CN108103162B - 基于kasp技术开发的用于甘蓝杂交种鉴定的核心snp标记及其应用 - Google Patents
基于kasp技术开发的用于甘蓝杂交种鉴定的核心snp标记及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108103162B CN108103162B CN201810030833.0A CN201810030833A CN108103162B CN 108103162 B CN108103162 B CN 108103162B CN 201810030833 A CN201810030833 A CN 201810030833A CN 108103162 B CN108103162 B CN 108103162B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- sequence
- primer
- cabbage
- artificial sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 title claims abstract description 82
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 title claims abstract description 79
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 title claims abstract description 79
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 title claims abstract description 79
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 239000003550 marker Substances 0.000 title abstract description 29
- 238000011161 development Methods 0.000 title description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 170
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 42
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 41
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 41
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 31
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 31
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 11
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 6
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 6
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 claims description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 4
- 235000011303 Brassica alboglabra Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000011302 Brassica oleracea Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 3
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 15
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 4
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 244000178937 Brassica oleracea var. capitata Species 0.000 description 2
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 1
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 1
- 241000219193 Brassicaceae Species 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241001386813 Kraken Species 0.000 description 1
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 1
- SWLVFNYSXGMGBS-UHFFFAOYSA-N ammonium bromide Chemical compound [NH4+].[Br-] SWLVFNYSXGMGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 125000000913 palmityl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- HNJXPTMEWIVQQM-UHFFFAOYSA-M triethyl(hexadecyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](CC)(CC)CC HNJXPTMEWIVQQM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/172—Haplotypes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及甘蓝品种鉴定，具体涉及一组基于KASP技术开发的用于甘蓝杂交种鉴定的核心SNP标记及其应用。所述核心SNP标记包含Bol01～Bol50 SNP标记中的任意一种或更多种，或全部；所述Bol01～Bol50 SNP标记的具体信息如表1所示。基于所述核心SNP标记，可实现对甘蓝杂交种的高通量SNP分型检测，结果准确性高，稳定性好，能够显著提高品种鉴定效率。
Description
技术领域
本发明涉及甘蓝品种鉴定，具体涉及一组基于KASP技术开发的用于甘蓝杂交种鉴定的核心SNP标记及其应用。
背景技术
结球甘蓝简称甘蓝，是十字花科芸薹属的一种重要蔬菜，在我国各地广泛种植。截止至2015年，我国审(鉴、认)定或登记的甘蓝品种共计247个，其中大部分为一代杂种。近年来，市场上的甘蓝品种不断增多，种植面积不断增大。但是，在市场上同名异物及同物异名的情况时有发生，甚至一些不合格种子混入市场带来巨大的经济损失，因此对品种进行快速准确鉴定对于假种辨别和解决产权纠纷具有重要作用。现行的植物新品种特异性、一致性和稳定性(DUS)测试主要依据行业标准考察品种的表型，但存在鉴定周期长、易受环境影响、测试性状多等问题，给品种权纠纷、司法维权带来困难。
随着分子生物学的发展，分子标记技术的出现为品种鉴定提供了新的手段。分子标记技术具有周期短、不受环境影响、可进行高通量测试分析等优点，已经在品种鉴定、种子纯度鉴定等方面得到广泛应用。国际植物新品种保护联盟(UPOV)于2010年发布了DNA分子标记选择和数据库构建指南(简称BMT指南)，指出SSR和SNP标记是特别适用于品种鉴定的方法。SSR标记具有多态性高、共显性、实验程序简单、结果重复性好等优点，在甘蓝品种鉴定中得到广泛的应用。但利用SSR标记进行品种鉴定存在着SSR标记数量有限、检测位点少，SSR位点存在一定的突变率、对变异反应比较敏感等缺点，而利用SNP标记构建的指纹库则能克服这些问题。相对于传统的SSR标记，SNP标记具有数量多、分布广泛、稳定性高、易于快速且高通量分型的特点。常用的SNP检测方法有基于DNA芯片技术、测序及竞争性等位基因特异性PCR等。DNA芯片技术是检测SNP的最常用方法，但该方法的成本较高。KASP(Kompetitive Allele Specific PCR，即竞争性等位基因特异性PCR)技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP进行分型，该技术具有高度的稳定性与准确性，其检测原理是：针对每个SNP位点设计两条3’端碱基不同的等位基因正向引物与一条反向引物，两条正向引物5’端分别连有序列不同的F标签和H标签，三种引物组成Primer Mix；设计荧光探针，F探针与F标签序列一致，H探针与H标签序列一致，F探针的5’端有一个FAM荧光基团，H探针的5’端有一个HEX荧光基团，相应于F探针和H探针，各设计一个3'端带淬灭基团的淬灭探针，构成荧光引物；将DNA模板、Primer Mix、含有荧光引物的Master Mix混合后进行PCR；PCR反应1：变性模板与Primer Mix中相匹配的引物结合并退火，延伸后序列被加上了标签序列；PCR反应2：等位基因特异性的末端序列的互补链合成；PCR反应3：特异序列对应的标签随PCR反应进行指数性增长，相应信号被检测。相比于DNA芯片技术，利用KASP技术进行SNP检测的成本较低，其成本与检测的SNP位点数呈正相关。因此，基于KASP技术开发SNP标记进行品种鉴定，可大大提高鉴定效率。
发明内容
为满足上述领域的需求，本发明提供一组基于KASP技术开发的用于甘蓝杂交种鉴定的核心SNP标记，基于所述核心SNP标记，可实现对甘蓝杂交种的高通量SNP分型检测。
本发明基于KASP技术开发的用于甘蓝杂交种鉴定的核心SNP标记，其特征在于，包含Bol01～Bol50SNP标记中的任意一种或更多种，或全部；所述Bol01～Bol50SNP标记的具体信息如表1所示：
表1.用于甘蓝杂交种鉴定的核心SNP标记
所述SNP物理位置是基于甘蓝自交系02-12的全基因组序列而确定的，所述甘蓝自交系02-12的全基因组序列在NCBI数据库中的序列号为KR233156。
本发明开发的核心SNP标记，均匀分布于甘蓝基因组的9条染色体上，每条染色体上各5-6个SNP标记，共50个SNP标记。基于这套核心SNP标记，可实现对甘蓝杂交种的高通量SNP分型检测，结果准确性高，稳定性好，能够显著提高品种鉴定效率。
本发明还提供用于扩增所述核心SNP标记的引物组合，其特征在于，包含Bol01p～Bol50p引物组中的任意一组或更多组，或全部；所述Bol01p～Bol50p引物组的序列信息如表2所示：
表2.用于PCR扩增核心SNP标记的引物组
优选地，所述引物组合包含：
选自Bol01p～Bol05p引物组中的至少1组，用于检测染色体C01上对应的SNP标记；
选自Bol06p～Bol10p引物组中的至少1组，用于检测染色体C02上对应的SNP标记；
选自Bol11p～Bol16p引物组中的至少1组，用于检测染色体C03上对应的SNP标记；
选自Bol17p～Bol22p引物组中的至少1组，用于检测染色体C04上对应的SNP标记；
选自Bol23p～Bol27p引物组中的至少1组，用于检测染色体C05上对应的SNP标记；
选自Bol28p～Bol33p引物组中的至少1组，用于检测染色体C06上对应的SNP标记；
选自Bol34p～Bol39p引物组中的至少1组，用于检测染色体C07上对应的SNP标记；
选自Bol40p～Bol45p引物组中的至少1组，用于检测染色体C08上对应的SNP标记；
和选自Bol46p～Bol50p引物组中的至少1组，用于检测染色体C09上对应的SNP标记。
本发明还提供用于鉴定或辅助鉴定甘蓝杂交种的试剂盒，其特征在于，包含粉末状的或液态的所述引物组合。
优选地，每一组引物中的两条正向引物的5’端分别带有序列标签A和序列标签B，所述序列标签A和序列标签B的核苷酸序列互不相同并且与甘蓝基因组序列不同源。根据该原理，本领域技术人员可以获得若干适合的序列标签。
优选地，还包含PCR预混液，所述PCR预混液含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；
所述荧光探针A的核苷酸序列与序列标签A的核苷酸序列一致，其5’端连接荧光基团A；所述淬灭探针A的核苷酸序列与序列标签A的核苷酸序列反向互补，其3’端连接淬灭基团；
所述荧光探针B的核苷酸序列与序列标签B的核苷酸序列一致，其5’端连接荧光基团B；所述淬灭探针B的核苷酸序列与序列标签B的核苷酸序列反向互补，其3’端连接淬灭基团；
所述PCR预混液还包含ROX内参染料，KlearTaq DNA聚合酶，dNTP和MgCl2。
本发明还提供所述核心SNP标记或所述引物组合或所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定甘蓝杂交种中的应用。
根据实际需要，可以选择50个SNP标记中的9个或更多个或全部进行基因型检测。在一些实施例中，通过检测其中1个SNP标记来确定待测甘蓝品种是否属于目标品种或者甘蓝杂交品种的纯度。在另一些实施例中，检测其中9个或9个以上的SNP标记来确定待测甘蓝品种是否属于目标品种或者甘蓝杂交品种的纯度。优选地，从C01～C09的每个染色体上选择至少一个SNP标记进行检测。更优选地，检测全部50个SNP标记来鉴定待测甘蓝品种。
本发明还提供一种用于鉴定或辅助鉴定甘蓝杂交种的方法，其特征在于，对待测甘蓝品种进行SNP分型检测，包括以下步骤：
(1)提取待测甘蓝品种的DNA；
(2)以所述引物组合中的每一组引物分别对待测甘蓝品种的DNA进行PCR扩增；
(3)检查扩增结果，确定待测甘蓝品种在每一组引物对应的SNP标记位点的基因型。
优选地，所述“对待测甘蓝品种进行SNP分型检测”采用KASP检测法，所述KASP检测法包括：
(1)向待测甘蓝品种的DNA中加入引物混合液和PCR预混液，进行KASP扩增；
(2)采用荧光检测仪检测PCR产物，确定待测甘蓝品种在每一组引物对应的SNP标记位点的基因型；
所述引物混合液由同一引物组的正向引物1、正向引物2和反向引物构成，两条正向引物的5’端分别带有序列标签A和序列标签B，所述序列标签A和序列标签B的核苷酸序列互不相同并且与甘蓝基因组序列不同源；
所述PCR预混液含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，ROX内参染料，KlearTaq DNA聚合酶，dNTP和MgCl2；
所述荧光探针A的核苷酸序列与序列标签A的核苷酸序列一致，其5’端连接荧光基团A；所述淬灭探针A的核苷酸序列与序列标签A的核苷酸序列反向互补，其3’端连接淬灭基团；
所述荧光探针B的核苷酸序列与序列标签B的核苷酸序列一致，其5’端连接荧光基团B；所述淬灭探针B的核苷酸序列与序列标签B的核苷酸序列反向互补，其3’端连接淬灭基团。
优选地，所述PCR的反应体系为：PCR预混液5μL；引物混合液0.14μL，其中各引物的终浓度均为5nM；20ng/μL模板DNA 5μL；
所述PCR的反应条件为：94℃预变性15min；94℃变性20s，61-55℃退火延伸60s，每个循环的退火温度降低0.6℃，共10个循环；94℃变性20s，55℃退火延伸60s，共26个循环。
本发明提供的方法操作简单，只需将特异的引物混合液和通用的PCR预混液加入到含有DNA样本的PCR微孔反应板中，进行PCR扩增，然后采用荧光检测仪分析PCR产物并使用SNPviewer软件进行数据读取即可。所述引物混合液中的两条正向引物分别带有通用的序列标签A和序列标签B并连接SNP位点，所述PCR预混液中的各组分已预置于优化的缓冲液中，十分便于进行甘蓝杂交种的高通量SNP分型检测。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步阐述本发明，需要说明的是，这些实施例仅用于解释本发明而不能限制本发明的范围。
实验材料
用于SNP位点筛选的50份甘蓝自交系材料为已知文献“王冬梅.甘蓝类作物亲缘关系的SSR分析.[硕士学位论文]北京，中国农业科学院，2014.”第10-11页表2.1中材料编号88-137所记载的已知品种，均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所甘蓝课题组提供。用CTAB法分别提取50份甘蓝自交系的基因组DNA，送北京诺禾致源科技股份有限公司进行基因组测序，得到重测序数据。
甘蓝杂交种“晚丰”、“8398”、“中甘21”，均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所甘蓝课题组提供。
用于构建指纹图谱的59个甘蓝品种，均为已知品种，分别编号为1-59，它们的信息见表3：
表3.用于构建指纹图谱的59个甘蓝品种
主要试剂
KASP Master mix，购自英国LGC公司，货号为KBS-1016-012。
下述实施例中，未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制而得或商购获得；未特别说明的实验条件，均为本领域常规实验条件，可参考分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:a laboratory manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1、基于KASP技术开发的50个用于甘蓝杂交种鉴定的核心SNP标记
基于甘蓝自交系02-12全基因组序列(NCBI数据库，KR233156)与重测序50份甘蓝自交系材料进行SNP位点筛选，基于59个甘蓝品种基因分型结果进行核心SNP位点确定。
核心SNP位点的筛选和确定：利用已完成重测序的50个结球甘蓝自交系数据与甘蓝自交系02-12全基因组序列进行比对获得SNP位点。筛选其中多态性较好、在染色体上均匀分布的SNP位点共500个，将其转化为KASP标记。利用KASP平台对59份甘蓝品种进行基因分型，根据分型结果，采用以下特征进行筛选评估：(a)多态性信息含量大于0.35；(b)位点无缺失；(c)在染色体上均匀分布。对每个位点进行筛选分析，去除不符合要求的位点；最终从每条染色体上挑选5-6个杂交种多态性信息含量高且分型效果理想的核心SNP位点，合计50个，相关信息如表4所示，平均杂合率为0.49，平均最小等位基因率(MAF)0.42，平均多态性信息含量(PIC)0.36。
表4.50个核心SNP位点的相关信息
根据50个SNP位点的侧翼序列，针对每个SNP位点，采用KrakenTM软件在SNP位点上游设计两条正向引物，下游设计一条反向引物。设计得到的50个SNP标记的引物序列信息见表2，Bol01p～Bol50p引物组分别用于检测Bol01～Bol50SNP标记。
实施例2、引物合成与探针制备
1、引物合成
将表2所列的每一组引物中的两条正向引物的5’端分别加上序列标签A和序列标签B。所述序列标签A和序列标签B可自行设计或采用市售检测产品所对应的序列标签。
本实施例设计的序列标签的核苷酸序列为：
序列标签A：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT；
序列标签B：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT；
委托上海生工合成所有的反向引物以及带序列标签的正向引物。
2、探针制备
设计并合成荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B。
所述荧光探针A的核苷酸序列与序列标签A的核苷酸序列一致，在5’端连接荧光基团A；所述淬灭探针A的核苷酸序列与序列标签A的核苷酸序列反向互补，在3’端连接淬灭基团；所述荧光探针B的核苷酸序列与序列标签B的核苷酸序列一致，在5’端连接荧光基团B；所述淬灭探针B的核苷酸序列与序列标签B的核苷酸序列反向互补，在3’端连接淬灭基团。
所述荧光基团A为FAM，所述荧光基团B为HEX，所述淬灭基团为BHQ。荧光基团与探针的连接采用本领域已知的方法进行。
实施例3、利用核心SNP标记检测待测甘蓝杂交种“晚丰”的纯度
检测方法如下：
1、DNA提取
随机挑取待测“晚丰”杂交种种子96粒，提取DNA。
(1)将种子放于培养皿中催芽5-6d，取子叶和下胚轴；
(2)用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)法提取甘蓝DNA，提取方法参见Murray MG,Thompson WF(1980)Rapid isolation of highmolecular weight plant DNA.Nucleic Acids Res 8:4321-4325。
2、采用KASP技术进行基因分型检测
选择实施例1中编号为Bol02的SNP标记的特异性引物进行检测。将正向引物1(GAAGAAAAGACTACAAGAGGACTGAA)、正向引物2(GAAGAAAAGACTACAAGAGGACTGAG)的5’端分别加上不同的序列标签(适用于英国LGC公司KASP Master mix的序列标签，由该公司添加序列标签)和反向引物(GCAGAGATTCCATGGGTCTCTTGTT)，送上海生工生物工程股份有限公司进行引物合成，用ddH2O将合成的三种引物配制成引物混合液(即KASP Primer mix)，引物混合液中各引物的最终浓度为5nM。
将96粒种子的DNA分别加入96孔板的96个管中，再向每个管中加入KASP Primermix和通用的KASP Master mix，封板后按照如下反应体系和反应条件进行水浴PCR：
PCR反应体系：PCR反应体积为10.14μL，其中包括KASP Master mix 5μL，KASPPrimer mix 0.14μL，模板DNA(20ng/μL)5μL。
PCR反应条件：94℃预变性15min；94℃变性20s，61℃-55℃退火延伸60s，共10个Touch Down循环(每个循环降低0.6℃)；第二轮PCR反应，94℃变性20s，55℃退火延伸60s，共26个循环。
反应结束后，采用荧光微孔板检测仪检测PCR产物，使用SNPviewer读取检测数据。
3、结果分析
通过以上检测，获得96个待测杂交种“晚丰”种子样品在编号为Bol02的SNP标记位点的基因分型结果，统计结果表明：96个样品全部表现为杂合基因型C：T，杂交种纯度为100％。
实施例4、利用9个核心SNP标记鉴定待测甘蓝品种是否为杂交种“8398”
检测方法如下：
挑选市场中购买的甘蓝待测品种与“8398”标准样品种子各10粒，按照实施例3的方法提取DNA，从C01～C09各挑选1个核心SNP标记进行基因分型检测，检测方法及PCR反应同实施例3。
结果分析：待测甘蓝品种与“8398”标准品种在9个SNP位点上的分型结果，如表5所示。结果表明：待测甘蓝品种的分型结果与“8398”在3个SNP位点(Bol36、Bol40、Bol48)不一致，表明待测甘蓝品种不是“8398”。
表5.待测品种与标准样品“8398”在9个SNP位点上的分型结果
| 编号 | 待测品种 | 8398 |
| Bol01 | C:T | C:T |
| Bol06 | G:G | G:G |
| Bol12 | T:T | T:T |
| Bol18 | T:T | T:T |
| Bol24 | G:A | G:A |
| Bol29 | A:A | A:A |
| Bol36 | <u>T:G</u> | T:T |
| Bol40 | <u>A:T</u> | A:A |
| Bol48 | <u>T:T</u> | A:T |
实施例5、利用核心SNP标记鉴定待测甘蓝品种是否为杂交种“中甘21”
检测方法如下：
随机挑选10个待测甘蓝品种与“中甘21”标准样品种子各10粒，按照实施例3的步骤提取DNA，同时针对50个核心SNP标记进行基因分型检测，检测方法及PCR反应同实施例3。
结果分析：通过以上检测，获得待测甘蓝品种与“中甘21”在50个SNP位点上的分型结果，如表6所示。结果表明：待测10个杂交种的分型结果与“中甘21”都表现出差异，表明待测杂交种都不是“中甘21”。
表6.10个待测品种与“中甘21”的基因分型结果
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 基于KASP技术开发的用于甘蓝杂交种鉴定的核心SNP标记及其应用
<130> P170929/SCH
<160> 152
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol01p正向引物1
<400> 1
cctgcaagag agacaaggcc aa 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol01p正向引物2
<400> 2
ctgcaagaga gacaaggcca g 21
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol01p反向引物
<400> 3
cccattctct atgactcact ctccaa 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol02p正向引物1
<400> 4
gaagaaaaga ctacaagagg actgaa 26
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol02p正向引物2
<400> 5
gaagaaaaga ctacaagagg actgag 26
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol02p反向引物
<400> 6
gcagagattc catgggtctc ttgtt 25
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol03p正向引物1
<400> 7
aaataaacat gtgaaattta tatattttgt gac 33
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol03p正向引物2
<400> 8
aaataaacat gtgaaattta tatattttgt gat 33
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol03p反向引物
<400> 9
ccaggcaaat taacctcatt taattttta 29
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol04p正向引物1
<400> 10
caacattatt attaaaataa agaaactgca ggt 33
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol04p正向引物2
<400> 11
aacattatta ttaaaataaa gaaactgcag gc 32
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol04p反向引物
<400> 12
ccgaagcctt agaactcatc tgagta 26
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol05p正向引物1
<400> 13
acaagtcgaa gcagaagaca gtatc 25
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol05p正向引物2
<400> 14
aacaagtcga agcagaagac agtatt 26
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol05p反向引物
<400> 15
cgtgactcga atctgtaaca ttgttctta 29
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol06p正向引物1
<400> 16
tgaagtgacg agatattctg g 21
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol06p正向引物2
<400> 17
cgcttgaagt gacgagatat tctga 25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol06p反向引物
<400> 18
taaagcgaaa gccaacagcg aggtt 25
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol07p正向引物1
<400> 19
cactcattgt ttgacgaact ttatgtga 28
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol07p正向引物2
<400> 20
actcattgtt tgacgaactt tatgtgc 27
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol07p反向引物
<400> 21
ttatgcaaca aacataggag atggctcaa 29
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol08p正向引物1
<400> 22
atcgtggaaa ccaatcagtt tgcg 24
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol08p正向引物2
<400> 23
atatcgtgga aaccaatcag tttgca 26
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol08p反向引物
<400> 24
ggctcctgca cggatcaaat acaat 25
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol09p正向引物1
<400> 25
tgctagagaa gtctcaagaa cac 23
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol09p正向引物2
<400> 26
ccttgctaga gaagtctcaa gaacat 26
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol09p反向引物
<400> 27
gcatcatctg ggctcctctg tttta 25
<210> 28
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol10p正向引物1
<400> 28
tattataata aaaagaacac aagaaataac tg 32
<210> 29
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol10p正向引物2
<400> 29
attataataa aaagaacaca agaaataact a 31
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol10p反向引物
<400> 30
gtcagtttgt gcatccttaa taacacaaat 30
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol11p正向引物1
<400> 31
caacttcagc ttcaatggat tgtcct 26
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol11p正向引物2
<400> 32
aacttcagct tcaatggatt gtccc 25
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol11p反向引物
<400> 33
cacaaatagc agaactgcag aaagcatt 28
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol12p正向引物1
<400> 34
ccacacagac gaacgaactt ttgaa 25
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol12p正向引物2
<400> 35
ccacacagac gaacgaactt ttgat 25
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol12p反向引物
<400> 36
tttacgcagg ggagggtttg gatta 25
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol13p正向引物1
<400> 37
tcttgcactg atggcaagtc aag 23
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol13p正向引物2
<400> 38
gttcttgcac tgatggcaag tcaaa 25
<210> 39
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol13p反向引物
<400> 39
ttgcaggatg ataactctga tggaacaaa 29
<210> 40
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol14p正向引物1
<400> 40
cttcaaaatt aaccaagaaa tatgaacata c 31
<210> 41
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol14p正向引物2
<400> 41
cttcaaaatt aaccaagaaa tatgaacata g 31
<210> 42
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol14p反向引物
<400> 42
gttatctccc taatctgtta tctcctcta 29
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol15p正向引物1
<400> 43
gtcgttgatt aaggtaggag aagc 24
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol15p正向引物2
<400> 44
gtcgttgatt aaggtaggag aagt 24
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol15p反向引物
<400> 45
ctgatttcct cctcggaacc aacat 25
<210> 46
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol16p正向引物1
<400> 46
gacacatcgt attctgagga tgaag 25
<210> 47
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol16p正向引物2
<400> 47
aagacacatc gtattctgag gatgaat 27
<210> 48
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol16p反向引物
<400> 48
ccactgatca tacagttcac agtacttt 28
<210> 49
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol17p正向引物1
<400> 49
attaagttat tcttaaaact cacacattag tag 33
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol17p正向引物2
<400> 50
aagttattct taaaactcac acattagtac 30
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol17p反向引物
<400> 51
ccaatcttag agataatata gcccatgatt 30
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol18p正向引物1
<400> 52
atcgaagtta ttggtggctg taagg 25
<210> 53
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol18p正向引物2
<400> 53
gatcgaagtt attggtggct gtaaga 26
<210> 54
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol18p反向引物
<400> 54
tctttggaac atcatctcta cgtaccttt 29
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol19p正向引物1
<400> 55
atccttgcac aaggtccttg cg 22
<210> 56
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol19p正向引物2
<400> 56
aaatccttgc acaaggtcct tgca 24
<210> 57
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol19p反向引物
<400> 57
aacaatttcg agagtgatcc tgaggaatt 29
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol20p正向引物1
<400> 58
ggttgaggat tactctgagg ctc 23
<210> 59
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol20p正向引物2
<400> 59
ggttgaggat tactctgagg cta 23
<210> 60
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol20p反向引物
<400> 60
caacagtgat ctcttcacct cctgaa 26
<210> 61
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol21p正向引物1
<400> 61
gtcatcagtc cacgctggaa tg 22
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol21p正向引物2
<400> 62
gtcatcagtc cacgctggaa tc 22
<210> 63
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol21p反向引物
<400> 63
gatggtagac tccagacgag ttctt 25
<210> 64
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol22p正向引物1
<400> 64
atgagcaata ttagtaatca aagtcatgc 29
<210> 65
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol22p正向引物2
<400> 65
gatgagcaat attagtaatc aaagtcatga 30
<210> 66
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol22p反向引物
<400> 66
ctgctctcga tggtatgcaa tagtttaaa 29
<210> 67
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol23p正向引物1
<400> 67
aggattgaga tggctcgaaa ataagat 27
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol23p正向引物2
<400> 68
gagatggctc gaaaataaga c 21
<210> 69
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol23p反向引物
<400> 69
cgaaatcaag gtacctacta ctttgctaa 29
<210> 70
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol24p正向引物1
<400> 70
tatatctttt tggtcaaaag tttatgcatt aa 32
<210> 71
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol24p正向引物2
<400> 71
atatcttttt ggtcaaaagt ttatgcatta g 31
<210> 72
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol24p反向引物
<400> 72
ccatgtccta atcaaaagaa tcaaatccaa 30
<210> 73
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol25p正向引物1
<400> 73
gtttttgtgt ggttcgtctg gtca 24
<210> 74
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol25p正向引物2
<400> 74
gtttttgtgt ggttcgtctg gtct 24
<210> 75
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol25p反向引物
<400> 75
agatacaata gagcccccac atttgtaat 29
<210> 76
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol26p正向引物1
<400> 76
caatttttag tgatatacca aagtctgctt t 31
<210> 77
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol26p正向引物2
<400> 77
aatttttagt gatataccaa agtctgcttc 30
<210> 78
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol26p反向引物
<400> 78
gacatcatta tagctttcac tgatgttgtt 30
<210> 79
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol27p正向引物1
<400> 79
caaataaaga cttgttcaac ctcctatc 28
<210> 80
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol27p正向引物2
<400> 80
acaaataaag acttgttcaa cctcctata 29
<210> 81
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol27p反向引物
<400> 81
ggtctgagtt tgaataagtc cccctt 26
<210> 82
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol28p正向引物1
<400> 82
gagctaacta cctcgattat ttatttattt at 32
<210> 83
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol28p正向引物2
<400> 83
gagctaacta cctcgattat ttatttattt ag 32
<210> 84
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol28p反向引物
<400> 84
ctgttggctt ctaccaggta aattcaata 29
<210> 85
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol29p正向引物1
<400> 85
tattactatt ttgttcattt gtttatttta a 31
<210> 86
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol29p正向引物2
<400> 86
cttattacta ttttgttcat ttgtttattt tat 33
<210> 87
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol29p反向引物
<400> 87
cactttttaa catgtacaaa atggaaaatt 30
<210> 88
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol30p正向引物1
<400> 88
agagttaatt aatacaataa atagtaaatt tca 33
<210> 89
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol30p正向引物2
<400> 89
agagttaatt aatacaataa atagtaaatt tcg 33
<210> 90
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol30p反向引物
<400> 90
ggtcatccga ttatattgat tacggttaat 30
<210> 91
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol31p正向引物1
<400> 91
tcaacgtaaa caaacaaaca ttcacatca 29
<210> 92
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol31p正向引物2
<400> 92
caacgtaaac aaacaaacat tcacatcg 28
<210> 93
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol31p反向引物
<400> 93
ctctctcttt ctctctgtat attcacaaaa 30
<210> 94
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol32p正向引物1
<400> 94
ccacctcttc taggagatgc atg 23
<210> 95
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol32p正向引物2
<400> 95
ccacctcttc taggagatgc ata 23
<210> 96
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol32p反向引物
<400> 96
agccccgacg tgatcatcgc aa 22
<210> 97
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol33p正向引物1
<400> 97
gtccaaatcc catggaaata tttgaaaa 28
<210> 98
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol33p正向引物2
<400> 98
gtccaaatcc catggaaata tttgaaat 28
<210> 99
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol33p反向引物
<400> 99
atcatcattt cacgaccgtt gttggttt 28
<210> 100
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol34p正向引物1
<400> 100
gtgtatgtat taatgagtca acacatcc 28
<210> 101
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol34p正向引物2
<400> 101
gtgtatgtat taatgagtca acacatcg 28
<210> 102
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol34p反向引物
<400> 102
ggaattggtc aaaccactaa tttgattgta 30
<210> 103
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol35p正向引物1
<400> 103
agccgcctag tttatgtcgt ctt 23
<210> 104
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol35p正向引物2
<400> 104
gccgcctagt ttatgtcgtc tc 22
<210> 105
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol35p反向引物
<400> 105
ggcttatcgg cccagcgagt ta 22
<210> 106
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol36p正向引物1
<400> 106
aagaattatt accatttaca ttattatgtg atg 33
<210> 107
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol36p正向引物2
<400> 107
aagaattatt accatttaca ttattatgtg att 33
<210> 108
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol36p反向引物
<400> 108
gtgcaacaca aatatacagg attagctgaa 30
<210> 109
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol37p正向引物1
<400> 109
aaatttaaag aggcgattgt ggccaa 26
<210> 110
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol37p正向引物2
<400> 110
aatttaaaga ggcgattgtg gccag 25
<210> 111
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol37p反向引物
<400> 111
gaacacaata cgtaaccata attctctgat 30
<210> 112
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol38p正向引物1
<400> 112
cctttaatga gttgaatcaa atggtgaa 28
<210> 113
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol38p正向引物2
<400> 113
cctttaatga gttgaatcaa atggtgat 28
<210> 114
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol38p反向引物
<400> 114
gaacttcaga aggatcaacg ttgtagaaa 29
<210> 115
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol39p正向引物1
<400> 115
atgcctcttc tctctttctc ctgaa 25
<210> 116
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol39p正向引物2
<400> 116
gcctcttctc tctttctcct gag 23
<210> 117
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol39p反向引物
<400> 117
gaaactaaaa gtgacacacg gaagatgtt 29
<210> 118
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol40p正向引物1
<400> 118
gaggttatca tcttgacctt accata 26
<210> 119
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol40p正向引物2
<400> 119
gaggttatca tcttgacctt accatt 26
<210> 120
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol40p反向引物
<400> 120
agctacaaaa ctccgtcaaa aacgcttat 29
<210> 121
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol41p正向引物1
<400> 121
gtcaaatggg ctatagatca ttagactta 29
<210> 122
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol41p正向引物2
<400> 122
caaatgggct atagatcatt agacttg 27
<210> 123
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol41p反向引物
<400> 123
gaaactgttt ctttgcatct gccaacaaa 29
<210> 124
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol42p正向引物1
<400> 124
accagtggat gtttctgatg gga 23
<210> 125
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol42p正向引物2
<400> 125
ccagtggatg tttctgatgg gg 22
<210> 126
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol42p反向引物
<400> 126
gctggagaga tattggcatt ctttagttt 29
<210> 127
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol43p正向引物1
<400> 127
aatatgatct acaacgcgct gcc 23
<210> 128
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol43p正向引物2
<400> 128
gaatatgatc tacaacgcgc tgct 24
<210> 129
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol43p反向引物
<400> 129
gttgaaggga cataagtgtt ccatactt 28
<210> 130
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol44p正向引物1
<400> 130
gagaaggagc tctctggtct a 21
<210> 131
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol44p正向引物2
<400> 131
gagaaggagc tctctggtct g 21
<210> 132
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol44p反向引物
<400> 132
tgataacacg gagaaatcag ggggt 25
<210> 133
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol45p正向引物1
<400> 133
actatagaaa gtgtctatac taattagagt ta 32
<210> 134
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol45p正向引物2
<400> 134
ctatagaaag tgtctatact aattagagtt c 31
<210> 135
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol45p反向引物
<400> 135
tggtttgaat gaagatcgct aaagtaaata 30
<210> 136
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol46p正向引物1
<400> 136
gggtcttcga cgtttgtttc ttga 24
<210> 137
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol46p正向引物2
<400> 137
ggtcttcgac gtttgtttct tgc 23
<210> 138
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol46p反向引物
<400> 138
aacagagaaa caagagagtt ccattccaa 29
<210> 139
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol47p正向引物1
<400> 139
aaataaaaga agtttgatga agatggggt 29
<210> 140
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol47p正向引物2
<400> 140
aaataaaaga agtttgatga agatgggga 29
<210> 141
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol47p反向引物
<400> 141
tttaatggtt ttccttctgt gccttatcaa 30
<210> 142
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol48p正向引物1
<400> 142
atttacattg ttacaaaatc aatctcacag ttt 33
<210> 143
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol48p正向引物2
<400> 143
tacattgtta caaaatcaat ctcacagtta 30
<210> 144
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol48p反向引物
<400> 144
caagctaaag cacccactat gaaattgat 29
<210> 145
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol49p正向引物1
<400> 145
ccaaaatgac atgattggct caaaatttt 29
<210> 146
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol49p正向引物2
<400> 146
ccaaaatgac atgattggct caaaatttc 29
<210> 147
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol49p反向引物
<400> 147
gcaaagcagt taaggcaatt aacaacgaa 29
<210> 148
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol50p正向引物1
<400> 148
caaacttctt gagatctctg gtcc 24
<210> 149
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol50p正向引物2
<400> 149
ccaaacttct tgagatctct ggtca 25
<210> 150
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bol50p反向引物
<400> 150
tgatgagtca ccacgtcgac aacat 25
<210> 151
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 序列标签A
<400> 151
gaaggtgacc aagttcatgc t 21
<210> 152
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 序列标签B
<400> 152
gaaggtcgga gtcaacggat t 21
Claims (9)
1.基于KASP技术开发的用于甘蓝杂交种鉴定的核心SNP分子标记的组合，其特征在于，该组合由编号为Bol01～Bol50的SNP分子标记组成，其具体信息如下：
所述SNP物理位置是基于甘蓝自交系02-12的全基因组序列而确定的，所述甘蓝自交系02-12的全基因组序列在NCBI数据库中的序列号为KR233156。
2.用于扩增权利要求1所述核心SNP分子标记的引物组合，其特征在于，由编号为Bol01p～Bol50p的引物组组成，其引物序列信息如下：
3.用于鉴定或辅助鉴定甘蓝杂交种的试剂盒，其特征在于，包含粉末状的或液态的权利要求2所述的引物组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，每一组引物中的两条正向引物的5’端分别带有序列标签A和序列标签B，所述序列标签A和序列标签B的核苷酸序列互不相同并且与甘蓝基因组序列不同源。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包含PCR预混液，所述PCR预混液含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；
所述荧光探针A的核苷酸序列与序列标签A的核苷酸序列一致，其5’端连接荧光基团A；所述淬灭探针A的核苷酸序列与序列标签A的核苷酸序列反向互补，其3’端连接淬灭基团；
所述荧光探针B的核苷酸序列与序列标签B的核苷酸序列一致，其5’端连接荧光基团B；所述淬灭探针B的核苷酸序列与序列标签B的核苷酸序列反向互补，其3’端连接淬灭基团；
所述PCR预混液还包含ROX内参染料，KlearTaq DNA聚合酶，dNTP和MgCl2。
6.权利要求1所述的核心SNP分子标记的组合或权利要求2所述的引物组合或权利要求3～5任一所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定甘蓝杂交种中的应用。
7.用于鉴定或辅助鉴定甘蓝杂交种的方法，其特征在于，对待测甘蓝品种进行SNP分型检测，包括以下步骤：
(1)提取待测甘蓝品种的DNA；
(2)以权利要求2所述的引物组合中的每一组引物分别对待测甘蓝品种的DNA进行PCR扩增；
(3)检查扩增结果，确定待测甘蓝品种在每一组引物对应的SNP分子标记位点的基因型。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述对待测甘蓝品种进行SNP分型检测采用KASP检测法，所述KASP检测法包括：
(1)向待测甘蓝品种的DNA中加入引物混合液和PCR预混液，进行KASP扩增；
(2)采用荧光检测仪检测PCR产物，确定待测甘蓝品种在每一组引物对应的SNP分子标记位点的基因型；
所述引物混合液由权利要求2所述引物组合中同一引物组的正向引物1、正向引物2和反向引物构成，两条正向引物的5’端分别带有序列标签A和序列标签B，所述序列标签A和序列标签B的核苷酸序列互不相同并且与甘蓝基因组序列不同源；
所述PCR预混液含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，ROX内参染料，KlearTaq DNA聚合酶，dNTP和MgCl2；
所述荧光探针A的核苷酸序列与序列标签A的核苷酸序列一致，其5’端连接荧光基团A；所述淬灭探针A的核苷酸序列与序列标签A的核苷酸序列反向互补，其3’端连接淬灭基团；
所述荧光探针B的核苷酸序列与序列标签B的核苷酸序列一致，其5’端连接荧光基团B；所述淬灭探针B的核苷酸序列与序列标签B的核苷酸序列反向互补，其3’端连接淬灭基团。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
所述PCR的反应体系为：PCR预混液5μL；引物混合液0.14μL，其中各引物的终浓度均为5nM；20ng/μL模板DNA 5μL；
所述PCR的反应条件为：94℃预变性15min；94℃变性20s，61-55℃退火延伸60s，每个循环的退火温度降低0.6℃，共10个循环；94℃变性20s，55℃退火延伸60s，共26个循环。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810030833.0A CN108103162B (zh) | 2018-01-12 | 2018-01-12 | 基于kasp技术开发的用于甘蓝杂交种鉴定的核心snp标记及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810030833.0A CN108103162B (zh) | 2018-01-12 | 2018-01-12 | 基于kasp技术开发的用于甘蓝杂交种鉴定的核心snp标记及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108103162A CN108103162A (zh) | 2018-06-01 |
| CN108103162B true CN108103162B (zh) | 2021-06-29 |
Family
ID=62219926
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810030833.0A Active CN108103162B (zh) | 2018-01-12 | 2018-01-12 | 基于kasp技术开发的用于甘蓝杂交种鉴定的核心snp标记及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108103162B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109593871A (zh) * | 2018-12-27 | 2019-04-09 | 江苏省农业科学院 | 用于区分玉米杂种优势群的玉米kasp分子标记组合及其开发方法和应用 |
| CN110205398B (zh) * | 2019-06-11 | 2022-07-12 | 四川农业大学 | 一种检测小麦高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基的KASP标记引物及应用 |
| CN111676295A (zh) * | 2020-05-28 | 2020-09-18 | 浙江省农业科学院 | 一种采食量调控相关基因的研究方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107164502A (zh) * | 2017-06-15 | 2017-09-15 | 西南大学 | 与甘蓝叶片表皮毛有无紧密相关的分子标记及其应用 |
| KR20170136219A (ko) * | 2016-06-01 | 2017-12-11 | 대한민국(농촌진흥청장) | 배추 여교배 분석용 단일염기다형성 탐침 |
-
2018
- 2018-01-12 CN CN201810030833.0A patent/CN108103162B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170136219A (ko) * | 2016-06-01 | 2017-12-11 | 대한민국(농촌진흥청장) | 배추 여교배 분석용 단일염기다형성 탐침 |
| CN107164502A (zh) * | 2017-06-15 | 2017-09-15 | 西南大学 | 与甘蓝叶片表皮毛有无紧密相关的分子标记及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "芸薹属蔬菜低深度测序SNP分型及其应用";付丽霞;《农业科技辑》;20170215(第02期);第6页第1-3段、第8页末段、第18页第1-9段、第23页第1段、第24页第1-2段 * |
| Mapping and analysis of a novel candidate Fusarium wilt resistance gene FOC1 in Brassica oleracea;Lv et al.;《BMC Genomics》;20141230;第1-10页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108103162A (zh) | 2018-06-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107385024B (zh) | 水稻育性恢复基因辅助育种分子标记及其应用 | |
| CN112626257B (zh) | 一套检测向日葵品种纯度的snp分子标记及其应用 | |
| CN108103162B (zh) | 基于kasp技术开发的用于甘蓝杂交种鉴定的核心snp标记及其应用 | |
| CN111850158B (zh) | 用于普通小麦常规种品种纯度鉴定的特异性snp位点组合以及鉴定方法 | |
| CN110295248A (zh) | 用于检测大白菜蜡粉性状的kasp分子标记及其应用 | |
| CN111411168B (zh) | 一种用于培育优质小麦的亲本品种的筛选方法及其使用的引物组组合 | |
| CN107746896B (zh) | 与桃果皮绒毛性状相关的snp标记及其应用 | |
| CN115094156A (zh) | 水稻耐高温基因tt1的kasp标记开发及其应用 | |
| CN113249510B (zh) | 一种用于鉴定莴苣杂交种真实性的方法及其使用的kasp引物组合 | |
| CN110878376B (zh) | 用于鉴定霍山石斛的ssr分子标记引物及其应用 | |
| CN109706247B (zh) | 利用微卫星技术对近交系小鼠进行遗传质量监测的方法 | |
| CN114606335A (zh) | 玉米抗甘蔗花叶病毒病基因的kasp分子标记的开发及应用 | |
| CN115505648A (zh) | 玉米耐旱基因的kasp分子标记的开发及应用 | |
| CN108315396B (zh) | 一种简单便捷检测snp的新方法 | |
| CN114395639B (zh) | 用于鉴定水稻品系纯度的snp分子标记组合及其应用 | |
| CN113637790B (zh) | 抗条锈病基因YrAS2388R的KASP分子标记及引物、试剂盒和应用 | |
| CN114107555B (zh) | 一种检测小麦品种纯度的snp分子标记组合及其应用 | |
| CN111363792B (zh) | 基于共享性引物探针检测基因多态性的试剂盒、方法及应用 | |
| CN113736908B (zh) | 用于检测番茄叶霉病抗性的snp位点组合及其应用 | |
| CN106244713A (zh) | 一种检测北京油鸡五趾性状的方法及应用 | |
| CN117604146A (zh) | 一种用于番茄品种鉴定的snp位点组合及其应用 | |
| CN114015797A (zh) | 玉米紫色叶鞘基因的kasp分子标记的开发及应用 | |
| CN113913546A (zh) | 玉米s型胞质不育基因kasp分子标记的开发及应用 | |
| CN114032322A (zh) | 玉米花期基因的snp分子标记的开发及应用 | |
| CN117867155A (zh) | 一种与油茶光合表型叶绿素含量相关的snp分子标记及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20231224 Address after: 100081 No. 12 South Main Street, Haidian District, Beijing, Zhongguancun Patentee after: CHINA VEGETABLE SEED TECHNOLOGY CO.,LTD. (BEIJING) Address before: 100081 No. 12 South Main Street, Haidian District, Beijing, Zhongguancun Patentee before: INSTITUTE OF VEGETABLES AND FLOWERS CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES |