CN110923336A - 一种鉴定达氏鲟和中华鲟种质的引物、分子标记及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定达氏鲟和中华鲟种质的引物、分子标记及方法，所述的引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示，所述的分子标记为通过所述引物扩增获得的片段，利用本发明引物对基因组DNA进行扩增，对扩增产物进行测序，通过与达氏鲟和中华鲟线粒体DNA序列进行比对，即可鉴定出达氏鲟和中华鲟。本发明方法具有速度快、成本低、易掌握的特点。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种鉴定达氏鲟和中华鲟种质的引物、分子标记及方法。
背景技术
中华鲟(Acipenser sinensis)和达氏鲟(A.dabryanus)均为我国一级重点保护水生野生动物，隶属于鲟形目鱼类，鲟科，鲟属，是分布于长江流域的大型鱼类。中华鲟是一种大型溯河洄游性鱼类，是我国特有的古老珍稀鱼类，世界现存鱼类中最原始的种类之一。远在公元前1000多年的周代，我国就把中华鲟称为“王鲔鱼”。中华鲟属硬骨鱼类鲟形目，最早出现于距今2.3亿年前的早三叠世，一直延续至今，生活于我国长江流域，别处未见，真可谓“活化石”。达氏鲟是一种淡水定居性鱼类，常在江河中下层活动，喜栖息于流速较缓、富腐植质和底栖生物的沙质底或卵石碛坝的河湾或深沱中，生长速度较快，一般体长0.8—1.0米，体重5—10公斤，国家一级保护动物。
地球上显存的26种鲟鱼中，中华鲟和达氏鲟亲缘关系最接近。进化上，有学者认为达氏鲟是中华鲟的陆封种，二者遗传物质DNA存在高度的相似性。目前，达氏鲟和中华鲟的区分主要是从外形来鉴定。达氏鲟与中华鲟的区别是：侧骨板呈三角形、宽大于高，鳃耙呈三角形、鳃耙数多于29。野生鱼的侧骨板上下黑白分明，幼鲟皮肤粗糙，迁徙的幼鱼体色呈黑色，沿侧骨板有一条浅色的线，体色及尾部呈黑色是向顺游迁徙的幼鲟具有的典型特征；家养幼鱼皮肤较光滑，侧骨板以下存在黑色过渡区，在暗光环境下养殖半年以上的鱼，其过渡区黑色变淡，池塘养殖的亲鱼成熟时侧骨板以下颜色接近野生鱼。野生鲟驯养过程中，骨板数特别是侧骨板数会发生较大变化。达氏鲟为淡水定居性鱼类，除产卵期外，不进行远距离洄游。
现有技术仅适用于鉴定年龄较大的两种鲟鱼，很难从外观上区别个体较小的两种鱼。且现有技术从鳃耙数量及形态来鉴定种质，需要杀鱼解剖才能实现，不适用于鲟鱼这类极度濒危保护物种。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于鉴定达氏鲟和中华鲟种质的引物，从分子生物学上对达氏鲟和中华鲟进行区分和鉴定，并提供了利用该引物的鉴定方法，具有有速度快、成本低、易掌握的优点。
本发明具体通过以下技术方案实现：
一种用于鉴定达氏鲟和中华鲟种质的引物，包括：
上游引物D-F：GCCCTAGTAGCTTAGACATCAAAG；
下游引物D-R：GTGCGTGCCTGATACCTGC。
本发明还提供了一种用于鉴定达氏鲟的分子标记，所述的分子标记为以达氏鲟基因组DNA为模板，通过引物D-F和D-R扩增获得的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
同理，一种用于鉴定中华鲟的分子标记，所述的分子标记为以中华鲟基因组DNA为模板，通过引物D-F和D-R扩增获得的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的另一方面，提供了一种鉴定达氏鲟和中华鲟种质的方法，包括以下步骤：
1)样本基因组DNA的提取，采用CTAB法进行；
2)以提取的基因组DNA为模板，利用引物D-F和D-R进行PCR扩增；
3)对扩增产物进行测序，通过与达氏鲟和中华鲟线粒体DNA序列进行比对，即可鉴定出达氏鲟和中华鲟。
所述的PCR扩增反应体系为50μL，包括50ng基因组DNA，10×PCR缓冲液，Mg2+1.5mM，1U Taq酶，dNTPs 0.2mM，正反引物均为0.25μM。
所述的PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，32个循环；72℃延伸8min，最后4℃保存。
本发明的有益效果为：
本发明的检测方法具有速度快、成本低、易掌握等优点；本发明的引物能同时对达氏鲟及中华鲟进行扩增，采取分子生物学的方法进行鉴定，所得结果准确性高，且总共鉴定步骤不超过2天，快速精确且简单实用。所获得的mtDNA D-loop区序列不仅可以应用于鲟鱼种质资源的鉴定，还可应用于进化分析和遗传多样性检测与保护等多个领域。
附图说明
图1是D-loop引物对不同鲟鱼扩增产物的核酸电泳图谱；其中，1-2达氏鲟；3-4西伯利亚鲟；5-6俄罗斯鲟；7-8中华鲟；9-10施氏鲟。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种从分子形态上对达氏鲟和中华鲟进行区分和鉴定的技术方案，具体包括以下步骤：
1)达氏鲟与中华鲟基因组DNA提取
鲟鱼DNA的制备采用CTAB法进行，具体步骤如下：
将鳍条约30mg放入1.5mL离心管中；离心管中加入500μL的组织裂解液(Tris-HCl10mM，EDTA 100mM，SDS 0.6％，NaCl 400mM，10MNaOH调节pH＝7.5)，用干净的剪刀将组织剪碎，离心管中加入1μl 20mg/mL蛋白酶K；55℃水浴3h，每隔半个小时轻轻颠倒混匀；向离心管中加入120μL饱和NaCl，混匀，冰上放置5～10min；4℃，12000r/min离心10min，并转移上清液(约500μL)到另一干净1.5mL离心管中；加入等体积的异丙醇，轻摇，放置5min；4℃，12000r/min离心10min，弃上清液；加入1mL 70％预冷的乙醇洗涤DNA沉淀一次，自然晾干后以适量双蒸水溶液溶解DNA样品；取1uL左右的样品进行电泳检测DNA质量，-20℃备用。
2)引物设计
在达氏鲟线粒体DNA D-loop控制区上下游设计引物，其上游引物D-F有24个碱基：5’-GCCCTAGTAGCTTAGACATCAAAG-3’，下游引物D-R有19个碱基：5’-GTGCGTGCCTGATACCTGC-3’。
3)在引物的作用下进行PCR反应
PCR反体系为50μL，包括50ng基因组DNA，10×PCR缓冲液，Mg2+(1.5mM)，1U Taq酶，dNTPs 0.2mM，正反引物均为0.25μM。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，32个循环；72℃延伸8min，最后4℃保存。
扩增产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测其大小、纯度及亮度。
4)测序
采用PCR扩增产物直接测序，采用Omega公司的E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit进行割胶纯化后测序。
回收产物送委托公司进行双向直接测序，测序引物为扩增引物D-F(10μM)和D-R(10μM)，序列分析仪为ABI 3730型全自动DNA测序仪。将测序得到的序列用VectorNTI软件的Assemble程序拼接，拼接序列与GenBank中线粒体DNA序列进行比对，剪掉引物及多余的序列。
5)结果分析
上述引物能同时扩增达氏鲟和中华鲟的线粒体DNA D-loop区域，通过对不同个体的测序结果比对分析，去掉引物及部分端部序列，经同源重排后的长度为847-848bp。通过NCBI blast数据库进行比对，能精确鉴定出达氏鲟和中华鲟两个物种的不同D-loop序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。
下面结合具体的实验案例对本发明技术方案进行进一步的解释说明。
实施例
选取达氏鲟和中华鲟，与同属的西伯利亚鲟、俄罗斯鲟和施氏鲟各2尾鱼，利用权利发明的分子标记及引物，进行了种质鉴定。具体方法如下:
1)基因组提取
取几种鱼的鳍条约30mg，利用CTAB法进行基因组提取，具体步骤如下参照实施方式1)。
2)引物设计、PCR反应及测序流程参照上述过程。
3)结果分析
上述引物能同时扩增达氏鲟、中华鲟、西伯利亚鲟，俄罗斯鲟和施氏鲟的线粒体DNAD-loop区域，扩增片段单一(图1)。测序结果经过NCBI数据库blast比对后，均鉴定为相应的物种。所以，本发明的引物能准确鉴定出鲟鱼属的不同种类鱼种，能广泛应用于鲟鱼的种质鉴定。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 四川省农业科学院水产研究所（四川省水产研究所）
<120> 一种鉴定达氏鲟和中华鲟种质的引物、分子标记及方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 848
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gacatgctat gtttaatcca cattaatttc tagtcaccat accataatgc tcgcaagtac 60
attaaattgt tcaagtacat aagacatgct atgtttaatc cacattaatt tctagtcacc 120
atatttacag taagaaccca gcataaaaac atatcaagaa cacaagatta atgagatgaa 180
ggacaataac tgtgatagac ttaaaactga actattactg gcatctggct tctatctcag 240
gtccattaac agctagattc cccataactg aattatgtct ggcatatggt tgatgttaaa 300
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gtttattgtc gacaaacccc ctaccccctt atgtcggaca ggccctatat ttcttgccaa 600
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aatatatagc tagcgtagct taactaaagc ataacactga agatgttaag atgagcctta 780
ggcagctccg caggcacaaa ggcttggtcc tggccttact atcaatttta acccaattta 840
cacatgca 848
<210> 2
<211> 847
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacatgctat gtttaatcca cattaatttc tagccaccat accataatgt tcgcaggtac 60
attagattgc tcgagtacat aagacatgcc atgtttaatc cacattaatt tctagccacc 120
aataactcac agtaagaacc cagcatagga atatgtcaag aacacaagat taatgagatg 180
aaggacagta cctgtaaaaa acctaaaatt gaactattac tggcatttgg cttctatctc 240
aggcccatta atagttaaac tccccataac tgaactatgt ctggcatatg attgatgtta 300
aaaatactgt aaaatccatg accccacatg ccaagaatct tgtcaacatt tggcactttt 360
aatctgggtt tccattcact gacatgtaga actccttcag aaaagaacaa caaggtagaa 420
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cacacatgag agttttacaa gacctgattt tgcctcccca catgaacttc gaggtgcggg 540
cattttgtcg acaaaccccc taccccctta tgtcggacag gccctatatt tcttgccaaa 600
ccccaaaagc aggactgact tgtcatcgac ataccttgat cacccacaca tgcctagtta 660
tgcgggtact tgcttactgt atttgtatgt atatacatta ttacacaatc acacaaaata 720
atatatagct agcgtagctt aactaaagca taacactgaa gatgttaaga tgagccttag 780
acagctccgc aggcacaaag gcttggtcct ggccttacta tcaattttaa cccaatttac 840
acatgca 847
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccctagtag cttagacatc aaag 24
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgcgtgcct gatacctgc 19
Claims (8)
1.一种用于鉴定达氏鲟和中华鲟种质的引物，其特征在于，包括：
上游引物D-F：GCCCTAGTAGCTTAGACATCAAAG；
下游引物D-R：GTGCGTGCCTGATACCTGC。
2.一种用于鉴定达氏鲟的分子标记，其特征在于，所述的分子标记为以达氏鲟基因组DNA为模板，通过引物D-F和D-R扩增获得的片段。
3.根据权利要求2所述的分子标记，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.一种用于鉴定中华鲟的分子标记，其特征在于，所述的分子标记为以中华鲟基因组DNA为模板，通过引物D-F和D-R扩增获得的片段。
5.根据权利要求4所述的分子标记，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.一种鉴定达氏鲟和中华鲟种质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)样本基因组DNA的提取，采用CTAB法进行；
2)以提取的基因组DNA为模板，利用引物D-F和D-R进行PCR扩增；
3)对扩增产物进行测序，通过与达氏鲟和中华鲟线粒体DNA序列进行比对，即可鉴定出达氏鲟和中华鲟。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应体系为50μL，包括50ng基因组DNA，10×PCR缓冲液，Mg2+1.5mM，1U Taq酶，dNTPs 0.2mM，正反引物均为0.25μM。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，32个循环；72℃延伸8min，最后4℃保存。
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-
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