CN114015797A - 玉米紫色叶鞘基因的kasp分子标记的开发及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了玉米紫色叶鞘基因的KASP分子标记的开发及应用，属于生物技术领域。它包括检测待测玉米的基因型，根据待测玉米的基因型鉴定或辅助鉴定玉米紫色叶鞘；所述基因型为玉米基因组中KASP_PSH位点的基因型。本发明提供了一种玉米紫色叶鞘基因PSH紧密连锁的KASP标记开发与应用，所述分子标记是与玉米紫色叶鞘基因PSH紧密连锁的KASP标记KASP_PSH。该标记基于KASP技术开发，可高通量检测玉米基因组10号染色体的第141195255位碱基。本发明应用KASP技术对玉米紫色叶鞘基因PSH进行基因型鉴定，具有操作简便、成本低廉、检测周期短、标记稳定、绿色环保等优点，可精准检测玉米紫色叶鞘基因PSH，对促进玉米紫色叶鞘育种具有重要意义。

Description

玉米紫色叶鞘基因的KASP分子标记的开发及应用
技术领域
本发明涉及玉米紫色叶鞘基因的KASP分子标记的开发及应用，属于生物技术领域。
背景技术
叶鞘颜色是玉米的基本特征之一，也是指导玉米育种的重要形态标记，广泛应用于品种纯度、真实性鉴定和苗期去杂等。此外，紫色叶鞘总含有的花青素还具有营养保健等作用。因此，选育紫色叶鞘玉米品种具有很高的实用价值(王静.一个玉米白色叶鞘突变体的鉴定与基因初步定位[D].四川农业大学,2012.)。
目前，已报道克隆了部分叶鞘颜色控制基因，如PSH基因、MYB转录因子、bHLH转录因子等。同时，也开发了与基因连锁的分子标记，通过分子标记辅助选择技术(Marker-assisted Selection，MAS)进行玉米叶鞘颜色改良育种，弥补了传统育种中出现的诸多弊端，成为解决品种选育难这一问题的有效途径。
然而，玉米紫色叶鞘相关基因的连锁标记虽然可以用于分子标记辅助选择，但多为CAPS标记、SSR标记、InDel标记或酶切标记，检测效率低，同时还可能会产生气溶胶污染环境，不适用于高通量的分子检测平台。因此，开发低成本、可高通量检测的分子标记是促进玉米紫色叶鞘基因鉴定、增加紫色叶鞘育种准确度与提高育种效率的迫切需求。
KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)通过荧光探针特异性识别基因位点达到基因分型的效果，可快速检测SNP位点。与SSR、RFLP、InDel等分子标记相比，KASP标记具有检测快速，成本低，易于规模化应用等特点，KASP标记不需要根据DNA片段大小进行分型，能够摆脱传统凝胶电泳这种步骤相对繁琐，低通量，价格又较贵的检测方法，更加适用于现阶段飞速发展的高通量分子检测平台。因此，开发低成本、适合于高通量分子检测平台的玉米紫色叶鞘基因KASP分子标记对于推广普及分子标记技术的应用、提高我国玉米紫色叶鞘育种效率和育种水平具有重要意义。
发明内容
本发明针对上述背景技术所提及的技术问题，而采用以下技术方案来实现：
玉米紫色叶鞘基因的KASP分子标记的开发方法，包括检测待测玉米的基因型，根据待测玉米的基因型鉴定或辅助鉴定玉米紫色叶鞘；所述基因型为玉米基因组中KASP_PSH位点的基因型；所述KASP_PSH位点是玉米基因组中的一个SNP位点，位于玉米10号染色体的第141195255位，所述SNP位点是核苷酸种类为A或者G，为SEQ ID No.4的第101位核苷酸；
所述KASP_PSH位点的基因型为AA基因型或AG基因型的待测玉米为紫色叶鞘或者候选为紫色叶鞘玉米；所述KASP_PSH位点的基因型为GG基因型的待测玉米为绿色叶鞘或者候选为绿色叶鞘玉米；其中，所述GG基因型表示玉米基因组中所述KASP_PSH位点的核苷酸种类为G的纯合型；所述AA基因型表示玉米基因组中所述KASP_PSH位点的核苷酸种类为A的纯合型；所述AG基因型表示玉米基因组中所述KASP_PSH位点的核苷酸种类为A和G的杂合型。
玉米紫色叶鞘基因的KASP分子标记的开发方法而提出的应用，所述应用包括以下几个方面：
1)、所述KASP_PSH位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定玉米紫色叶鞘中的应用；
2)、所述KASP_PSH位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定玉米紫色叶鞘的产品中的应用；
3)、所述KASP_PSH位点的多态性或基因型的物质在玉米辅助育种或制备玉米辅助育种产品中的应用。
玉米紫色叶鞘基因的KASP分子标记的开发方法而提出的玉米育种方法，包括以下步骤，
选择所述KASP_PSH位点的基因型为AA或者基因型为AG的玉米作为亲本进行育种，所述AA基因型表示玉米基因组中所述KASP_PSH位点的核苷酸种类为A的纯合型；所述AG基因型表示玉米基因组中所述KASP_PSH位点的核苷酸种类为A和G的杂合型；所述玉米育种可为培育紫色叶鞘玉米。
1.玉米紫色叶鞘基因的KASP分子标记的开发方法而生产出的产品，其特征在于，主要包括以下几种产品，
S1、检测与玉米紫色叶鞘相关的SNP多态性或基因型的产品；
S2、鉴定或辅助鉴定玉米紫色叶鞘的产品；
S3、用于玉米辅助育种的产品。
作为优先实例，所述KASP_PSH位点的多态性或基因型的物质为如下D1)、D2)或D3)：
D1)、所述KASP_PSH位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括所述KASP_PSH位点在内的玉米基因组DNA片段的PCR引物；
D2)、所述KASP_PSH位点的多态性或基因型的物质为含有所述PCR引物的PCR试剂；
D3)、含有D1)所述PCR引物或D2)所述PCR试剂的试剂盒。
作为优选实例，所述PCR引物为由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的第22-39位的单链DNA、核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第22-39位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的单链DNA组成的引物组。
作为优选实例，所述PCR引物为由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA、序列表中SEQ ID No.2所示的单链DNA和由序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA的引物组。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种玉米紫色叶鞘基因PSH紧密连锁的KASP标记开发与应用，所述分子标记是与玉米紫色叶鞘基因PSH紧密连锁的KASP标记KASP_PSH。该标记基于KASP技术开发，可高通量检测玉米基因组10号染色体的第141195255位碱基。本发明应用KASP技术对玉米紫色叶鞘基因PSH进行基因型鉴定，具有操作简便、成本低廉、检测周期短、标记稳定、绿色环保等优点，可精准检测玉米紫色叶鞘基因PSH，对促进玉米紫色叶鞘育种具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1利用分子标记KASP_PSH检测8份测试玉米品种材料的分型图，
图2为实施例2利用分子标记KASP_PSH检测48份F2测试群体的分型图，其中，FAM表示基因型为AA，VIC表示基因型为GG，H表示基因型为AG。
图中：其中，图1中，FAM表示基因型为AA，VIC表示基因型为GG，H表示基因型为AG；
图2中，FAM表示基因型为AA，VIC表示基因型为GG，H表示基因型为AG。
具体实施方式
为了对本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
如图1-2所示，下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的玉米品种均可从商业途径得到。
本发明的发明人通过文献挖掘到一个与玉米紫色叶鞘相关的SNP位点(杜灿灿.玉米紫色叶鞘基因的定位及其候选基因预测[D].扬州大学,2016.)，该位点锚定在玉米10号染色体的第141195255位(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_902167145.1/，基因组版本Zm-B73-REFERENCE-NAM-5.0)，该SNP侧翼序列如SEQ ID No.4所示。KASP_PSH位于SEQ ID No.4的第101位，该处的核苷酸序列为G或A。
下述GG基因型表示KASP_PSH的核苷酸序列为G的纯合型；AA基因型表示KASP_PSH的核苷酸序列为A的纯合型；AG基因型表示KASP_PSH的核苷酸种类为A和G的杂合型。
实施例1与玉米紫色叶鞘相关基因PSH紧密连锁KASP标记开发
1.引物的设计：根据KASP_PSH位点提取左右各100bp的侧翼序列，优选利用Primer5.0软件设计3组KASP引物。利用Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测后，挑选出1套多态性良好的KASP引物用于后续验证。
用于检测KASP_PSH的KASP引物具体如下：
Primer X：5’-gaaggtcggagtcaacggattCAGGCGCTACCACTACCG-3’(SEQ ID No.1，小写字母部分为特异荧光标签序列VIC)；
Primer Y：5’-gaaggtgaccaagttcatgctCAGGCGCTACCACTACCA-3’(SEQ ID No.2，小写字母部分为特异荧光标签序列FAM)；
Primer R：5’-GGTCCAGCCGTCCTCTAG-3’(SEQ ID No.3)。
2.DNA提取：采用常规CTAB法从玉米叶片中提取基因组DNA。
3.KASP反应测试
KASP标记扩增及反应体系：
(1)荧光定量PCR仪AB-Q6 Flex检测：
5μL PCR荧光定量仪检测反应体系包括：基因组DNA 50ng，引物混液0.07μL(优选引物混液配比：正向引物Primer X、Primer Y 100pmol·L-1各12μL，反向引物Primer R100pmol·L-1 30μL，ddH2O 46μL，使用其他合理的引物混液配比也可以达到相同的检测目的)，LGC公司2×KASP Mix(Low Rox)2.5μL。按照荧光定量PCR仪AB-Q6仪器操作手册，编辑样品表，执行运行程序，保存数据。
以上反应体系为AB-Q6 Flex的优选反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。
(2)选择Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测
1.6μL PCR ArrayTape平台检测反应体系包括：含基因组DNA 50ng/μL0.8μL，引物混液0.03μL(优选引物混液配比：正向引物Primer X、Primer Y 100pmol·L-1各12μL，反向引物Primer R 100pmol·L-1 30μL,ddH2O 46μL，使用其他合理的引物混液配比也可以达到相同的检测目的)，LGC公司2×KASP Mix(Std Rox)0.8μL。根据ArrayTape平台仪器操作手册，编写样品表，运行程序，读取数据。
以上反应体系为Douglas Scientific公司ArrayTape平台的优选反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。
注：以上为推荐检测方法，其他能够达到相同检测目的的检测方法也可以应用到上述标记的分子标记辅助育种过程中。
其中，2×KASP Mix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真Taq酶，dNTP，Mg2+等组成。荧光探针A的核苷酸序列为：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，5’末端连接一个VIC荧光基团；荧光探针B的核苷酸序列为：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，其5’端连接一个FAM荧光基团；淬灭探针A的核苷酸序列为：5’-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3’，其3’端连接一个淬灭基团BHQ；淬灭探针B的核苷酸序列为：5’-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3’，其3’端连接一个淬灭基团BHQ。
扩增程序：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55-62℃(优选55℃)退火60s，设置40个循环。
实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC)，每个板设置1个或多个空白对照。
对扫描数据进行分析，然后按照如下确定待测玉米基因组中KASP_PSH位点的基因型(即检测玉米基因组10号染色体的第141195255位碱基是A还是G)，若所述待测玉米的扩增产物的荧光信号数据经Douglas基因分型软件分析靠近X轴(VIC信号)，则待测玉米基因组中KASP_PSH位点的基因型为GG纯合型(即玉米基因组10号染色体的第141195255位碱基为G纯合型)；若待测玉米的扩增产物的荧光信号数据经Douglas基因分型软件分析靠近Y轴(FAM信号)，则待测玉米基因组中KASP_PSH位点的基因型为AA纯合型(即玉米基因组10号染色体的第141195255位碱基为A纯合型)；若待测玉米的扩增产物的荧光信号数据经Douglas基因分型软件分析位于X轴和Y轴中间(VIC和FAM信号)，则待测玉米基因组中KASP_PSH位点的基因型为AG杂合型(即玉米基因组第10号染色体的第141195255位碱基为AG杂合型)。左下角显示为黑色的样本为空白对照。
5.标记分型数据分析
为了验证KASP_PSH标记的可靠性，对8份玉米材料进行田间鉴定，获得材料的田间紫色叶鞘数据。材料基因型采用Douglas Scientific公司ArrayTape平台进行检测，检测方法、反应体系以及扩增程序按照上述优选方案实行。
扩增结果表明，KASP_PSH标记在8份材料中能够获得稳定的PCR产物，并且能够检测到G和A两个等位位点(图1)。一份紫色叶鞘玉米材料均为AA基因型，七份绿色叶鞘玉米材料均为GG基因型。由此，可看出KASP_PSH标记可用于不同紫色叶鞘玉米的选育工作。
因此，本发明所述的KASP_PSH标记可用于玉米紫色叶鞘相关基因PSH的分子标记辅助育种。
表1. 8份测试玉米材料的叶鞘颜色与基因型信息
材料名称 叶鞘颜色 基因型 材料名称 叶鞘颜色 基因型
昌7-2 绿色 GG 郑58 绿色 GG
京724 绿色 GG Mo17 绿色 GG
黄早四 绿色 GG DH4866 绿色 GG
T877 紫色 AA B73 绿色 GG
注：GG，基因型为G的纯合型；AA，基因型为A的纯合型；AG，基因型为G和A的杂合型；‘*’表示无检测信号。
实施例2与玉米紫色叶鞘相关基因PSH紧密连锁的KASP标记在分子标记辅助选择玉米紫色叶鞘植株中的应用
为检测本发明KASP_PSH标记的实用性，将表1所述的玉米紫色叶鞘材料T877(作为父本)与玉米绿色叶鞘材料郑58(作为母本)杂交配制F2分离群体，对F2分离群体进行KASP标记检测和田间紫色叶鞘统计(检测结果见图2、表2)，标记检测和紫色叶鞘鉴定实施方法参考实施例1。通过对分离群体的紫色叶鞘与基因型进行统计分析，仅4株材料表型与基因型不符，表型与基因型的一致性P＝91.67％(一致性P＝表型与基因型相符的植株数/总植株数*100％)。上述结果表明标记KASP_PSH在玉米紫色叶鞘植株筛选中具有较高的实用性。
表2.玉米分离群体的表型与基因型信息
Figure BDA0003344277300000091
Figure BDA0003344277300000101
注：GG，基因型为G的纯合型；AA，基因型为A的纯合型；AG，基因型为G和A的杂合型；‘*’表示无检测信号。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 连云港市农业科学院
<120> 玉米紫色叶鞘基因的KASP分子标记的开发及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 201
<212> DNA
<213> 玉米(Zea mays)
<400> 1
aggccctgtc agacgacgca agcctggagc acatcaccaa ggagatcgag gagttctaca 60
gcctctgcga cgaaatggac ctgcaggcgc taccactacc actagaggac ggctggaccg 120
tggacgcgtc caatttcgag gtcccctgct cttccccgca gccagcgccg cctccggtgg 180
acagggctac cgctaacgtc g 201
<210> 2
<211> 201
<212> DNA
<213> 玉米(Zea mays)
<400> 2
aggccctgtc agacgacgca agcctggagc acatcaccaa ggagatcgag gagttctaca 60
gcctctgcga cgaaatggac ctgcaggcgc taccactacc gctagaggac ggctggaccg 120
tggacgcgtc caatttcgag gtcccctgct cttccccgca gccagcgccg cctccggtgg 180
acagggctac cgctaacgtc g 201

Claims (7)

1.玉米紫色叶鞘基因的KASP分子标记的开发方法，其特征在于：包括检测待测玉米的基因型，根据待测玉米的基因型鉴定或辅助鉴定玉米紫色叶鞘；所述基因型为玉米基因组中KASP_PSH位点的基因型；所述KASP_PSH位点是玉米基因组中的一个SNP位点，位于玉米10号染色体的第141195255位，所述SNP位点是核苷酸种类为A或者G，为SEQ ID No.4的第101位核苷酸；
所述KASP_PSH位点的基因型为AA基因型或AG基因型的待测玉米为紫色叶鞘或者候选为紫色叶鞘玉米；所述KASP_PSH位点的基因型为GG基因型的待测玉米为绿色叶鞘或者候选为绿色叶鞘玉米；其中，所述GG基因型表示玉米基因组中所述KASP_PSH位点的核苷酸种类为G的纯合型；所述AA基因型表示玉米基因组中所述KASP_PSH位点的核苷酸种类为A的纯合型；所述AG基因型表示玉米基因组中所述KASP_PSH位点的核苷酸种类为A和G的杂合型。
2.根据权利要求1所述的玉米紫色叶鞘基因的KASP分子标记的开发方法而提出的应用，其特征在于，所述应用包括以下几个方面：
1）、所述KASP_PSH位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定玉米紫色叶鞘中的应用；
2）、所述KASP_PSH位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定玉米紫色叶鞘的产品中的应用；
3）、所述KASP_PSH位点的多态性或基因型的物质在玉米辅助育种或制备玉米辅助育种产品中的应用。
3.根据权利要求1所述的玉米紫色叶鞘基因的KASP分子标记的开发方法而提出的玉米育种方法，其特征在于：包括以下步骤，
选择所述KASP_PSH位点的基因型为AA或者基因型为AG的玉米作为亲本进行育种，所述AA基因型表示玉米基因组中所述KASP_PSH位点的核苷酸种类为A的纯合型；所述AG基因型表示玉米基因组中所述KASP_PSH位点的核苷酸种类为A和G的杂合型；所述玉米育种可为培育紫色叶鞘玉米。
4.根据权利要求1所述的玉米紫色叶鞘基因的KASP分子标记的开发方法而生产出的产品，其特征在于，主要包括以下几种产品，
S1、检测与玉米紫色叶鞘相关的SNP多态性或基因型的产品；
S2、鉴定或辅助鉴定玉米紫色叶鞘的产品；
S3、用于玉米辅助育种的产品。
5.根据权利要求2所述的玉米紫色叶鞘基因的KASP分子标记的开发方法而提出的应用或权利要求4所述的玉米紫色叶鞘基因的KASP分子标记的开发方法而生产出的产品，其特征在于：所述KASP_PSH位点的多态性或基因型的物质为如下D1）、D2）或D3）：
D1）、所述KASP_PSH位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括所述KASP_PSH位点在内的玉米基因组DNA片段的PCR引物；
D2）、所述KASP_PSH位点的多态性或基因型的物质为含有所述PCR引物的PCR试剂；
D3）、含有D1）所述PCR引物或D2）所述PCR试剂的试剂盒。
6.根据权利要求5所述的应用或产品，其特征在于：所述PCR引物为由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的第22-39位的单链DNA、核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第22-39位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的单链DNA组成的引物组。
7.根据权利要求5或6所述的应用或产品，其特征在于：所述PCR引物为由序列表中SEQID No.1所示的单链DNA、序列表中SEQ ID No.2所示的单链DNA和由序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA的引物组。
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