CN115927576A - 一种利用pcr产物条带数量差异鉴定达氏鲟性别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用PCR产物条带数量差异鉴定达氏鲟性别方法，公开了一段达氏鲟基因组序列，利用该序列可以进行达氏鲟的雌雄鉴定。本发明还公开了在达氏鲟雌雄基因组DNA均可扩增出的阳性参考DNA片段。引物为提供的序列设计而成，利用引物对待测达氏鲟DNA进行PCR扩增，当扩增结果的产物在琼脂糖凝胶上显示的结果为3个条带时，则待测达氏鲟为雌性，当扩增结果的产物在琼脂糖凝胶上显示的结果为2个条带时，则待测达氏鲟为雄性。或者当扩增结果片段出现1402bp条带时，则待测达氏鲟为雌性，不出现1402bp条带时为雄性达氏鲟。本发明提供的达氏鲟序列片段可以快速有效鉴定达氏鲟雌雄，有效提高达氏鲟养殖效率和养殖合理性，人为调节养殖达氏鲟雌雄比例。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用PCR产物条带数量差异鉴定达氏鲟性别方法，属于动物分子遗传学领域。
背景技术
长江鲟又称达氏鲟是我国长江上游特有品种，在研究地球气候变化和鱼类演化等方面具有重要的科学价值。近年来，由于过度捕捞、环境污染等原因，长江鲟的资源急剧减少，已成为极危级(CR)物种，濒临灭绝。因此，如何保护长江鲟资源显得十分迫切和必要。
大多数脊椎动物为雌雄异体，且在形态和生理上体现出明显的性别二态性。性别是决定两性生殖繁殖的关键环节。随着分子生物学的发展，多种类型的性别标记被开发出来，包括微卫星标记、单核苷酸多态性、随机扩增多态性DNA和限制性片段长度多态性。性别特异分子标记的开发应用和性别决定基因的鉴定一方面可以提高与性别相关的经济性状，为实现性控育种提供必要的工具；另一方面也为阐明鱼类性别决定的分子机理奠定基础。性别分子标记是开发性别控制技术的重要工具。
目前所有鱼类被开发的性别标记只能和雄性个体连锁或者只能和雌性个体连锁。只和单个性别连锁的性别标记都有一个共同的缺点。举个例子，某种鱼的性别连锁标记是和该品种鱼的雌性个体连锁，在雄性个体中扩不出目的片段，假如在实验操作过程中出现实验失误，比如DNA没有提取成功、药品遗漏或者加错导致的实验结果没有扩出目的片段，就会误以为该检测样本为雄性，实际上该实验不成功。为了避免该现象的出现，开发出一种特殊的性别标记非常必要，该性别标记在雌雄个体上面都能扩增出相应的DNA片段，但是在雌雄个体上面扩增的结果不完全相同，比如出现扩增的DNA片段大小不同或者扩增的DNA片段数量不同。本专利即提出了一种上述的达氏鲟特殊的性别标记。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用PCR产物条带数量差异鉴定达氏鲟性别方法。
一种雌性达氏鲟基因组特异性序列片段，雌性达氏鲟基因组特异性序列片段为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。
一种雌雄达氏鲟均可扩增出的阳性参考DNA片段，所述雌雄达氏鲟均可扩增出的阳性参考DNA片段为SEQ ID NO:2为所示核苷酸序列。
SEQ ID NO:1所示核苷酸序列和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列应用于鉴定达氏鲟的性别。
所述的特异分子标记表现为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。所述的在雌雄达氏鲟基因组DNA均可扩增出的阳性参考DNA片段序列为SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。
所述的序列SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，为雌性达氏鲟基因组特异性片段，该片段引物为R6R2。具体片段为：
AGGGAGATTGTTGACTAGGATTCATTCGCTCTCTGTCACAGTCCCGCATATGTGATCAAGGTTCGTAGAACAGCTTTTACTTCTGCCCCTTTGTGCTGAATAATTTGGTGGACATTGATGTAGTGAGTCCATTTCCTGGGAATGAATAGCAAACCCAGTGTGTTATTGGCCCTTGTCCCAATAGTGTGATCCATCAATATACACTGATGTGGCAGTGACATCGGGTGTGGTTGTAAAGGGAGACGGCAGATGTGTTTGTGGGGGGGGTGCAGTCATGTGGGGTACCGGTGTATAGCAGGGCTGTGGGAAGCATGGCAACTGGTATGTGTTTACATGACAGGTTTCGTTCTGATAAAGACAGGGTCCACCCGGCCAATCGAGCGTTGGATATGCCCTTAACGCTGCCATTGAGCAAAAGTTGGATAGGAGTGTGTTCTGTTTGCACTGTAATGTGTTGAAAACCTGTAATAAATTTGAAATATAGAACAGCCCAATATACAGATAGCAGGTGACGAGTACACTGATCAAAAGCTTGCTCAACGGCTTTGAGTAGCCTTGAAGCGTAGGCGACGGGATGTAGCTTGGTATTTACTTCCTGTAACAAAACTGCAGAGAGAAGTTTTGGTAGCTGCAGTCTGCAAAATAAGGGGTTCATTAGAAGCCAGATTTCGGAGGGCATGTGCTTCTAGCAGGGAGGCTTTGAGAGATTCAAAAGCAGTCTAATGTTTGCTTTCCCATACCAACACATCCTTGCCTTTCCTGGAACCTTTCAACAGATCATAAAGTGGTTTAGCCTTGGATGAAAAGTCCTCAAACTCACAACAAAAATTGACCAGACCTAGAAAGGAACGTAAAGCAGTTTTCAGAGGTTGGCACAGGCAGCCACTGTACAGTTTCCACTTTGTGTTTGTCTGGGGACCGTCCTCCTTCCTCAATGAGTACCCCTAGAAAAGTAACAGAAGGTTGCATTAGTTGTGCTTTTTTGGGTTCAGATTGAGTCCTGCATTCTCTGTTGTTGTCAACAGCTCATCCAGCAGTGAGAGATGCTCCTCCTTTGAGTGTCTGTCAGTAAGTCATCGACATAATGTATTAAACATTGGGGTTTAGAGAAGCAGGACAAAATTTCAGAAAGTATTTGGTGAAAGAGCGTGGGAGAGTTGTGGAACCCTTGCGGAATTTTATTCCAGGTATACTGTGTATCGCCAAAAGTGAAACCAAATTTATAGCGTGATTCTGGTTTCACTGGCAGAGACCAGAAACCATTAAAAATGTCAAGAGCGGTGTAATAGCAGGCAGAAGGGGTTAACTCAGAAAGCACATTTGGGGTAGATGCGTCTACAGGTGCGCATATAGGTGTGTGTTTAAGTTCCATGTAATCAATTGTAAGTCGCCAAGAACCGTC
所述的在雌雄达氏鲟基因组DNA均可扩增出的阳性参考DNA片段序列(SEQ ID NO:2)的引物为R4R3，该片段具体信息为：
TTGGAGAAGCCTACTGGGAAAGACGCAGAAATTTTAATTTCCCAAATGTTATAGTTAAAAATGATCTGTTCTACAGGGTGAGCAATTCTAATATGTGAGAGCTGGTAGAACAGTTAATGGCCCCAAGGAAGTATAAAACAACAGTTTTGAAACTAGCCCATGGTCATTTTTTAGAGGGACAATTGGGAGTTCAGAAAACAAGGGAACACATTTAAAAAAGGTTTTATTGGATAGGAATATATCAAGAAGTGGAACAGTTTTGTGGGGCATGTCCAGAATGCCAATTGGTGTTGGCACAGAAACTGAGTTGAGCACCTTCAG
一种利用PCR产物条带数量差异鉴定达氏鲟性别方法具体引物信息如下：
| 序列信息 | 退火温度(℃) | ||
| R6R2F | SEQ ID NO:3所示核苷酸序列 | AGGGAGATTGTTGACTAGGAT | 58 |
| R6R2R | SEQ ID NO:4所示核苷酸序列 | GACGGTTCTTGGCGACT | 58 |
| R4R3F | SEQ ID NO:5所示核苷酸序列 | TTGGAGAAGCCTACTGG | 58 |
| R4R3R | SEQ ID NO:6所示核苷酸序列 | CTGAAGGTGCTCAACTCA | 58 |
雌性达氏鲟基因组特异性引物R6R2 F、R6R2R为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列引物；
R4R3F、R4R3R序列为SEQ ID NO:2所示核苷酸序列引物，引物R4R3F、R4R3R配合引物R6R2 F、R6R2R使用。
利用本发明所述的引物对待测达氏鲟DNA进行PCR扩增，当扩增结果的产物在琼脂糖凝胶上显示的结果为3个条带时，则待测达氏鲟为雌性，当扩增结果的产物在琼脂糖凝胶上显示的结果为2个条带时，则待测达氏鲟为雄性。或者当扩增结果片段出现1402bp条带时，则待测达氏鲟为雌性，不出现1402bp条带时为雄性。
所述鉴定达氏鲟雌雄的具体方法为：提取待鉴定达氏鲟DNA；利用所示的引物对样品进行PCR扩增；把PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳30分钟进行分离，具体电压为120V；根据分离结果统计PCR扩增产物的条带大小。本发明所述的PCR扩增体系是25ul：10×PCR Buffer 3ul，2.5mmol/L dNTP 2ul，MgCl2 3ul，上下游引物各1ul，Taq酶0.5ul，DNA模板2ul，超纯水10.5ul。本发明所述的PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸55s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
使用本发明提供的序列可以准确鉴定达氏鲟雌雄，实施例进行了验证，与实际结果完全一致，准确度100％。
与现有技术相比，本发明具有以下的优点：
利用本发明可以快速准确的鉴定达氏鲟性别。利用本发明可以实现达氏鲟全雌化养殖，节省了养殖空间，合理利用达氏鲟养殖的人力、物力和财力。
本发明所述的引物R6R2具有独一无二的特性。以往公开的任何物种的性别特异性标记，只能在雌性或者雄性中具有反应产物，比如说之前公开的中华鲟特异性性别标记只在雌性个体中具有反应产物，在雄性个体中不具有反应产物，所以称为中华鲟特异性性别标记，根据这一特性判断待测个体的雌雄信息。但是当在实验反应过程中，出现实验失误导致实验失败而没有反应产物时候，这时候实验人员根据实验反应产物的有无，会误以为实验待测个体为雄性，从而导致实验错误。本发明所述的引物R6R2F在雌性达氏鲟中具有两种反应产物，在雄性达氏鲟中具有一种反应产物，避免了实验失误导致实验结果误判的现象，所以说本发明所述的引物R6R2是优于目前报道所有物种的性别特异性标记。
利用本发明可以实现达氏鲟全雌化养殖，节省了养殖空间，合理利用达氏鲟养殖的人力、物力和财力。本方法可以无损伤鉴定达氏鲟的性别。
本鉴定方法相较于达氏鲟另一个传统性别鉴定方法(挖卵鉴定)更具有优势，挖卵鉴定法需要对3岁龄以上的达氏鲟进行剖腹和把卵挖出来一部分进行鉴定，挖卵鉴定法对达氏鲟会造成非常大的伤害。本方法避免了科研人员在实验操作过程出现的各种失误对实验结果造成误读的现象，比如提取DNA失败、加错样品或者药剂都不会对本方法的实验结果造成偏差。
附图说明
图1为提取的达氏鲟DNA效果图，
图2为达氏鲟性别鉴定图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和有点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
提取待鉴定达氏鲟DNA：
2021年4月份，申请人从中国长江三峡集团有限公司中华鲟研究所宜昌实验站对产过卵的12尾雌性达氏鲟和12尾产过精子的雄性达氏鲟进行剪鳍条取样。对这24尾达氏鲟进行提取DNA，具体提取法方法为：
(1)取出保存的鳍条样本，剪取0.5g左右，放入2mL的灭菌离心管中，加入1×TE无菌缓冲液，4℃浸泡12h；
(2)取出鳍条组织，放入含有350ul的无菌抽提缓冲液中，轻轻混匀，加入40ul20％SDS和10ul 20mg/mL蛋白酶K(终浓度为400ug/mL)，混匀；
(3)56℃孵育4h，每隔半小时轻轻摇晃离心管以利消化。若组织不易消化，可延长孵育时间至8h，或37℃消化过夜：
(4)待组织消化完全，取出离心管，加入300ul 6M NaCI溶液，立刻剧烈震动30S；
(5)12000rpm离心10min；
(6)弃沉淀，将上清液倒入新的离心管中，再以同等条件离心一次，取上清液，加入等体积的预冷异丙醇，.20℃放置1h以上；
(7)4℃，12000rpm离心15min；
(8)弃上清液，沉淀用70％乙醇溶液洗涤一次，37℃烘干或自然晾干；
(9)加入50ul灭菌双蒸水溶解DNA，待完全溶解后稀释成100ng/uL，置于4℃冰箱保存备用。
(10)用1％琼脂糖凝胶鉴定提取的DNA完整度，所用Marker为DL1000，结果如图1所示，结果显示这24尾达氏鲟DNA提取非常成功。
实施例2
鉴定达氏鲟的性别：
提取性别已用挖卵法鉴定的24尾达氏鲟DNA(采样记录为12雄12雌)。利用本发明提供的引物组对这24尾达氏鲟DNA进行PCR反应。PCR扩增体系是25ul：10×PCR Buffer3ul，2.5mmol/L dNTP 2ul，MgCl2 3ul，上下游引物各1ul，Taq酶0.5ul，DNA模板2ul，超纯水10.5ul。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸55s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。然后在1％琼脂糖凝胶电泳30分钟，电压为100V。在照胶仪上观察结果，具体结果如图2所示由图2可知，用挖卵法鉴定的12尾雌性达氏鲟均有三个条带，说明这12尾雌性达氏鲟用本方法鉴定的结果也为雌性个体。用挖卵法鉴定的12尾雄性达氏鲟均有两个条带，说明这12尾雄性达氏鲟用本方法鉴定的结果也为雄性。经过本方法鉴定24尾达氏鲟有12尾为雄性，12尾为雌性。其结果和采样记录的结果一致。该实验证明了本方法鉴定达氏鲟性别的准确性，本方法可以应用于达氏鲟的性别鉴定。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种雌性达氏鲟基因组特异性序列片段，其特征在于，雌性达氏鲟基因组特异性序列片段为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。
2.一种雌雄达氏鲟均可扩增出的阳性参考DNA片段，其特征在于，所述雌雄达氏鲟均可扩增出的阳性参考DNA片段为SEQ ID NO:2为所示核苷酸序列。
3.权利要求1中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列和权利要求2中SEQ ID NO:2所示核苷酸序列应用于鉴定达氏鲟的性别。
4.根据权利要求3所述的鉴定达氏鲟性别的方法，其特征在于，包括用于达氏鲟雌雄鉴定的两对引物：
R6R2F：为SEQ ID NO:3所示核苷酸序列；
R6R2R：为SEQ ID NO:4所示核苷酸序列；
R4R3F：为SEQ ID NO:5所示核苷酸序列；
R4R3R：为SEQ ID NO:6所示核苷酸序列；
雌性达氏鲟基因组特异性引物R6R2 F、R6R2R为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列引物；
R4R3F、R4R3R序列为SEQ ID NO:2所示核苷酸序列引物，引物R4R3F、R4R3R配合引物R6R2 F、R6R2R使用。
5.权利要求4所述的引物在达氏鲟性别鉴定中应用。
6.一种利用PCR产物条带数量差异鉴定达氏鲟性别方法，其特征在于，对待测达氏鲟的基因组DNA进行PCR扩增，当扩增结果的产物在琼脂糖凝胶上显示的结果为3个条带时，则待测达氏鲟为雌性，当扩增结果的产物在琼脂糖凝胶上显示的结果为2个条带时，则待测达氏鲟为雄性；
或者当扩增结果片段出现1402bp条带时，则待测达氏鲟为雌性，不出现1402bp条带时为雄性。
7.根据权利要求6所述利用PCR产物条带数量差异鉴定达氏鲟性别方法，其特征在于，所述鉴定达氏鲟雌雄的具体方法为：提取待鉴定达氏鲟DNA；利用权利要求4所示的引物组对样品进行PCR扩增；把PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳30分钟进行分离，具体电压为120V；根据分离结果统计PCR扩增产物的条带大小。
8.根据权利要求7的鉴定达氏鲟性别的方法，其特征在于，PCR扩增体系是25ul：10×PCR Buffer 3ul，2.5mmol/L dNTP 2ul，MgCl2 3ul，上下游引物各1ul，Taq酶0.5ul，DNA模板2ul，超纯水10.5ul。
9.根据权利要求7的鉴定达氏鲟性别的方法，其特征在于，PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min; 94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸55s，35个循环； 72℃延伸10min； 4℃保存。
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