CN108531619B - 用于中华鲟与达氏鲟种间鉴定的微卫星引物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于水产养殖领域中的水产动物种质鉴定领域，公开了用于中华鲟与达氏鲟种间鉴定的微卫星引物及应用，本发明成功筛选并合成1对荧光标记微卫星引物，该引物可以用于建立中华鲟和达氏鲟种间鉴定技术。将引物用于PCR扩增后，测定等位基因，进行中华鲟和达氏鲟的种间鉴定分析。本发明所述鉴别方法操作简单、快捷、费用低廉，具有高效、经济、简便易行的特点，可以在中华鲟和达氏鲟种间鉴定、种质鉴定和遗传管理中推广应用，并可对人工增殖放流效果进行评估。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖领域中的水产动物种质鉴定领域，具体涉及用于中华鲟与达氏鲟种间鉴定的微卫星引物及应用。
技术背景
中华鲟(Acipensersinensis)和达氏鲟(A.dabryanus)均为我国一级重点保护水生野生动物，隶属于鲟形目鱼类，鲟科，鲟属，是分布于长江流域的大型鱼类。两种鱼类的生态位存在一定的重叠。由于人类活动的干扰，如梯级水电站的修建、过渡捕捞、栖息地破坏等，已经造成两种鱼类处于濒临灭绝的危险。目前，针对这两种鱼类已经采取了一系列的保护措施，如建立自然保护区、实施迁地保护、人工繁育、增殖放流等。在人工繁育、增殖放流、自然种群监测等过程中，迫切需要对两种鱼类进行有效的鉴别。
地球上显存的26种鲟鱼中，中华鲟和达氏鲟亲缘关系最接近。进化上，学者认为达氏鲟是中华鲟的陆封种，二者遗传物质DNA存在高度的相似性。先前的研究发现，线粒体DNA的某些区域，如d-loop区域，COI基因，可对两种鲟鱼进行鉴定。然而，线粒体是母性遗传，并不能反应雄性亲本的遗传信息。最近，Li等(2015)发现3个核基因序列可对中华鲟和达氏鲟进行鉴定。然而，对该结果进行检验，存在不可靠性。专利申请人在前期的研究中发现了10个微卫星(simple sequence repeats，SSRs)位点组合，既可以对中华鲟进行亲子鉴定，也可以对中华鲟和达氏鲟进行种间鉴别，然而，该组合在实际操作过程中存在引物多、操作繁琐、容易误检的缺陷。因此，截止到目前，没有更为简便、有效的方法对两种鲟鱼进行快速鉴别。
发明内容
本发明的目的在于提供了用于中华鲟与达氏鲟种间鉴定的微卫星引物，该引物可以用于中华鲟和达氏鲟的种间的快速鉴定。
本发明的另一个目的在于提供了用于中华鲟与达氏鲟种间鉴定的微卫星引物的应用。包括用于该引物制备成用于中华鲟和达氏鲟种间鉴定的试剂盒，或利用该引物对中华鲟和达氏鲟进行种间鉴定，或利用该引物进行中华鲟和达氏鲟的种质鉴定和家系管理。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
用于中华鲟和达氏鲟种间鉴定的SSR引物，具体如下：
P3-141F:TGCTGGTTAGAGCTTGGAGC；
P3-141R:AGGCATTTGACCCATTTGTT。
以上所述引物的正向引物，可用FAM荧光染料或本领域常用的荧光染料进行标记。
用于中华鲟和达氏鲟种间鉴定的SSR荧光标记引物的应用，包括制备中华鲟和达氏鲟种间鉴定试剂盒，或利用该引物进行中华鲟和达氏鲟种间鉴定，或利用该引物进行中华鲟或达氏鲟的种质鉴定和家系管理。
本发明提供的SSR引物的应用方法包括：
提取待鉴定的中华鲟和达氏鲟样品DNA，使用P3-141F和P3-141R SSR引物进行扩增。扩增结果显示，达氏鲟为单态，只有一个等位基因，大小为157bp；中华鲟为多态，≥2个等位基因，等位基因的大小有157bp、160bp、163bp、166bp。
本发明提供的中华鲟和达氏鲟种间鉴定试剂盒，其试剂盒包含：1对SSR荧光标记引物、2×Taq PCR Master Mix和超纯水。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1)本发明提供的1对SSR分子标记引物，可用于亲缘关系最近的中华鲟和达氏鲟的种间鉴定，从而在人工繁殖、增殖放流、野外监测等过程中对两个物种进行种质鉴定，保证遗传物质的纯度。
2)本发明通过1对微卫星引物就可以实施中华鲟和达氏鲟的种间鉴定，可大大节约鉴定的时间和测序的成本。
3)鉴定结果易判断，达氏鲟为单态，中华鲟为多态。
附图说明
图1为达氏鲟1号个体的扩增结果示意图。
图2为达氏鲟2号个体的扩增结果示意图。
图3为达氏鲟3号个体的扩增结果示意图。
图4为达氏鲟4号个体的扩增结果示意图。
图5为达氏鲟5号个体的扩增结果示意图。
图6为达氏鲟6号个体的扩增结果示意图。
图7为中华鲟1号个体的扩增结果示意图。
图8为中华鲟2号个体的扩增结果示意图。
图9为中华鲟3号个体的扩增结果示意图。
图10为中华鲟4号个体的扩增结果示意图。
图11为中华鲟5号个体的扩增结果示意图。
图12为中华鲟6号个体的扩增结果示意图。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案。本发明所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
中华鲟和达氏鲟种间鉴定的SSR标记的筛选：
1)采用经典的高盐法提取6个中华鲟和6个达氏鲟DNA样本，稀释至100ng/ul，备用。
2)将通过primer premier 5.0软件设计332对微卫星引物，其中每对引物的正向引物(F引物)均加了通用M13接头序列(TGTAAAACGACGGCCAGT)。另外合成加TAMRA荧光基团的M13荧光接头引物。引物合成后，以步骤1)中的DNA为模板，利用三引物法进行PCR扩增，具体如下：
A.PCR反应体系：
| 试剂 | 体积(μl) |
| 2×Taq PCR Master Mix | 5 |
| 模板(基因组DNA) | 1 |
| 上游引物(浓度10μmol/μl) | 0.1 |
| 下游引物(浓度10μmol/μl) | 0.4 |
| 带荧光的M13引物(浓度10μmol/μl) | 0.4 |
| ddH<sub>2</sub>O | 3.1 |
| 总体积 | 10 |
B.PCR扩增程序：
每板PCR扩增产物进行琼脂糖电泳抽检，根据电泳结果进行浓度鉴定并做一定稀释后，将PCR产物使用DNA测序仪ABI 3730xl进行毛细管荧光电泳检测，检测各引物的多态性。将测序仪得出的原始数据，使用genemarker软件分析，得出峰图文件。最终筛选出的1对微卫星引物，序列为：P3-141F:TGCTGGTTAGAGCTTGGAGC；P3-141R:AGGCATTTGACCCATTTGTT；扩增结果显示，达氏鲟为单态，只有一个等位基因，大小为157bp(图1-图6)；中华鲟为多态，≥2个等位基因，等位基因的大小有157bp、160bp、163bp、166bp(图7-图12)。因此，可利用该引物进行中华鲟和达氏鲟种间鉴定或种质鉴定或家系管理。
实施例2：
中华鲟和达氏鲟种间鉴定的SSR荧光标记引物在中华鲟和达氏鲟种间鉴定中的应用，包括如下步骤：
1)按照常规方案提取20个中华鲟和20个达氏鲟的DNA；
2)引物合成后，以步骤1)中的DNA为模板，利用三引物法进行PCR扩增，具体如下：
A.PCR反应体系：
| 试剂 | 体积(μl) |
| 2×Taq PCR Master Mix | 5 |
| 模板(基因组DNA) | 1 |
| 上游引物(浓度10μmol/μl) | 0.1 |
| 下游引物(浓度10μmol/μl) | 0.4 |
| 带荧光的M13引物(浓度10μmol/μl) | 0.4 |
| ddH<sub>2</sub>O | 3.1 |
| 总体积 | 10 |
B.PCR扩增程序：
PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，根据电泳结果进行浓度鉴定并做一定稀释后，将PCR产物使用DNA测序仪ABI 3730xl进行毛细管荧光电泳检测，检测引物的多态性。将测序仪得出的原始数据，使用genemarker软件分析，得出峰图文件，统计等位基因的大小。结果显示，该位点在达氏鲟中均是单态的，大小为157bp；中华鲟为多态，≥2个等位基因，等位基因的大小有157bp、160bp、163bp、166bp(见表1)。
表1：中华鲟和达氏鲟种间鉴定结果
注：AD表示达氏鲟个体；AS表示中华鲟个体；※表示该位点存在。
实施例3：
含有中华鲟和达氏鲟种间鉴定的SSR荧光引物的试剂盒，包括如下组成：
| 试剂 | 体积(μl) |
| 2×Taq PCR Master Mix | 5 |
| 模板(基因组DNA) | 1 |
| 上游引物(浓度10μmol/μl) | 0.1 |
| 下游引物(浓度10μmol/μl) | 0.4 |
| 带荧光的M13引物(浓度10μmol/μl) | 0.4 |
| ddH<sub>2</sub>O | 3.1 |
| 总体积 | 10 |
按照上述剂量对试剂盒中的各组分分别进行包装组成中华鲟和达氏鲟种间鉴定试剂盒。
综上所述，本发明名所建立的中华鲟和达氏鲟种间鉴定技术和试剂盒能准确的用于亲缘关系最近的中华鲟和达氏鲟的种间鉴定，为中华鲟和达氏鲟种质鉴定提供技术支撑，从而合理的指导中华鲟和达氏鲟的增殖放流、人工繁殖和野外监测。
序列表
<110> 中国水产科学研究院长江水产研究所
<120> 用于中华鲟与达氏鲟种间鉴定的微卫星引物及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgctggttag agcttggagc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aggcatttga cccatttgtt 20
Claims (7)
1.用于中华鲟和达氏鲟种间鉴定的SSR引物：P3-141F:TGCTGGTTAGAGCTTGGAGC和P3-141R: AGGCATTTGACCCATTTGTT。
2.权利要求1所述的引物在中华鲟和达氏鲟种间鉴定中的应用。
3.权利要求1所述的引物在中华鲟种质鉴定中的应用。
4.权利要求1所述的引物在达氏鲟种质鉴定中的应用。
5.权利要求1所述的引物在中华鲟家系管理中的应用。
6.权利要求1所述的引物在达氏鲟家系管理中的应用。
7.权利要求1所述的引物在制备成中华鲟和达氏鲟种间鉴定试剂盒中的应用。
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