CN106434971B - 分析禾本科植物遗传多样性的pcr引物、方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种分析禾本科植物遗传多样性的PCR引物、方法及试剂盒。本发明提供的技术方案通过在13份DNA中挑选取3个性状各异的DNA模板，用SRAP标记技术从100对引物中筛选出有清晰多态性条带的21对引物，用筛选出来的21对引物对13份DNA进行标记，并电泳、成像、拍照、统计数据，使用ntsys软件完成对各种的遗传，似性和遗传距离进行UPGMA法聚类分析图，进行多样性分析和种间关系研究。研究表明：禾本科植物种质资源间存在着丰富的的遗传多样性；这些材料的遗传类群与地理来源和地理环境没有较大关系；SRAP分子标记是一种适合用于禾本科植物种质资源研究的分子标记。

Description

分析禾本科植物遗传多样性的PCR引物、方法及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分析禾本科植物遗传多样性的PCR引物、方法及试剂盒。

背景技术

遗传多样性是每种生物固有的特性,是长期适应和进化的产物。钝叶草的遗传多样性就其本身而言,是非常重要的。当某一物种的基因多样性消失后，就不会再恢复了，而当基因多样性降低至一定程度后，会发生近交衰退甚至导致物种灭绝。我国是钝叶草属植物的原产地之一，分布范围也很广，目前已经有学者研究过钝叶草，如黄娟、老猫等。但深入到分子层面的研究依然少有见闻。

基于PCR的新型分子标记技术一SRAP(Sequence-related AmplifiedPolymorphism)标记的发明和应用弥补了以上分子标记的不足且具备了它们的优点。此技术是由美国加里弗尼亚大学，蔬菜系Li和Quiros于2001年在芸薹属植物中开发提出的。SRAP标记是根据基因外显子中丰富的GC含量和内含子、启动子中丰富的TA含量的特点，利用独特的引物设计对ORFs(Open reading frames,开放阅读框架)进行扩增，因不同个体间的外显子、内含子和启动子的不同而产生多态性。SRAP标记简单、稳定可靠、重复性好、多态性高、在基因组中分布均匀、引物非特异性、少量引物可组配多种引物对等优点使其在多种植物中得到广泛的应用。引物大小和引物组合是成功进行SRAP分析的关键。

目前，还未有报道用于钝叶草种质资源研究的SRAP分子标记引物。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种鉴定分析禾本科植物遗传多样性的SRAP分子标记引物组、方法及试剂盒。本发明提供的分析禾本科植物遗传多样性的分子鉴定方法，可对分析禾本科植物遗传多样性进行SRAP分子标记鉴定，快速、准确。

第一方面，本发明提供了一种鉴定分析禾本科植物遗传多样性的SRAP分子标记引物，包括如下a)-v)引物对的至少一对：a).引物对E1M2、b).引物对E1M10、c).引物对E2M2、d).引物对E3M4、e).引物对E4M7、f).引物对E5M3、g).引物对E5M6、h).引物对E6M3、i).引物对E7M3、j).引物对E7M4、k).引物对E8M1、m).引物对E8M4、n).引物对E8M8、o).引物对E9M2、p).引物对E9M3、q).引物对E9M6、r).引物对E10M3、s).引物对E10M4、t).引物对E10M5、u).引物对E10M6、v).引物对E10M9；

其中，M1-M10正向引物的核苷酸序列(5'-3')为：

M1 TGAGTCCAAACCGGATA

M2 TGAGTCCAAACCGGAGC

M3 TGAGTCCAAACCGGAAT

M5 TGAGTCCAAACCGGAAG

M6 TGAGTCCAAACCGGAGC

M7 TGAGTCCAAACCGGTAG

M8 TGAGTCCAAACCGGTAA

M9 TGAGTCCAAACCGGTCC

M10 TGAGTCCAAACCGGTGC；

其中，E 1-E10反向引物的核苷酸序列(5'-3')为：

E1 GACTGCGTACGAATTAAT

E3 GACTGCGTACGAATTGAC

E4 GACTGCGTACGAATTTGA

E5 GACTGCGTACGAATTAAC。

E6 GACTGCGTACGAATTGCA

E7 GACTGCGTACGAATTCGA

E8 GACTGCGTACGAATTCAA

E9 GACTGCGTACGAATTCTG

E10 GACTGCGTACGAATTAGC。

在本发明一实施例中，禾本科植物为钝叶草或结缕草。

在本发明一实施例中，采用鉴定分析禾本科植物遗传多样性的SRAP分子标记引物所获得的分析禾本科植物遗传多样性信息中，遗传距离为0.54～0.92。

在本发明一实施例中，采用鉴定分析禾本科植物遗传多样性的SRAP分子标记引物所获得的分析禾本科植物遗传多样性信息中，遗传多态性带数总和不低于154个。

在本发明一实施例中，所述的SRAP分子标记引物为E9M3、E1M10两对引物对；E9M3、E10M3两对引物对或E9M3、E6M33两对引物对组成的PCR引物组。

在本发明一实施例中，所述的SRAP分子标记引物为E9M3、E9M2、E1M10组成的PCR引物组。

第二方面，本发明还提供了一种鉴定分析禾本科植物遗传多样性的SRAP分子标记方法，为用如第一方面所述引物对待鉴定的禾本科植物的基因组DNA进行PCR扩增；扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳检测、测序；获得SRAP条带；再对所得SRAP条带进行遗传多样性分析，获得分析禾本科植物遗传多样性信息。

在本发明一实施例中，禾本科植物为钝叶草或结缕草。

在本发明一实施例中，所述PCR体系中，DNA模板用量为50-200ng、Mg²⁺浓度为2.6mmol/L、引物总浓度为10μmol/L(上游、下游引物各0.5μmol/L)、dNTP浓度为0.22mmol/L、Taq酶用量为1U。

优选地，多重PCR扩增反应条件为：

在本发明一实施例中，所述对所得SRAP条带进行遗传多样性分析的步骤具体包括：

以1和0记录等位基因的有和无，获得矩阵；

用ntsys分析软件，计算多态位带数、多态带数百分率、观测等位基因数、有效等位基因数、基因多样性指数中的一种或多种；

对带鉴定禾本科植物中的遗传相似性和遗传距离进行UPGMA法聚类分析，获得分析禾本科植物遗传多样性信息。

在本发明一实施例中，所述获得的分析禾本科植物遗传多样性信息中，遗传距离为0.54～0.92。

在本发明一实施例中，所述获得的分析禾本科植物遗传多样性信息中，遗传多态性带数总和不低于154个。

第三方面，本发明还提供了一种分析禾本科植物遗传多样性的试剂盒，包括如第一方面所述的鉴定分析禾本科植物遗传多样性的SRAP分子标记引物，还包括用于PCR的缓冲液、DNA聚合酶。

第四方面，本发明还提供了一种如第一方面所述的SRAP分子标记引物在鉴定分析禾本科植物遗传多样性中的应用。

本发明的有益效果在于：

通过本发明提供的技术方案可得到清晰的用于多样性分析的谱带，在本发明一实施例中，得到了多态性条带共154条，多态性比率为81.48％；这一方面说明了钝叶草属植物同种质资源间存在着丰富的遗传变异，检测方法对于能否检测到尽可能多的遗传变异很关键。同时也说明了本发明提供的技术方案在钝叶草等草类植物遗传多样性研究中较高的检出效率。

具体地，在本发明实施例中，本发明提供了一组SRAP-PCR标记引物组，通过聚类分析把13份不同地方采集的钝叶草属种源的DNA划分为4个类群，可以看出其中科特迪瓦的两种钝叶草优先聚集并和马尔代夫、斯里兰卡、澳大利亚和哥斯达黎加的DNA材料聚为一个类群；甘肃兰州的金心钝叶草(2)、海南琼中钝叶草和海南耐盐钝叶草聚集为一个类群；委内瑞拉钝叶草和海南本地钝叶草聚为一个类群；甘肃兰州金心钝叶草(1)和海南琼中钝叶草聚为一个类群。分析结果表明，同种之间存在遗传分化。

本发明实施例通过SRAP分子标记技术对钝叶草属植物的遗传多样性进行研究，结果显示2、5、12聚为一类，10和13聚为一类等，表示其亲缘关系较近，SRAP分子标记聚类分析给草种确定身份提供了新的信息，这些都体现出SRAP分子标记技术在钝叶草属植物遗传多样性研究中的优越性和有效性，本发明的结论为SRAP分子标记技术在禾本科植物进一步研究中的应用奠定了良好的基础。

附图说明

图1为本发明实施例提供的部分基因组DNA质量检测结果；

图2为本发明实施例提供的稀释后基因组DNA质量的检测结果；

图3为本发明实施例提供的部分引物筛选结果；

图4为本发明实施例提供的引物E9/M3扩增图谱；

图5为本发明实施例提供的13分钝叶草材料的聚类分析图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明采用的Mg²⁺、dNTPs、Taq DNA聚合酶和用于凝胶检测的标准分子量DNA Marker均购自北京天根有限公司。

本发明实施例以中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所收集的13份钝叶草为试验材料(见表1)。

表1钝叶草实验材料

一、基因组DNA的提取

采用改良CTAB法，步骤如下：

(1)取新鲜幼嫩叶片，加入液氮迅速研磨成粉末，转入2mL离心管中，加入1mL预冷的CTAB-free缓冲液，冰浴10min。7 000r/min离心5min，弃上清；

(2)加入1mL 65℃预热的3×CTAB提取缓冲液，混匀，65℃水浴30min，其间不断轻轻混匀，4℃，1 000r/min离心5min；

(3)取上清，加入酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，轻轻颠倒混匀，4℃，12 000r/min离心10min；

(4)取上清，加入氯仿/异戊醇(24：1)，轻轻颠倒混匀，4℃，12 000r/min离心10min；

(5)取上清，加入等体积异丙醇，轻轻混匀，置于-20℃沉淀30min；

(6)弃上清，4℃，7 000r/min离心5min；

(7)70％乙醇洗涤2次；

(8)风干后加入100μL TE溶解沉淀，加入1μL 10mg/mL RNase A酶，37℃水浴30min；4℃保存备用。

二、基因组DNA质量检测

琼脂糖凝胶电泳检测

制备1.0％(每10毫升0.5×TBE加入0.1克的琼脂糖)的琼脂糖凝胶，分别取5μLDNA和1μL上样缓冲液混合，用0.5×TBE缓冲液于140V电泳30min，并用凝胶图像分析系统检测，拍照。

核酸蛋白分析仪检测

取1μL DNA原液，核酸蛋白分析仪测A260/A280及DNA浓度。

DNA的工作浓度：100ng/μl(用时用母液稀释成工作液)。

SRAP分析

1、引物筛选

SRAP引物设计参考Li与Quiros的方法，合成10条正向引物和9条反向引物(见表2),共组合成90对引物，以3个钝叶草(耐盐钝叶草、澳大利亚钝叶草、科特迪瓦钝叶草)的DNA作为模板进行引物筛选，每对引物重复扩增1次。筛选出了3个DNA模板间有差异条带、扩增稳定、带型清晰的引物，再用这3个DNA模板对上述筛选出的引物进行进一步筛选，每对引物扩增1次，筛选出具有多态性的引物。

表2引物及其序列(以及在序列表中的编号)

2、SRAP反应体系

钝叶草属种源DNA模板SRAP-PCR总体积10μl(见表3)。

表3 SRAP反应体系

3、SRAP的扩增程序

94℃预变性4min，94℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸30s，共5个循环；然后，94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸45s，共35个循环；循环结束后，72℃延伸7min；4℃停止反应。

4、SRAP扩增产物的检测

扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳检测。电泳条件为：上样5μLPCR反应液，0.5×TBE缓冲液，1.5％(每10毫升0.5×TBE加入0.15克的琼脂糖)的琼脂糖凝胶(其中含有Gold View核酸染料)，140V的电泳电压电泳约40分钟。电泳完毕后在凝胶成像系统上观测、照相。

5、数据处理

每个SRAP条带，以1和0记录等位基因的有和无，获得矩阵，用ntsys分析软件，计算多态位带数、多态带数百分率、观测等位基因数、有效等位基因数、基因多样性指数，并对各种的遗传相似性和遗传距离进行UPGMA法聚类分析。

三、结果与分析

基因组DNA质量的检测

基因组DNA电泳检测结果如图1所示，由图1可知，基因组DNA条带明亮，谱带整齐，无其他杂带，说明提取的DNA量较多，DNA完整无降解。取1μL DNA原液，核酸蛋白分析仪测A260/A280及DNA浓度。J结果显示，A260/A280值在1.8～2.0之间,表示DNA的浓度高且无杂质。

然后加适量蒸馏水，将其稀释至100ng/μl，再次检测结果(如图2，图2为稀释后基因组DNA质量的检测结果)所示(λDNA为100ng/μl)，13份材料的基因组总DNA谱带整齐均一，亮度一致，符合试验要求，最后置于冰箱-20℃储存备用。

引物的筛选

以3个钝叶草的DNA作为模板对100对引物进行筛选，结果显示(图3，图3为部分引物筛选结果)，有21对引物都扩增出清晰的条带，占引物组合的21％，扩增产物大小为50～1500bp不等，另外的79对引物部分也有扩增出任何产物，但是产物不清晰或部分模板没有产物。

表4 21对SRAP引物组合筛选情况

注：√为有差异条带、带型清晰的引物组合。

多态性分析

13对SRAP引物扩增得到154个片段，由此看出，SRAP标记揭示钝叶草属的多样性效率是比较高的。引物的E9/M3扩增图谱见图4，图4为引物E9/M3扩增图谱。

从多态性带数、多态性带百分比(表5)来看，钝叶草草种内遗传变异比较小。多态性带百分比对遗传多样性只是一个粗略的估计，并不能代表在各条带在频率上的均匀度。

表5多态性条带统计

聚类分析

根据SRAP引物扩增得到的154条多态性条带，对13种钝叶草DNA模板进行遗传多样性分析。对钝叶草属植物的种内遗传相似性、遗传距离分析及聚类后发现，钝叶草属不同种源的遗传差异较大；如马尔代夫钝叶草与耐盐钝叶草。结果表明，13个DNA模板的相似系数变幅在0.54到0.92之间。在相似系数为0.69时，可将13份DNA模板分为4个类群(图5)，把DNA按表格(1)序列分别编为1～13号，可以看出其中科特迪瓦的两种钝叶草优先聚集并和马尔代夫、斯里兰卡、澳大利亚和哥斯达黎加的DNA材料聚为一个类群；甘肃兰州的金心钝叶草(2)、海南琼中钝叶草和海南耐盐钝叶草聚集为一个类群；委内瑞拉钝叶草和海南本地钝叶草聚为一个类群；甘肃兰州金心钝叶草(1)和海南琼中钝叶草聚为一个类群。见图(5)上述结果表明，同种之间存在遗传分化；生态地理条件对其遗传分化无较大影响。图5中，虚线处为0.69，品种编号见表1。

本发明实施例表明，钝叶草属植物在形态上存在着丰富的遗传变异，研究通过SRAP分子标记技术对13种钝叶草的DNA进行分析，结果21对引物扩增出154条多态性条带，多态性比率(PPB)为81.48％，遗传相似性变异范围较大，为0.54～0.92，这些结果从分子标记的角度说明了钝叶草属植物种质资源间存在丰富的遗传变异。

钝叶草属植物丰富的遗传变异为植物的优良品系的选育、开发和利用提供了空间，避免了因遗传基础狭窄而导致的给育种工作限制。因此，本发明提供的引物以及SRAP标记方法选育优良的钝叶草属植物新品种，在资源研究的开发利用上有着重大意义。

此外，采用单一SRAP引物对检测钝叶草属植物的遗传变异，由于鉴定引物不同，DNA样品不同，每次实验都需要配置不同的体系进行PCR，在配置PCR体系过程中非常麻烦，很容易加错样品。

为降低工作量，减少人为失误，本发明人还对各引物的多重PCR体系进行了摸索。包括如下步骤：

采用表5所示出筛选出的引物对，对a-v对引物对进行组合。具体地，发明人先任选对2对引物组进行多重PCR，然后采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，选择和单独采用每对引物进行扩增时相比，多重PCR扩增结果所得条带总数不低于单独扩增所得条带总数的90％，多态性不低于80％的引物组进入下一轮筛选；每轮都多加一对，依次类推。结果发现：对采用2对引物进行多重PCR时，成功获得3组PCR引物组(分别为表6中的E9M3、E1M10；E9M3、E10M3和E9M3、E6M33个组合；大部分引物组由于非特异性扩增导致多重PCR时，相比单独每对引物扩增的条带之和低于95％，多态性之和低于90％)。其中，采用3对引物进行多重PCR时，有1个组合的扩增结果较佳(相比单独每对引物扩增的条带之和不低于95％，多态性之和不低于90％))；引物组合筛选情况如下表6所示；多态性结果如表7所示。

表6多重PCR(三对引物)引物组合筛选情况

注：√为有差异条带、带型清晰的引物组合。

表7多态性条带统计分析

由表6及表7可知，本发明提供的多重PCR组合E1M10、E9M2、E9M3引物组，可用于钝叶草属植物遗传变异的多重PCR鉴定，采用本发明提供的PCR引物组(E1M10、E9M2、E9M3)可一次性鉴定出表1所示13个待测钝叶草14条多态性条带，扩增总数可达18条。

本发明采用的优化后的多重PCR反应体系(20μL)：DNA模板用量为100ng、Mg²⁺浓度为2.5mmol/L、引物总浓度为0.6μmol/L(每条引物等量添加)、dNTP浓度为0.25mmol/L、Taq酶用量为1U。

反应程序为：

综上可知，本发明可采用多对SRAP引物对鉴定钝叶草属植物，并提供了优化的多重PCR扩增体系，不仅提高了检测准确度，而且降低了工作量，减少人为加样过程中引入的失误。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟76悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所

<120> 分析禾本科植物遗传多样性的PCR引物、方法及试剂盒

<130> 2016

<160> 19

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgagtccaaa ccggata 17

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgagtccaaa ccggagc 17

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgagtccaaa ccggaat 17

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgagtccaaa ccggaag 17

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgagtccaaa ccggagc 17

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgagtccaaa ccggtag 17

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgagtccaaa ccggtaa 17

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgagtccaaa ccggtcc 17

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgagtccaaa ccggtgc 17

<210> 10

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgagtccaaa ccggt 15

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gactgcgtac gaattaat 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gactgcgtac gaattgac 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gactgcgtac gaatttga 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gactgcgtac gaattaac 18

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gactgcgtac gaattgca 18

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gactgcgtac gaattcga 18

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gactgcgtac gaattcaa 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gactgcgtac gaattctg 18

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gactgcgtac gaattagc 18

Claims (3)

1.一种鉴定分析禾本科植物钝叶草(Stenotaphrum helferi)遗传多样性的方法，其特征在于，为采用SRAP分子标记引物对待鉴定的禾本科植物钝叶草的基因组DNA进行PCR扩增；扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳检测、测序；获得SRAP条带；再对所得SRAP条带进行遗传多样性分析，获得分析禾本科植物钝叶草遗传多样性信息；所述的SRAP分子标记引物为E9M3、E9M2、E1M10组成的多重PCR引物组；其中，M2、M3、M10、E1、E9的核苷酸序列(5'-3')为：

M2：TGAGTCCAAACCGGAGC

M3：TGAGTCCAAACCGGAAT

M10：TGAGTCCAAACCGGTGC

E1：GACTGCGTACGAATTAAT

E9：GACTGCGTACGAATTCTG。

2.如权利要求1所述的鉴定分析禾本科植物钝叶草遗传多样性的方法，其特征在于，PCR体系中，DNA模板用量为50-200ng、Mg²⁺浓度为2.6mmol/L、引物总浓度为10μmol/L、dNTP浓度为0.22mmol/L、Taq酶用量为1U。

3.如权利要求1所述的鉴定分析禾本科植物钝叶草遗传多样性的方法，其特征在于，所述对所得SRAP条带进行遗传多样性分析的步骤具体包括：

以1和0记录等位基因的有和无，获得矩阵；

用ntsys分析软件，计算多态位带数、多态带数百分率、观测等位基因数、有效等位基因数、基因多样性指数中的一种或多种；

对待鉴定禾本科植物钝叶草中的遗传相似性和遗传距离进行UPGMA法聚类分析，获得分析禾本科植物钝叶草遗传多样性信息。