标记引物组合的第1-13引物对分别对多个凡纳滨对虾群体的DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；将所述扩增产物分别进行电泳，得到扩增带型数；将所述扩增带型数进行编码处理，得到每一种所述凡纳滨对虾群体的DNA对应所述第1-13引物对的第1-13带型编号，串联所述第1-13带型编号形成字符串。
6.根据权利要求5所述的构建凡纳滨对虾DNA指纹图谱的方法，其特征在于，所述编码处理是指：统计所述第1-13引物对中每对引物对对应的所述扩增带型数，以“1”和“0”分别代表某个等位基因位点扩增出的DNA条带的有和无，按照从上到下即由小片段向大片段的读带方向，将其转换为由“1”和“0”组成的带型编号。
7. 根据权利要求5所述的构建凡纳滨对虾DNA指纹图谱的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：96℃预变性3 min；96℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃再延伸10 min。
8.由权利要求5-7任一项所述的凡纳滨对虾DNA指纹图谱构建方法构建得到的凡纳滨对虾DNA指纹图谱在鉴定凡纳滨对虾种质资源中的应用。
9.一种用于凡纳滨对虾种质资源鉴定的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的微卫星标记引物组合。
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