CN107987140A

CN107987140A - 赤霉素运输基因OsNPF3.1在提高水稻产量中的应用

Info

Publication number: CN107987140A
Application number: CN201711377108.2A
Authority: CN
Inventors: 方中明; 朱炜; 黄玮婷; 吕凯; 汪杰
Original assignee: Wuhan Bioengineering Institute
Current assignee: Wuhan Bioengineering Institute
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2017-12-19
Publication date: 2018-05-04
Anticipated expiration: 2037-12-19
Also published as: CN107987140B

Abstract

本发明公开了赤霉素运输基因OsNPF3.1在提高水稻产量中的应用，属于植物基因工程领域。OsNPF3.1基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过构建水稻OsNPF3.1基因超表达植株、OsNPF3.1基因突变体植株，发现通过缺失OsNPF3.1基因表达，可以使正常的水稻分蘖数和有效穗数增加，单株灌浆粒数和单株产量增加，而提高基因OsNPF3.1表达降低了单株水稻产量。因此OsNPF3.1基因可用于提高水稻产量。OsNPF3.1基因在阐述氮素影响植物生长及发育过程方面以及在水稻株型改良方面具有重要的应用价值。

Description

赤霉素运输基因OsNPF3.1在提高水稻产量中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及赤霉素运输基因OsNPF3.1在提高水稻产量中的应用。

背景技术

赤霉素是一类双萜酸化合物，作为植物激素不但可以调控植物体内众多基因的表达，而且可以影响高等植物生活史的各个阶段，如种子萌发、茎的伸长、花器官的诱导和发育、种子和果实的形成等。赤霉素的生物合成具有明显的器官特异性，并受发育阶段控制。

赤霉素的生物合成主要方式是控制赤霉素合成及分解相关的基因表达。如主要的控制点是后期阶段催化GA代谢的3个双加氧酶(GA20ox、GA2ox和GA3ox)[邢超，陈永胜，李跃等.赤霉素代谢和信息转导及其对植株表型的影响研究进展.安徽农业科学，2015,43(35):225-226]。赤霉素生物合成路径为：高等植物以3-磷酸甘油醛或丙酮酸为前体，首先在原质体内由环化酶催化形成贝壳杉烯；然后贝壳杉烯转移到内质网，在依赖细胞色素P450的单加氧酶的作用下转化成GA12-醛；最后转入细胞质由依赖2-酮戊二酸的双加氧酶催化成各种GAs最终产物[王荣.赤霉素信号转导的中间组分研究.生物学杂志，2007,24(2):5-8]。在植物中，GA的生物合成途径根据合成酶的特征被分为3个步骤：①GAS合成的前体——牻牛儿牻牛儿焦磷酸的形成途径；②GA12-7-醛的合成；③由GA12-7-醛合成其他GAS[袁高峰.赤霉素信号转导研究进展.细胞生物学杂志，2003,25(2):90-94]。

赤霉素不仅可以调控种子的发芽、幼苗生长，还可以调控植物体内可溶性糖和可溶性蛋白质含量，进而调控C/N[戴忠良，潘跃平，肖燕等.不同浓度赤霉素处理对结球甘蓝抽薹和开花的影响.上海农业学报，2010,26(4):69-71]。如GA3处理可使君子兰叶片可溶性蛋白质和全氮含量降低[徐东昱，徐众帅.赤霉素对君子兰开花及可溶性糖和蛋白质含量的影响.安徽农业科学，2010,(14):7220-7222]。赤霉素通过对根尖茎向生长的负调控作用，来实现对根尖分身组织生长发育的负调控作用[钮世辉，李伟，陈晓阳.赤霉素对根尖径向生长的调节作用研究.北京林业大学学报，2013,35(3):71-76]。

植物NPF家族是指能够介导2-3个氨基酸残基的小分子肽及硝酸根等物质进行跨膜运输的蛋白[Rentsch D,Schmidt S,Tegeder M.Transporters for uptake andallocation of organic nitrogen compounds in plants.FEBS Let,2007,581:2281-2289]。NRT1/PTR家族成员参与了种子形成过程中蛋白质的积累和萌发中蛋白降解后小分子多肽形式转运[Martre P,Porter J R,Jamieson P D,et al.Modeling grain nitrogenaccumulation and protein composition to understand the sink/sourceregulations of nitrogen remobilization for wheat.Plant Physiol,2003,133:1959-1967]。已有研究表明水稻OsNPF3.1蛋白能够运输赤霉素[Tal I,Zhang Y,M E,etal.The Arabidopsis NPF3protein is a GA transporter.Nature Communications,2016,7:11486]，但是到目前为止，关于OsNPF3.1基因对水稻的生物学影响没有任何报道。本发明发现OsNPF3.1基因对水稻分蘖有非常重要的负调控作用，可应用于植物株型改良从而使水稻增产。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供水稻NPF基因家族成员赤霉素运输基因OsNPF3.1在提高水稻产量中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明以水稻的NPF基因家族成员赤霉素运输基因OsNPF3.1为对象，从水稻中花11中克隆了OsNPF3.1的cDNA序列。通过构建OsNPF3.1基因超表达载体，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常粳稻品种中花11中，得到OsNPF3.1基因超表达植株，其分蘖数、有效穗数、灌浆籽粒数和产量与对照野生型中花11相比显著降低。通过CRISPR技术构建OsNPF3.1基因敲除载体，将敲除载体导入中花11中，得到OsNPF3.1基因的突变体植株，突变体植株的分蘖数、有效穗数、灌浆籽粒数和产量与中花11相比显著提高。这些结果表明，通过降低OsNPF3.1基因的表达或使OsNPF3.1基因缺失表达，可以使正常的水稻分蘖数增加，从而提高穗数、灌浆粒数和水稻产量。

基于本发明发现的OsNPF3.1基因的功能，OsNPF3.1基因可用于水稻选育中。所述的水稻选育为提高水稻分蘖数，从而提高穗数、灌浆粒数和水稻产量。具体可通过降低OsNPF3.1基因的表达或使OsNPF3.1基因缺失表达来使水稻分蘖数和每株穗数、灌浆粒数增加，达到提高水稻产量的目的。

所述的OsNPF3.1基因编码的OsNPF3.1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的OsNPF3.1基因的cDNA序列优选如SEQ ID NO.2所示。

应该理解为，在不影响OsNPF3.1蛋白活性的前提下(即不在蛋白的活性中心)，本领域技术人员可对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。因此，OsNPF3.1蛋白还包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸获得的具有同等活性的蛋白质。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明的优点和效果：

(1)本发明克隆的OsNPF3.1基因超表达后使水稻分蘖能力降低，说明OsNPF3.1基因对水稻分蘖有负调控作用，因此，通过基因工程技术降低或敲除OsNPF3.1基因的表达能够提高植物产量。这不仅有助于通过正常施氮条件下培育高产水稻，还可以通过分子育种进行植物的品种改良。

(2)OsNPF3.1基因的成功克隆，进一步证实了NPF家族在氮吸收过程中的重要作用，对阐明NPF家族的生物学功能有重要的意义，另外对进一步了解植物氮代谢途径，提高氮吸收效率有极大的推动作用。

(3)尽管目前已克隆到了一些提高植物产量的基因，但对植物增产的分子机制仍不清楚。而本发明的OsNPF3.1基因能够提高水稻的产量，对确定植物增产的关键因素有极大的推动作用。

附图说明

图1是对照中花11、OsNPF3.1基因超表达植株3个株系、OsNPF3.1基因突变体植株3个株系的整株表型图。

图2是对照中花11、OsNPF3.1基因超表达植株3个株系、OsNPF3.1基因突变体植株3个株系的分蘖数的统计柱状图，数据采用SPSS软件进行变量分析(ANOVA)，使用Duncan’s在0.05、0.01和0.001三个水平上进行差异显著性分析，与对照相比分别用*、**和***表示。

图3是对照中花11、OsNPF3.1基因超表达植株3个株系、OsNPF3.1基因突变体植株3个株系的有效穗数的统计柱状图，数据采用SPSS软件进行变量分析(ANOVA)，使用Duncan’s在0.05、0.01和0.001三个水平上进行差异显著性分析，与对照相比分别用*、**和***表示。

图4是对照中花11、OsNPF3.1基因超表达植株3个株系、OsNPF3.1基因突变体植株3个株系的单株灌浆籽粒表型图。

图5是对照中花11、OsNPF3.1基因超表达植株3个株系、OsNPF3.1基因突变体植株3个株系的单株灌浆籽粒数量统计图，数据采用SPSS软件进行变量分析(ANOVA)，使用Duncan’s在0.05、0.01和0.001三个水平上进行差异显著性分析，与对照相比分别用*、**和***表示。

图6是对照中花11、OsNPF3.1基因超表达植株3个株系、OsNPF3.1基因突变体植株3个株系的单株产量统计图，数据采用SPSS软件进行变量分析(ANOVA)，使用Duncan’s在0.05、0.01和0.001三个水平上进行差异显著性分析，与对照相比分别用*、**和***表示。

图7是对照中花11、OsNPF3.1基因超表达植株3个株系的OsNPF3.1基因表达量检测结果图，数据采用SPSS软件进行变量分析(ANOVA)，使用Duncan’s在0.05、0.01和0.001三个水平上进行差异显著性分析，与对照相比分别用*、**和***表示。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术(参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1OsNPF3.1基因超表达植株的构建

提取水稻中花11的RNA，并将其反转录成cDNA，利用引物对：

F1：5'-AGATCTATGGCGGAGGAGGAGGAGGCGAAGAAGA-3'(Bgl II)，

R1：5'-CTTAAGTCAATGACTCAAAGGTGAAGCCTT-3'(Afl II)；

通过PCR扩增OsNPF3.1基因的cDNA后，通过Bgl II、Afl II酶切后连入pCAMBIA-1301载体(pCAMBIA-1301载体购自Cambia公司)，构建出OsNPF3.1基因的超表达载体OsNPF3.1-p1301。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常水稻品种中花11中。

将得到的所有转基因小苗移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待小苗长高约10cm时，种于大田中，待苗长大后，提取基因组DNA通过PCR对转基因植株进行检测，检测引物对为：

F2：5'-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3'，

R2：5'-TCGTTATGTTTATCGGCACTTT-3'。

若扩增出517bp的片段，则说明转基因植株为阳性植株。阳性植株单株收种并种植，直至T2代鉴定出纯合的转基因植株，即得到OsNPF3.1基因超表达植株。OsNPF3.1基因超表达植株的分蘖数少于对照中花11植株，差异显著，如图1、2中所示，且单株有效穗比对照减少，如图3所示。单株收取种子统计，结果表明超表达植株每株灌浆籽粒减少，且每株产量减少，如图4、5、6所示。检测超表达植株OsNPF3.1基因的表达量，显示OsNPF3.1基因的表达与对照相比得到提高，如图7所示。

实施例2OsNPF3.1基因突变体植株的获得

F3：ACCACCCTCACCAACTTCGGCGG，

F4：TCCGCCATGACCCCGCTCATCGG。

利用上述两个靶标序列，构建出OsNPF3.1基因的基因敲除载体OsNPF3.1-C(方法参考Ma X et al，A robust CRISPR/Cas9system for convenient,high-efficiencymultiplex genome editing in monocot and dicot plants.Mol Plant.2015,8(8):1274-1284)。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将基因敲除表达载体导入正常粳稻品种中花11中。突变体植株在T0代时进行测序，确定基因已经敲除，继续繁种到T1代，即得到OsNPF3.1基因的突变体植株。OsNPF3.1基因突变体植株的分蘖数远多于对照中花11植株，差异显著，如图1、2中所示，且有效穗明显增加，如图3所示。单株收取种子统计，结果表明突变体植株每株灌浆籽粒增加，且每株产量增加，如图4、5、6所示。

上述结果表明，通过敲除OsNPF3.1基因的表达，可以增加水稻的分蘖数，进而提高穗数和水稻产量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉生物工程学院

<120> 赤霉素运输基因OsNPF3.1在提高水稻产量中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 597

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 1

Met Ala Glu Glu Glu Glu Ala Lys Lys Ser Lys Met Arg Lys Lys Gly

1 5 10 15

Gly Phe Arg Thr Met Pro Phe Ile Phe Ala Asn Glu Val Ala Glu Lys

20 25 30

Leu Ala Val Leu Gly Phe Thr Thr Asn Met Leu Met Tyr Leu Thr Arg

35 40 45

Gln Leu His Met Pro Leu Ala Lys Ala Ala Thr Thr Leu Thr Asn Phe

50 55 60

Gly Gly Val Ser Ala Met Thr Pro Leu Ile Gly Ala Phe Leu Ala Asp

65 70 75 80

Ser Leu Val Gly Arg Phe Trp Thr Ile Ala Ala Ala Ser Leu Ile Tyr

85 90 95

Gln Val Gly Met Leu Leu Leu Thr Val Ser Ala Ala Met Pro Val Phe

100 105 110

Arg Pro Pro Pro Cys Ser Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Cys Asp Glu

115 120 125

Ala Ala Pro Trp Gln Leu Ala Val Leu Tyr Ala Ala Leu Leu Leu Asn

130 135 140

Ala Leu Gly Ala Gly Gly Tyr Arg Pro Cys Val Val Ala Phe Gly Ala

145 150 155 160

Asp Gln Phe Asp Glu Ser Glu Ala Ala Glu Arg Ala Arg Thr Trp Gly

165 170 175

Phe Phe Asn Trp Tyr Tyr Phe Cys Asn Gly Ala Ser Gln Leu Val Ala

180 185 190

Val Thr Ala Val Val Tyr Val Gln Asp Asn Val Gly Trp Gly Trp Gly

195 200 205

Leu Gly Val Pro Thr Phe Cys Met Ala Val Ser Val Val Ala Phe Val

210 215 220

Ala Gly Tyr Pro Leu Tyr Arg Arg Leu His Pro Ser Gly Ser Pro Phe

225 230 235 240

Thr Arg Leu Ala Gln Val Val Val Ala Ala Val Arg Lys Arg Arg Val

245 250 255

Pro Thr Asp Ala Asp Asp Ala Ala Ala Leu Tyr Glu Asn Asp Asp Met

260 265 270

Asp Ala Pro Ile Ser Leu Tyr Gly Lys Leu Val His Thr Glu Gln Leu

275 280 285

Ser Phe Phe Asp Arg Ala Ala Ile Val Thr Asp Gly Asp Leu Thr Thr

290 295 300

Asp Thr Ser Asn Gly Lys Pro Ser Leu Ser Pro Ile Pro Lys Pro Trp

305 310 315 320

Arg Leu Ser Thr Val His Arg Val Glu Glu Leu Lys Ser Leu Leu Arg

325 330 335

Met Gly Pro Ile Trp Ala Ala Gly Ile Leu Val Ile Thr Ala Tyr Ser

340 345 350

Gln Gln His Thr Phe Ala Leu Gln Gln Ala Ser Thr Met Asp Arg Arg

355 360 365

Leu Ala Pro Gly Leu Ser Ser Phe Gln Ile Pro Ala Gly Ser Met Thr

370 375 380

Val Phe Thr Leu Leu Ala Met Leu Thr Thr Leu Leu Ala Tyr Asp Arg

385 390 395 400

Val Leu Val Pro Leu Ala Arg Arg Val Thr Gly Leu Asp Arg Gly Ile

405 410 415

Ser Tyr Leu His Arg Met Gly Val Gly Phe Ala Ile Ser Val Ala Ala

420 425 430

Thr Leu Val Ala Gly Phe Val Glu Arg His Arg Arg Glu Ser Ala Ala

435 440 445

Ala Ala Gly Thr Thr Asp Ala Gly Thr Ser Pro Leu Ser Ala Tyr Trp

450 455 460

Leu Val Pro Gln Tyr Ala Leu His Gly Met Ala Glu Ala Phe Asn Ser

465 470 475 480

Val Gly His Leu Glu Phe Met Tyr Asp Gln Ser Pro Glu Ser Met Arg

485 490 495

Ser Met Ala Thr Ala Leu Phe Trp Leu Ser Ile Ser Leu Gly Ser Tyr

500 505 510

Val Ser Thr Met Leu Ile Ser Ala Val His Arg Trp Ser Ala Gly Ala

515 520 525

Asp Gly Ser Asn Trp Leu Pro Asp Asn Ile Asn Arg Gly Arg Leu Asp

530 535 540

Tyr Phe Tyr Trp Ile Val Ala Leu Leu Gln Val Leu Asn Leu Ala Tyr

545 550 555 560

Tyr Ala Ile Cys Ala Arg Cys Tyr Leu Phe Lys Pro Leu Gln Leu Arg

565 570 575

Glu Val Asp Asp Asp Ala Lys Pro Gln Ile Glu Leu Gln Glu Lys Ala

580 585 590

Ser Pro Leu Ser His

595

<210> 2

<211> 1794

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 2

atggcggagg aggaggaggc gaagaagagc aagatgagga agaagggtgg gttcagaacg 60

atgcccttca tcttcgcgaa cgaggtggcg gagaagctgg ccgtgctggg gttcacgacg 120

aacatgctca tgtacctgac gaggcagctg cacatgccgc tcgccaaggc cgccaccacc 180

ctcaccaact tcggcggcgt ctccgccatg accccgctca tcggcgcctt cctcgccgac 240

tccctcgtcg gccgcttctg gaccatcgcc gccgcctccc tcatctacca agtcggcatg 300

ctcctcctga cggtgtcggc ggcgatgccg gtgttccggc cgccgccgtg cagcggcgcc 360

ggcggcgcgg gcgcgtgcga cgaggcggcg ccgtggcagc tggcggtgct gtacgcggcg 420

ctgctgctga acgcgctggg cgccggcggg tacaggccgt gcgtggtggc gttcggcgcc 480

gaccagttcg acgagtcgga ggcggcggag cgggcgcgca cctggggctt cttcaactgg 540

tactacttct gcaacggcgc gtcgcagctg gtcgccgtca cggcggtggt gtacgtgcag 600

gacaacgtcg gctggggctg gggcctcggt gtgcccacct tctgcatggc cgtctccgtc 660

gtcgccttcg tcgccggcta cccgctctac cggaggctcc acccgtcggg gagccccttc 720

acgcggctcg cgcaggtggt cgtcgccgcc gtcaggaagc ggcgggtgcc gacggacgcc 780

gacgacgccg cggcgctgta cgagaacgac gacatggacg cgcccatctc gctctacggc 840

aagctcgtcc acaccgaaca actcagcttt tttgaccgag cggccatcgt caccgacggc 900

gacctgacga cggacacctc caacggcaag ccgtcgttgt ctcccatccc caagccgtgg 960

cggctgagca cggtgcaccg cgtcgaggag ctcaagtcgc tgctccgcat gggcccgatc 1020

tgggcagcgg gcatcctggt gatcacggcg tactcgcagc agcacacctt cgccctgcag 1080

caggcgagca ccatggaccg ccgcctcgcg ccggggctgt cgtcgttcca gatcccagca 1140

ggctccatga ccgtgttcac cctgctcgcc atgctcacca cgctccttgc ctacgaccgt 1200

gtgctcgtcc cgctagcgcg ccgcgtcacg ggactggacc gtggaatctc ctacctccac 1260

cggatgggcg ttgggttcgc catctccgtg gcggctaccc tcgtggccgg gttcgtggag 1320

cgccaccgga gggagtccgc tgccgccgcg ggcaccaccg acgcggggac gtcgccgctg 1380

tcggcgtact ggctggtgcc gcagtacgcg ctccacggca tggcggaggc attcaactcc 1440

gtgggtcacc tcgagttcat gtacgaccag tcgccagaga gcatgcggag catggcgacg 1500

gcgctgttct ggctgtccat ctcgctgggg agctacgtca gcacgatgct catctccgcc 1560

gtgcatcgat ggagcgccgg cgccgacggg tccaactggc tccccgacaa catcaaccgc 1620

ggcaggctcg actacttcta ctggatcgtc gcgctgctcc aggtgctcaa cctggcatac 1680

tacgccattt gcgctaggtg ctacttgttc aagcccttgc agctccgtga ggtggacgat 1740

gatgccaagc cccaaattga gctgcaagaa aaggcttcac ctttgagtca ttga 1794

Claims

1.OsNPF3.1基因在水稻选育中的应用，其特征在于：所述的水稻选育为提高水稻分蘖数。

2.OsNPF3.1基因在提高水稻穗数中的应用。

3.OsNPF3.1基因在提高水稻灌浆粒数中的应用。

4.OsNPF3.1基因在提高水稻产量中的应用。

5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于：通过降低OsNPF3.1基因的表达或使OsNPF3.1基因缺失表达实现所述应用。

6.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于：所述的OsNPF3.1基因编码的OsNPF3.1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或OsNPF3.1蛋白为SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸获得的具有同等活性的蛋白质。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的OsNPF3.1基因的cDNA序列如SEQ IDNO.2所示。