CN114164292A - 水稻稻瘟病抗性基因Pid4的KASP标记开发及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了水稻稻瘟病抗性基因Pid4的KASP标记开发及其应用，属于基因生物技术领域。其中所述分子标记是与水稻稻瘟病抗性基因Pid4紧密连锁的KASP标记KASP_Pid4，所述KASP_Pid4是水稻基因组中的一个InDel位点，其核苷酸种类为+或‑，为序列表中SEQ ID No.4的第101位核苷酸。本发明应用KASP技术对水稻稻瘟病抗性基因Pid4进行基因型鉴定，具有操作简便、成本低廉、检测周期短、标记稳定、绿色环保等优点，可精准检测水稻稻瘟病抗性基因Pid4，对促进水稻抗病育种具有重要意义。

Description

水稻稻瘟病抗性基因Pid4的KASP标记开发及其应用
技术领域
本发明涉及水稻稻瘟病抗性基因Pid4的KASP标记开发及其应用，属于基因生物技术领域。
背景技术
水稻(Oryza sativa)是世界主要粮食作物之一，也是我国最重要的粮食作物。水稻除作为主粮外，还可制淀粉、酿酒、制醋，供工业及医药用；稻杆为良好饲料及造纸原料和编织材料，谷芽和稻根可供药用(郭孔雁,冯敏.稻米营养价值及其食味的研究[J].湖南农学院学报,1989,15(4):1-5.)。
稻瘟病是水稻最为严重的病害之一，每年因稻瘟病损失的水稻占年产量的10％～30％(Skamnioti P,Gurr S J.Against the grain:safeguarding rice from rice blastdisease[J].Trends in Biotechnology,2009,27(3):141-150.)。培育抗稻瘟病品种是水稻育种的重要方向，利用抗病分子标记在水稻苗期从DNA水平对目标植株进行抗病性选择，弥补了传统育种中出现的诸多弊端，是提高水稻抗病育种效率的有效途径(Tanksley等，RFLP mapping in plant breeding:New tools for an old science.1989,Biotechnology,7:257-263)。迄今为止，科学家已克隆了30多个抗稻瘟病基因，包括Pi1、Pik、Pia、Pb1、Pita、Pi37、Pit、Pi2、Pi9、Piz-t、Pigm、Pid2、Pid3、Pi25、Pi36、Pi5等基因(易怒安,李魏,戴良英.水稻抗稻瘟病基因的克隆及其分子育种研究进展[J].分子植物育种,2015,13(7).)。上述基因多已开发了连锁的分子标记，然而SSR标记、InDel标记或CAPS标记虽然可以用于分子标记辅助选择，但检测效率低，还可能会产生气溶胶污染环境，不适用于高通量的分子检测平台。
KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)通过荧光探针特异性识别基因位点达到基因分型的效果，可用于检测SNP位点和InDel位点。与SSR、RFLP、InDel等分子标记相比，KASP标记具有检测快速，成本低，易于规模化应用等特点，KASP标记不需要根据DNA片段大小进行分型，能够摆脱传统凝胶电泳这种步骤相对繁琐，低通量，价格又较贵的检测方法，更加适用于现阶段飞速发展的高通量分子检测平台。因此，开发适合于高通量分子检测平台的水稻粒型KASP分子标记对于推广普及分子标记技术的应用，提高我国优质粒型水稻的育种效率和育种水平具有重要意义。
发明内容
本发明针对上述背景技术所提及的技术问题，而采用以下技术方案来实现：
水稻稻瘟病抗性基因Pid4的KASP标记开发，所述分子标记是与水稻稻瘟病抗性基因Pid4紧密连锁的KASP标记KASP_Pid4，所述KASP_Pid4是水稻基因组中的一个InDel位点，其核苷酸种类为AAGCTAACTGCATTGATCGCTCACGTGGT(下文记为+)或缺失(下文记为-)，为序列表中SEQ ID No.4的第101位核苷酸。
水稻稻瘟病抗性基因Pid4的KASP标记开发的应用，所述与水稻稻瘟病抗性基因Pid4紧密连锁的KASP分子标记在C1、C2、C3或C4中的应用；
所述C1为检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定水稻稻瘟病抗性中的应用；
所述C2为检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定抗稻瘟病水稻产品中的应用；
所述C3为检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在水稻辅助育种或制备水稻辅助育种产品中的应用；
所述C4为检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在选育抗稻瘟病水稻资源中的应用。
水稻稻瘟病抗性基因Pid4的KASP标记开发的应用，还提供一种鉴定或辅助鉴定水稻稻瘟病抗性的方法，包括检测待测水稻的基因型，根据待测水稻的基因型鉴定或辅助鉴定水稻稻瘟病抗性；所述基因型为水稻基因组中KASP_Pid4位点的基因型；所述记KASP_Pid4位点是水稻基因组中的一个InDel位点，其核苷酸种类为+或-，为序列表中SEQ IDNo.4的第101位核苷酸；
其中，所述KASP_Pid4位点的基因型为++基因型时，水稻为感稻瘟病或者候选为感稻瘟病；所述KASP_Pid4位点的基因型为--基因型或者+-基因型时，水稻为抗稻瘟病或者候选为抗稻瘟病；其中，所述++基因型表示水稻基因组中所述KASP_Pid4位点的核苷酸种类为+的纯合型；所述--基因型表示水稻基因组中所述KASP_Pid4位点的核苷酸种类为-的纯合型；所述+-基因型表示水稻基因组中所述KASP_Pid4位点的核苷酸种类为+和-的杂合型。
作为优选实例，所述检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在A1、A2、A3或A4中的应用；
所述A1为检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定抗稻瘟病水稻中的应用；
所述A2为检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定抗稻瘟病水稻产品中的应用；
所述A3为检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在水稻辅助育种或制备水稻辅助育种产品中的应用；
所述A4为检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在选育抗稻瘟病水稻资源中的应用。
水稻稻瘟病抗性基因Pid4的KASP标记开发的应用，还提供一种选育抗稻瘟病水稻资源的方法，包括选择KASP_Pid4位点的基因型--或基因型为+-的水稻进行育种，其中，所述KASP_Pid4位点是水稻基因组中的一个InDel位点，其核苷酸种类为+或-，为序列表中SEQID No.4的第101位核苷酸；所述--基因型表示水稻基因组中所述KASP_Pid4位点的核苷酸种类为-的纯合型；所述+-基因型表示水稻基因组中所述KASP_Pid4位点的核苷酸种类为+和-的杂合型。
水稻稻瘟病抗性基因Pid4的KASP标记开发的应用，提供含有检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质的产品，该产品包括检测与水稻稻瘟病抗性相关的单核苷酸多态性或基因型的产品、鉴定或辅助鉴定水稻稻瘟病抗性的产品、用于水稻辅助育种的产品、用于选育抗稻瘟病水稻资源的产品中的任一种。
作为优选实例，含有检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质的产品在B1、B2、B3或B4中的应用；
所述B1为检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定水稻稻瘟病抗性中的应用；
所述B2为检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定抗稻瘟病水稻产品中的应用；
所述B3为检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在水稻辅助育种或制备水稻辅助育种产品中的应用；
所述B4为检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在选育抗稻瘟病水稻资源中的应用。
作为优选实例，所述检测检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质为如下：
D1、所述检测检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括所述KASP_Pid4位点在内的水稻基因组DNA片段的PCR引物；
D2、所述检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质为含有所述PCR引物的PCR试剂；
D3、含有D1所述PCR引物或D2所述PCR试剂的试剂盒。
作为优选实例，所述PCR引物为P1或P2；
P1、所述PCR引物为由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的第22-48位的单链DNA、核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第22-48位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的单链DNA组成的引物组；
P2、所述PCR引物为由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA、序列表中SEQ IDNo.2所示的单链DNA和由序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA的引物组。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种水稻稻瘟病抗性基因Pid4紧密连锁的KASP标记开发与应用，分子标记是与水稻稻瘟病抗性基因Pid4紧密连锁的KASP标记KASP_Pid4。该标记基于KASP技术开发，可高通量检测水稻基因组第6号染色体的第10436129位碱基。本发明应用KASP技术对水稻稻瘟病抗性基因Pid4进行基因型鉴定，具有操作简便、成本低廉、检测周期短、标记稳定、绿色环保等优点，可精准检测水稻稻瘟病抗性基因Pid4，对促进水稻抗病育种具有重要意义。
附图说明
图1为本发明水稻稻瘟病抗性基因Pid4紧密连锁分子标记的开发流程图；
图2为利用分子标记KASP_Pid4检测品种材料的分型图；
图3为利用分子标记KASP_Pid4检测F2群体的分型图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
在本发明使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
实施例1
与水稻稻瘟病抗性基因Pid4紧密连锁KASP标记开发
与水稻稻瘟病抗性基因Pid4紧密连锁KASP标记开发流程如图1所示。据文献报道，获得一个与Pid4基因紧密连锁的InDel位点。
1.引物的确定：将Pid4基因的紧密连锁InDel位点锚定在水稻6号染色体10436129bp位置上(陈智雄.水稻地谷抗稻瘟病基因Pid4的克隆与功能分析.四川农业大学)。从NCBI数据库下载Pid4基因的紧密连锁InDel位点的侧翼序列，并利用Primer5.0软件，共设计3组KASP引物。利用Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测后，挑选出1套多态性良好的KASP引物用于后续验证，所述用于检测与水稻稻瘟病抗性基因Pid4紧密连锁KASP标记的引物具体如下：Primer X：5’-gaaggtcggagtcaacggattACTAGTATTGCTAATTTGTTGGAGCAC-3’(SEQ ID No.1，小写字母部分为特异荧光标签序列VIC)；
Primer Y：5’-gaaggtgaccaagttcatgctACTAGTATTGCTAATTTGTTGGAGCAA-3’(SEQID No.2，小写字母部分为特异荧光标签序列FAM)；
Primer R：5’-CGGGTGATTGTGAAGATCGAAG-3’(SEQ ID No.3)。
所述引物对应的InDel位点为水稻基因组第6号染色体的第10436129位碱基(对应序列表中序列4中第101位核苷酸)。
2.DNA提取：采用常规CTAB法从水稻叶片中提取基因组DNA。
3.KASP反应测试。
SNP标记扩增及反应体系：
(1)荧光定量PCR仪AB-Q6 Flex检测：
5μL PCR荧光定量仪检测反应体系包括：基因组DNA 50ng，引物混液0.07μL(优选引物混液配比：正向引物Primer X、Primer Y 100pmol·L-1各12μL，反向引物Primer R100pmol·L-1 30μL,ddH2O 46μL，使用其他合理的引物混液配比也可以达到相同的检测目的)，LGC公司2×KASP Mix(Low Rox)2.5μL。按照荧光定量PCR仪AB-Q6仪器操作手册，编辑样品表，执行运行程序，保存数据。
以上反应体系为AB-Q6 Flex的优选反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。
(2)选择Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测：
1.6μL PCR ArrayTape平台检测反应体系包括：含基因组DNA 50ng/μL0.8μL，引物混液0.03μL(优选引物混液配比：正向引物Primer X、Primer Y 100pmol·L-1各12μL，反向引物Primer R 100pmol·L-1 30μL,ddH2O46μL，使用其他合理的引物混液配比也可以达到相同的检测目的)，LGC公司2×KASP Mix(Std Rox)0.8μL。根据ArrayTape平台仪器操作手册，编写样品表，运行程序，读取数据。
以上反应体系为Douglas Scientific公司ArrayTape平台的优选反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。
注：以上为推荐检测方法，其他能够达到相同检测目的的检测方法也可以应用到上述标记的分子标记辅助育种过程中。
其中，2×KASP Mix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真Taq酶，dNTP，Mg2+等组成。荧光探针A的核苷酸序列为：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，5’末端连接一个VIC荧光基团；荧光探针B的核苷酸序列为：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，其5’端连接一个FAM荧光基团；淬灭探针A的核苷酸序列为：5’-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3’，其3’端连接一个淬灭基团BHQ；淬灭探针B的核苷酸序列为：5’-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3’，其3’端连接一个淬灭基团BHQ。
4.扩增程序：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55-62℃(优选55℃)退火60s，设置40个循环。
实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC)，每个板设置1个或多个空白对照。
对扫描数据进行分析，然后按照如下确定待测水稻基因组中KASP_Pid4位点的基因型(即检测水稻基因组第6号染色体的第10436129位碱基是+还是-)，若所述待测水稻的扩增产物的荧光信号数据经Douglas基因分型软件分析靠近X轴(VIC信号)，则待测水稻基因组中KASP_Pid4位点的基因型为--纯合型(即水稻基因组第6号染色体的第10436129位碱基为-纯合型)；若待测水稻的扩增产物的荧光信号数据经Douglas基因分型软件分析靠近Y轴(FAM信号)，则待测水稻基因组中KASP_Pid4位点的基因型为++纯合型(即水稻基因组第6号染色体的第10436129位碱基为+纯合型)；若待测水稻的扩增产物的荧光信号数据经Douglas基因分型软件分析位于X轴和Y轴中间(VIC和FAM信号)，则待测水稻基因组中KASP_Pid4位点的基因型为+-杂合型(即水稻基因组第6号染色体的第10436129位碱基为+-杂合型)。左下角显示为黑色的样本为空白对照。
5.标记分型数据分析
为了验证KASP_Pid4位点的可靠性，首先，利用KASP_Pid4对8水稻品种材料进行分子标记检测(图2)；然后，对8份水稻品种材料进行稻瘟病接种鉴定，获得材料的抗性数据，稻瘟病接种鉴定方法及评价标准见文献(陈智雄.水稻地谷抗稻瘟病基因Pid4的克隆与功能分析.四川农业大学.)。材料基因型采用Douglas Scientific公司ArrayTape平台进行检测，为了保证准确性，实验设计2次重复。扩增结果表明，KASP_Pid4位点在8份材料中能够获得稳定的PCR产物，并且能够检测到+和-两个等位位点，且与材料抗病性一致(图3)。因此，本发明所述的KASP_Pid4位点可用于水稻稻瘟病抗性基因Pid4的分子标记辅助育种。
表1. 8份测试水稻品种的表型与基因型信息
序号 品种名称 抗病性 基因型 序号 品种名称 抗病性 基因型
1 川谷B T -- 5 粤丰B S ++
2 恒丰B S ++ 6 明恢86 S ++
3 地谷 T -- 7 绵恢523 T --
4 绵恢725 T -- 8 丽江 S ++
注：表中‘T’表示材料的表型为抗病；‘S’表示材料的表型为感病；‘--’表示纯合抗病基因型；‘++’表示纯合感病基因型；‘+-’表示杂合抗病基因型；‘*’表示无检测信号。
实施例2
与水稻稻瘟病抗性基因Pid4紧密连锁的KASP标记在分子标记辅助选择水稻抗稻瘟病植株中的应用。
为检测本发明KASP_Pid4位点的实用性，利用抗稻瘟病材料绵恢523与感稻瘟病材料明恢86杂交获得F1群体，通过F1天然自交产生F2自然分离群体48株，对分离群体进行KASP标记检测和抗病表型验证(表2)，标记检测和抗病表型验证实施方法参考实施例1。通过对分离群体进行表型与基因型检测和分析，在48份分离群体单株中，仅3株基因型与表型结果不一致，标记KASP_Pid4与田间抗性的一致性结果为P＝93.75％，表明标记KASP-Pid4在水稻抗根结线虫病植株筛选中具有较高的实用性。
表2.水稻分离群体的表型与基因型信息
材料编号 抗性 基因型 材料编号 抗性 基因型
523×86_F2_001 T -- 523×86_F2_025 T +-
523×86_F2_002 T +- 523×86_F2_026 T +-
523×86_F2_003 T * 523×86_F2_027 T --
523×86_F2_004 S ++ 523×86_F2_028 T +-
523×86_F2_005 T -- 523×86_F2_029 T ++
523×86_F2_006 T +- 523×86_F2_030 S ++
523×86_F2_007 T +- 523×86_F2_031 T +-
523×86_F2_008 T +- 523×86_F2_032 T +-
523×86_F2_009 S ++ 523×86_F2_033 S +-
523×86_F2_010 S ++ 523×86_F2_034 T +-
523×86_F2_011 T +- 523×86_F2_035 T +-
523×86_F2_012 T -- 523×86_F2_036 S ++
523×86_F2_013 S ++ 523×86_F2_037 T --
523×86_F2_014 S ++ 523×86_F2_038 T +-
523×86_F2_015 T -- 523×86_F2_039 T +-
523×86_F2_016 T -- 523×86_F2_040 T +-
523×86_F2_017 S ++ 523×86_F2_041 T +-
523×86_F2_018 T ++ 523×86_F2_042 S ++
523×86_F2_019 S ++ 523×86_F2_043 T +-
523×86_F2_020 T -- 523×86_F2_044 T +-
523×86_F2_021 T +- 523×86_F2_045 T +-
523×86_F2_022 T -- 523×86_F2_046 T +-
523×86_F2_023 T -- 523×86_F2_047 T +-
523×86_F2_024 T -- 523×86_F2_048 T +-
注：表中‘T’表示材料的表型为抗病；‘S’表示材料的表型为感病；‘--’表示纯合抗病基因型；‘++’表示纯合感病基因型；‘+-’表示杂合抗病基因型；‘*’表示无检测信号。
其中，鉴定或辅助鉴定水稻稻瘟病抗性的方法，包括检测待测水稻的基因型，根据待测水稻的基因型鉴定或辅助鉴定水稻稻瘟病抗性；基因型为水稻基因组中KASP_Pid4位点的基因型；记KASP_Pid4位点是水稻基因组中的一个InDel位点，其核苷酸种类为+或-，为序列表中SEQ ID No.4的第101位核苷酸。
KASP_Pid4位点的基因型为++基因型时，水稻为感稻瘟病或者候选为感稻瘟病；KASP_Pid4位点的基因型为--基因型或者+-基因型时，水稻为抗稻瘟病或者候选为抗稻瘟病；其中，++基因型表示水稻基因组中KASP_Pid4位点的核苷酸种类为+的纯合型；--基因型表示水稻基因组中KASP_Pid4位点的核苷酸种类为-的纯合型；+-基因型表示水稻基因组中KASP_Pid4位点的核苷酸种类为+和-的杂合型。
检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在A1、A2、A3或A4中的应用；KASP_Pid4位点是水稻基因组中的一个InDel位点，其核苷酸种类为+或-，为序列表中SEQ ID No.4的第101位核苷酸：
A1、检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定水稻稻瘟病抗性中的应用；
A2、检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定抗稻瘟病水稻产品中的应用；
A3、检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在水稻辅助育种或制备水稻辅助育种产品中的应用；
A4、检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在选育抗稻瘟病的水稻资源中的应用。
选育抗稻瘟病的水稻资源的方法，包括选择KASP_Pid4位点的基因型--或基因型为+-的水稻进行育种，其中，KASP_Pid4位点是水稻基因组中的一个InDel位点，其核苷酸种类为+或-，为序列表中SEQ ID No.4的第101位核苷酸；--基因型表示水稻基因组中KASP_Pid4位点的核苷酸种类为-的纯合型；+-基因型表示水稻基因组中KASP_Pid4位点的核苷酸种类为+和-的杂合型。
含有检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质的产品，包括以下任一种产品：
1、检测与水稻稻瘟病抗性相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；
2、鉴定或辅助鉴定抗稻瘟病水稻的产品；
3、用于水稻辅助育种的产品；
C4、用于选育抗稻瘟病水稻资源的产品。
含有检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质的产品在B1、B2、B3或B4中的应用：
B1、检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定水稻稻瘟病抗性中的应用；
B2、检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定抗稻瘟病水稻产品中的应用；
B3、检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在水稻辅助育种或制备水稻辅助育种产品中的应用；
B4、检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在选育抗稻瘟病的水稻资源中的应用。
检测检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质为如下D1、D2或D3：
D1、检测检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括KASP_Pid4位点在内的水稻基因组DNA片段的PCR引物；
D2、检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质为含有PCR引物的PCR试剂；
D3、含有D1)PCR引物或D2)PCR试剂的试剂盒。
PCR引物为P1或P2：
P1、PCR引物为由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的第22-48位的单链DNA、核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第22-48位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ IDNo.3的单链DNA组成的引物组；
P2、PCR引物为由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA、序列表中SEQ ID No.2所示的单链DNA和由序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA的引物组。
一种与水稻稻瘟病抗性基因Pid4紧密连锁的KASP分子标记，分子标记是与水稻稻瘟病抗性基因Pid4紧密连锁的KASP标记KASP_Pid4，KASP_Pid4是水稻基因组中的一个InDel位点，其核苷酸种类为+或-，为序列表中SEQ ID No.4的第101位核苷酸。
与水稻稻瘟病抗性基因Pid4紧密连锁的KASP分子标记在C1、C2、C3或C4中的应用：
C1、检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定水稻稻瘟病抗性中的应用；
C2、检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定抗稻瘟病水稻产品中的应用；
C3、检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在水稻辅助育种或制备水稻辅助育种产品中的应用；
C4、检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在选育抗稻瘟病水稻资源中的应用。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 江苏省农业科学院宿迁农科所
<120> 水稻稻瘟病抗性基因Pid4的KASP标记开发及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 200
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 1
cggctctctt ccccccttgt tcctcccgct atcgcgagtc aacgggatgc tcgattcgtt 60
acattttttt taagtactag tattgctaat ttgttggagc actgcttcga tcttcacaat 120
cacccgataa aaatagttgc gacagagaaa aaaaaaaaga aagtgtggga cggaagggaa 180
aggggggaat tcgctataaa 200
<210> 2
<211> 228
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 2
cggctctctt ccccccttgt tcctcccgct atcgcgagtc aacgggatgc tcgattcgtt 60
acattttttt taagtactag tattgctaat ttgttggagc aagctaactg cattgatcgc 120
tcacgtggta ctgcttcgat cttcacaatc acccgataaa aatagttgcg acagagaaaa 180
aaaaaaagaa agtgtgggac ggaagggaaa ggggggaatt cgctataa 228

Claims (9)

1.水稻稻瘟病抗性基因Pid4的KASP标记开发，其特征在于：所述分子标记是与水稻稻瘟病抗性基因Pid4紧密连锁的KASP标记KASP_Pid4，所述KASP_Pid4是水稻基因组中的一个InDel位点，其核苷酸种类为+或-，为序列表中SEQ ID No.4的第101位核苷酸。
2.根据权利要求1所述的水稻稻瘟病抗性基因Pid4的KASP标记开发的应用，其特征在于：所述与水稻稻瘟病抗性基因Pid4紧密连锁的KASP分子标记在C1、C2、C3或C4中的应用；
所述C1为检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定水稻稻瘟病抗性中的应用；
所述C2为检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定抗稻瘟病水稻产品中的应用；
所述C3为检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在水稻辅助育种或制备水稻辅助育种产品中的应用；
所述C4为检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在选育抗稻瘟病水稻资源中的应用。
3.根据权利要求1所述的水稻稻瘟病抗性基因Pid4的KASP标记开发的应用，其特征在于：还提供一种鉴定或辅助鉴定水稻稻瘟病抗性的方法，包括检测待测水稻的基因型，根据待测水稻的基因型鉴定或辅助鉴定水稻稻瘟病抗性；所述基因型为水稻基因组中KASP_Pid4位点的基因型；所述记KASP_Pid4位点是水稻基因组中的一个InDel位点，其核苷酸种类为+或-，为序列表中SEQ ID No.4的第101位核苷酸；
其中，所述KASP_Pid4位点的基因型为++基因型时，水稻为感稻瘟病或者候选为感稻瘟病；所述KASP_Pid4位点的基因型为--基因型或者+-基因型时，水稻为抗稻瘟病或者候选为抗稻瘟病；其中，所述++基因型表示水稻基因组中所述KASP_Pid4位点的核苷酸种类为+的纯合型；所述--基因型表示水稻基因组中所述KASP_Pid4位点的核苷酸种类为-的纯合型；所述+-基因型表示水稻基因组中所述KASP_Pid4位点的核苷酸种类为+和-的杂合型。
4.根据权利要求3所述的水稻稻瘟病抗性基因Pid4的KASP标记开发的应用，其特征在于：所述检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在A1、A2、A3或A4中的应用；
所述A1为检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定抗稻瘟病水稻中的应用；
所述A2为检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定抗稻瘟病水稻产品中的应用；
所述A3为检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在水稻辅助育种或制备水稻辅助育种产品中的应用；
所述A4为检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在选育抗稻瘟病水稻资源中的应用。
5.根据权利要求1所述的水稻稻瘟病抗性基因Pid4的KASP标记开发的应用，其特征在于：还提供一种选育抗稻瘟病水稻资源的方法，包括选择KASP_Pid4位点的基因型--或基因型为+-的水稻进行育种，其中，所述KASP_Pid4位点是水稻基因组中的一个InDel位点，其核苷酸种类为+或-，为序列表中SEQ ID No.4的第101位核苷酸；所述--基因型表示水稻基因组中所述KASP_Pid4位点的核苷酸种类为-的纯合型；所述+-基因型表示水稻基因组中所述KASP_Pid4位点的核苷酸种类为+和-的杂合型。
6.根据权利要求1所述的水稻稻瘟病抗性基因Pid4的KASP标记开发的应用，其特征在于：提供含有检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质的产品，该产品包括检测与水稻稻瘟病抗性相关的单核苷酸多态性或基因型的产品、鉴定或辅助鉴定水稻稻瘟病抗性的产品、用于水稻辅助育种的产品、用于选育抗稻瘟病水稻资源的产品中的任一种。
7.根据权利要求6所述的水稻稻瘟病抗性基因Pid4的KASP标记开发的应用，其特征在于：含有检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质的产品在B1、B2、B3或B4中的应用；
所述B1为检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定水稻稻瘟病抗性中的应用；
所述B2为检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定抗稻瘟病水稻产品中的应用；
所述B3为检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在水稻辅助育种或制备水稻辅助育种产品中的应用；
所述B4为检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质在选育抗稻瘟病水稻资源中的应用。
8.根据权利要求3、4、5、6或7中任一所述的水稻稻瘟病抗性基因Pid4的KASP标记开发的应用，其特征在于：所述检测检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质为如下：
D1、所述检测检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括所述KASP_Pid4位点在内的水稻基因组DNA片段的PCR引物；
D2、所述检测水稻基因组中KASP_Pid4位点的多态性或基因型的物质为含有所述PCR引物的PCR试剂；
D3、含有D1所述PCR引物或D2所述PCR试剂的试剂盒。
9.根据权利要求8所述的水稻稻瘟病抗性基因Pid4的KASP标记开发的应用，其特征在于：所述PCR引物为P1或P2；
P1、所述PCR引物为由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的第22-48位的单链DNA、核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第22-48位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ IDNo.3的单链DNA组成的引物组；
P2、所述PCR引物为由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA、序列表中SEQ ID No.2所示的单链DNA和由序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA的引物组。
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