CN114561488B - 一种与水稻氮肥利用效率基因OsNPF3.1的功能分子标记与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子标记技术领域，本发明公开了一种与水稻氮肥利用效率基因OsNPF3.1的功能分子标记及其应用，该标记位于水稻OsNPF3.1基因第6号染色体的第8741040核酸位点，该位点的碱基为G或A，对应位于核酸序列表SEQ ID NO.1的第51位核酸位点。且公开了该分子标记在选育或辅助选育与水稻氮素利用效率相关的水稻品种或品系的用途，具体是选育或辅助选育水稻氮肥利用率高/低的水稻中的应用。通过验证研究发现OsNPF3.1^Chr6 _{_} ^8741040检测结果可靠性高。

Description

一种与水稻氮肥利用效率基因OsNPF3.1的功能分子标记与 应用

【技术领域】

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种与水稻氮素利用效率相关的与水稻氮肥利用效率基因OsNPF3.1的功能分子标记与应用。

【背景技术】

氮是植物需求量最大的矿质元素，也是植物生长发育的关键限制因子。在水稻生产实践中，大量施用氮肥一直是实现其高产的重要措施之一。然而，过量施氮不仅增加了生产成本，而且造成农业生态环境严重破坏。研究表明，培育氮肥高效利用水稻新品种是降低生产成本、减少环境污染、大幅增加生态效益的有效途径。大量分子育种实践表明，分析水稻重要农艺性状基因的基因结构变异，开发目标基因功能标记，可实现基因的直接选择和有效聚合，大幅度提高育种效率，缩短育种时间。

常用的分子标记如RFLP，RAPD，CAPS，dCAPS，AFLP,SSR,ISSR,STS,SRAP，IRAP和InDel等，可用于目标基因的连锁分析、检测，但是这些标记检测耗时长、操作繁琐、效率低、自动化程度低并且使用有毒物质等缺点，不适用于大规模的基因型分析。

单核苷酸多态性SNP，是指在基因组水平上引起的单个碱基的变异，其在群体中的发生频率不小于1％。SNP可以发生在基因组的任何位置，作为新一代分子标记，具有数量多、分布均匀、多态性丰富、精度高等优点。

PARMS技术，即五引物扩增受阻突变体系，是最新开发出的基于荧光检测的SNP基因分型方法，该技术利用五条引物(一对通用荧光引物、一对等位基因特异引物和一条反向共用引物)对SNP或短Indel位点进行等位基因特异性扩增，通过荧光扫描进行基因分型，具有操作简便、耗时短、成本低的优势。基于PARMS技术开发的荧光分子标记，检测样品只通过一次PCR扩增，不需要电泳检测，而直接在原板上用荧光扫描仪获取扩增数据，经过软件分析，快速获得相应基因型结果。

【发明内容】

本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供与与水稻氮肥利用效率基因OsNPF3.1的功能分子标记其作为分子标记的应用，并将该分子标记应用于筛选出氮肥利用效率高/低的水稻，为选育具有优良性状的水稻品种提供技术支撑。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

与水稻氮肥利用效率基因OsNPF3.1的功能分子标记，所述与水稻氮肥利用效率基因OsNPF3.1的功能分子标记如下：

标记为：位于水稻第6号染色体的第8741040核酸位点，该位点的碱基为G或A，对应位于核酸序列表SEQ ID NO.1的第51位核酸位点。

本发明还提供一种应用如上所述的与水稻氮肥利用效率基因OsNPF3.1的功能分子标记在选育或辅助选育与水稻氮素利用效率相关的水稻品种或品系的用途，具体是选育或辅助选育水稻氮肥利用率高/低的水稻。

本发明还提供一种应用如上所述的与水稻氮肥利用效率基因OsNPF3.1的功能分子标记选育或辅助选育与水稻氮素利用效率相关的水稻品种或品系的方法，具体步骤为：提取水稻基因组DNA，检测水稻的第6号染色体的第8741040位核苷酸，检测出第8741040位核苷酸的序列为G或A，确定待测水稻的基因型是AA、AG或GG型，根据需要选择AA型基因的水稻进行下一步选种和/或育种。

进一步说明，所述AA型基因的水稻氮素利用效率高于AG或GG型基因水稻。

进一步说明，所述水稻氮素利用效率的相关候选基因为OsNPF3.1基因。

本发明还提供一种鉴定如上所述与水稻氮肥利用效率基因OsNPF3.1的功能分子标记的方法，具体步骤为：

(1)水稻氮肥利用效率的表型鉴定：在0.5和1.5mM NH4NO3水稻营养液中鉴定132份籼稻和22份粳稻的氮肥利用效率，主要考查株高和干物质重量；

(2)OsNPF3.1基因组区域变异位点分析：利用3K数据库中的Rice SNP-SeekDatabase下载OsNPF3.1基因组区域变异位点，共有31个SNPs；

(3)154份材料的基因分析：依据31个位点序列信息，设计了25对引物。采用PARMS技术对132份籼稻和22份粳稻进行基因分型，18个位点可以正常分析；

(4)关联分析：将154个水稻品种的基因型与表型进行关联分析，在GLM模型下有两个变异位点与氮素利用效率相关，分别为OsNPF3.1Chr6_^8741040和OsNPF3.1Chr6_^8742153；水稻日本晴基因组在OsNPF3.1Chr6_{_} ^8741040的基因型为GG，GG基因型有22个水稻品种，AA基因型有130个，其中GG为氮素不敏感优异等位变异；日本晴基因组在OsNPF3.1Chr6_^8742153的基因型为TT，TT基因有8个，GG基因型有146个，其中TT为氮素不敏感优异等位变异；

(5)OsNPF3.1Chr6_^8741040引物信息：根据水稻第6染色体第8741040处位点G→A突变，设计了PARMS分子标记OsNPF3.1Chr6_^8741040，该标记由3条OsNPF3.1基因的特异引物构成，在设计的正向引物中引入两个碱基的差异：

正向引物OsNPF3.1Chr6_{_} ^8741040Fa：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTATAGATGAAGCATGAGAACACATTAA，

正向引物OsNPF3.1Chr6_{_} ^8741040Fg：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATATAGATGAAGCATGAGAACACATTAG，

反向引物OsNPF3.1Chr6_^8741040R：CTATACAAAATCGCAACTTTAATGTAAC；

另外包含两条通用引物，分别与两条正向引物中有下划线的部分一致，两条通用引物尾部加有不同的荧光标记：

#1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，

#2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT；

(6)OsNPF3.1Chr6_{_} ^8741040的使用：标记的3条根据OsNPF3.1基因序列设计的引物及两条通用荧光引物同时加入到PCR反应体系进行扩增。OsNPF3.1等位基因序列可以根据SNP差异与正向引物OsNPF3.1Chr6_^8741040Fa匹配而扩增获得FAM荧光信号值，与正向引物OsNPF3.1Chr6_^8741040Fg匹配而扩增获得HEX荧光信号值；如果水稻样品在该位点为杂合状态，则两种正向引物同时扩增；

(7)OsNPF3.1^Chr6_8741040扩增产物检测：PCR产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过SNPdecoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)软件分析，获得每个样品扩增的FAM和HEX荧光信号强度，并对每个信号点用图形方式输出，最后根据荧光信号强度，自动进行基因分型，获得基因型结果；根据荧光信号值进行分析，荧光扫描获得FAM荧光信号蓝色的是OsNPF3.1等位基因A类型材料，获得HEX荧光信号绿色的是氮肥不敏感G类型材料，灰色为阴性对照材料；

(8)OsNPF3.1^Chr6_8741040有效性评估：利用OsNPF3.1Chr6_^8741040检测154份水稻材料的氮肥利用效率，结合表型数据，评估准确率。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

(1)OsNPF3.1^Chr6_8741040位点与水稻氮肥利用效率显著相关；(2)PARMS不需要凝胶电泳分离DNA片段，避免接触有毒化学物质；(3)多态性极好，基因分型清楚，软件读取数据便捷，不易出错；(4)OsNPF3.1^Chr6_874104检测结果可靠；(4)本发明利用3000份水稻材料的重测序数据，分析水稻氮肥利用效率基因OsNPF3.1的序列变异，发现在OsNPF3.1基因组区域有共有31个SNPs，采用PARMS技术对132份籼稻和22份粳稻进行基因分型，其中18个位点可以正常分析。将154个水稻品种的基因型与表型进行关联分析，在一般线性模型(GLM)下有两个变异位点可能与水稻氮素利用效率相关，分别为OsNPF3.1^Chr6_8741040和OsNPF3.1^{Chr6 _8742153}。结果表明，OsNPF3.1^Chr6_8741040准确率为96.9％，可用于水稻氮肥高效利用品种的分子标记辅助选择育种。

【附图说明】

图1为本申请中154个水稻品种的基因型与表型进行关联分析的GLM图；其中T1表示在0.5mM NH₄NO₃和1.5mM NH₄NO₃浓度下，20天时干物质重量比值；T2表示在0.5mM NH₄NO₃和1.5mM NH₄NO₃浓度下，20天时的株高比值；T3表示表示在0.5mM NH₄NO₃和1.5mM NH₄NO₃浓度下，30天时的干物质重量比值；T4表示在0.5mM NH₄NO₃和1.5mM NH₄NO₃浓度下，30天时的株高比值。

图2为实施例1中OsNPF3.1基因在日本晴水稻材料中的荧光图。

【具体实施方式】

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

实施例：

一种与水稻氮肥利用效率基因OsNPF3.1的功能分子标记开发与应用，具体开发的试验步骤如下：

(1)水稻氮肥利用效率的表型鉴定：在0.5和1.5mM NH₄NO3水稻营养液中鉴定132份籼稻和22份粳稻的氮肥利用效率，主要考查株高和干物质重量。

(2)OsNPF3.1基因组区域变异位点分析：利用3K数据库中的Rice SNP-SeekDatabase下载OsNPF3.1基因组区域变异位点，共有31个SNPs。

(3)154份材料的基因分析：依据31个位点序列信息，设计了25对引物。采用PARMS技术对132份籼稻和22份粳稻进行基因分型，研究发现有18个位点可以正常分析。

(4)关联分析：将154个水稻品种的基因型与表型进行关联分析，在GLM(图1)模型下有两个变异位点与水稻氮素利用效率相关，分别为OsNPF3.1^Chr6_8741040和OsNPF3.1^{Chr6 _8742153}。以-log(P)＝1.5为阈值，通过关联分析检测到OsNPF3.1^Chr6_8741040(T2，T3，T4中的三角形标记)和OsNPF3.1^Chr6_8742153(T1，T2，T4中的箭头标记)为显著关联位点。

研究发现，水稻日本晴基因组在OsNPF3.1^Chr6_8741040的基因型为GG，GG基因型有22个水稻品种，AA基因型有130个，其中GG为氮素不敏感优异等位变异。日本晴基因组在OsNPF3.1^Chr6_8742153的基因型为TT，TT基因有8个，GG基因型有146个，其中TT为氮素不敏感优异等位变异。

(5)OsNPF3.1^Chr6_8741040引物信息：根据水稻第6染色体第8741040处位点G→A突变，设计了PARMS分子标记OsNPF3.1^Chr6_8741040，该标记由3条OsNPF3.1基因的特异引物构成，在设计的正向引物中引入两个碱基的差异：

正向引物OsNPF3.1^Chr6_8741040Fa：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTATAGATGAAGCATGAGAACACATTAA，

正向引物OsNPF3.1^Chr6_8741040Fg：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATATAGATGAAGCATGAGAACACATTAG，反向引物OsNPF3.1^Chr6_8741040R：CTATACAAAATCGCAACTTTAATGTAAC。

另外包含两条通用引物，分别与两条正向引物中有下划线的部分一致，两条通用引物尾部加有不同的荧光标记：

#1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，

#2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。

(6)OsNPF3.1^Chr6_8741040的使用：标记的3条OsNPF3.1基因的特异引物及两条通用荧光引物同时加入到PCR反应体系进行扩增。OsNPF3.1等位基因序列可以根据SNP差异与正向引物OsNPF3.1^Chr6_8741040Fa匹配而扩增获得FAM荧光信号值，与正向引物OsNPF3.1^{Chr6_ 8741040}Fg匹配而扩增获得HEX荧光信号值。如果水稻样品在该位点为杂合状态，则两种正向引物同时扩增。

PCR反应体系为10μL：5μL 2×PARMS master mix，0.15μL10 mM OsNPF3.1^{Chr6 _8741040}-Fg标记引物，0.15μL10 mM OsNPF3.1^Chr6_8741040-Fa标记引物，0.4μL10 mMOsNPF3.1^Chr6_8741040R通用反向引物，1μL模板DNA，3.3μL ddH₂O；PCR反应程序是：95℃，5min；然后10个循环95℃，20s，65℃(-0.8℃/循环)，1min；然后32个循环95℃，20s，57℃，1min。

(7)OsNPF3.1^Chr6_8741040扩增产物检测：PCR产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过SNPdecoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)软件分析，获得每个样品扩增的FAM和HEX荧光信号强度，并对每个信号点用图形方式输出，最后根据荧光信号强度，自动进行基因分型，获得基因型结果。

根据荧光信号值进行分析，荧光扫描获得FAM荧光信号(蓝色)的是OsNPF3.1等位基因(A)类型材料，获得HEX荧光信号(绿色)的是氮肥不敏感(G)类型材料，灰色为阴性对照(图2)。

(8)OsNPF3.1^Chr6_8741040有效性评估：利用OsNPF3.1Chr6_8741040检测154份水稻材料的氮肥利用效率，结合表型数据，其中131份表型为氮高效型，23份表型为氮低效型，基因型为氮高效的为127份，说明该标记的准确率为96.9％，可应用选育或辅助选育与水稻氮素利用效率相关的水稻品种或品系的用途。

综上证明了，OsNPF3.1^Chr6_8741040位点与水稻氮肥利用效率显著相关；(2)PARMS不需要凝胶电泳分离DNA片段，避免接触有毒化学物质；(3)多态性极好，基因分型清楚，软件读取数据便捷，不易出错；(4)OsNPF3.1^Chr6_874104检测结果可靠性高。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式其描述较为具体和详细但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是对于本领域的普通技术人员来说在不脱离本发明构思的前提下还可以做出若干变形和改进这些都属于本发明的保护范围。因此本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广西壮族自治区农业科学院

<120> 一种与水稻氮肥利用效率基因OsNPF3.1的功能标记与应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 101

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza meridionalis)

<220>

<221> misc_feature

<222> (101 )..( 101)

<223> r is a or g

<400> 1

accaatatga aaaaaaaact aatatataga tgaagcatga gaacacatta rcataaacca 60

ataaaaatat aaaacagagc agattaattg atttagtaaa g 101

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtgacc aagttcatgc ttatagatga agcatgagaa cacattaa 48

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaggtcgga gtcaacggat tatatagatg aagcatgaga acacattag 49

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctatacaaaa tcgcaacttt aatgtaac 28

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaggtgacc aagttcatgc t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaaggtcgga gtcaacggat t 21

Claims (3)

1.一种应用水稻氮肥利用效率基因OsNPF3.1的功能分子标记在选育或辅助选育与水稻氮素利用效率相关的水稻品种或品系的用途，其特征在于：具体是选育或辅助选育水稻氮肥利用率高/低的水稻；所述水稻氮肥利用效率基因OsNPF3.1的功能分子标记如下：位于水稻第6号染色体的第8741040核酸位点，该位点的碱基为G或A，对应位于核酸序列表SEQID NO.1的第51位核酸位点。

2.一种应用水稻氮肥利用效率基因OsNPF3.1的功能分子标记选育或辅助选育与水稻氮素利用效率相关的水稻品种或品系的方法，其特征在于：具体步骤为：提取水稻基因组DNA，检测水稻的第6号染色体的第8741040位核苷酸，对应位于核酸序列表SEQ ID NO.1的第51位核酸位点，检测出第8741040位核苷酸的序列为G或A，确定待测水稻的基因型是AA、AG或GG型，根据需要选择AA型基因的水稻进行下一步选种和/或育种。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述AA型基因的水稻氮素利用效率高于AG或GG型基因水稻。

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