CN108070601A

CN108070601A - OsNPF8.6b基因在提高水稻产量中的应用

Info

Publication number: CN108070601A
Application number: CN201711377109.7A
Authority: CN
Inventors: 方中明; 聂海鹏; 黄玮婷; 吕凯; 汪杰
Original assignee: Wuhan Bioengineering Institute
Current assignee: Wuhan Bioengineering Institute
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2017-12-19
Publication date: 2018-05-25
Anticipated expiration: 2037-12-19
Also published as: CN108070601B

Abstract

本发明公开了OsNPF8.6b基因在提高水稻产量中的应用，属于植物基因工程领域。OsNPF8.6b基因编码蛋白质的氨基酸及其cDNA序列如SEQ ID NO.1、2所示。本发明通过构建水稻OsNPF8.6b基因的超表达植株，发现提高OsNPF8.6b基因的表达，可以使水稻分蘖数和有效穗增加，单株灌浆粒数和单株灌浆籽粒干重提高。通过构建突变体植株，发现通过敲除OsNPF8.6b基因表达可以使水稻分蘖数减少，单株灌浆粒数和单株灌浆籽粒干重降低。因此OsNPF8.6b基因可用于促进水稻产量的提高。OsNPF8.6b基因在水稻氮利用效率提高方面具有重要应用。

Description

OsNPF8.6b基因在提高水稻产量中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及OsNPF8.6b基因在提高水稻产量中的应用。

背景技术

植物通过吸收土壤中的铵根、硝酸根、氨基酸、可溶性肽等来获得氮素；氮的吸收和转运主要依靠铵根运输蛋白(AMT)、硝酸根运输蛋白(NRT)、氨基酸运输蛋白(AAT)、肽运输蛋白(PTR)等运输蛋白来完成(Williams L,Miller A.Transporters responsible forthe uptake and partitioning of nitrogenous solutes.Annual Review of PlantPhysiology and Plant Molecular Biology,2001,52:659-688.)。铵通过植物AMT吸收后再通过谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合酶(GOGAT)合成谷氨酰胺和谷氨酸，后者再进一步形成其它氨基酸(Sonoda Y,Ikeda A,Saiki S,et al.Feedback regulation of theammonium transporter gene family AMT1by glutamine in rice.Plant CellPhysiology,2003,44:1396-1402.)。植物可通过高亲和转运系统(HATS)的NRT2和低亲和转运系统(LATS)的NRT1吸收环境中的硝酸盐，由硝酸还原酶(NR)和亚硝酸还原酶(NiR)还原形成铵，再进一步形成氨基酸(Paungfoo-Lonhienne C,Lonhienne T G,Rentsch D,etal.Plants can use protein as a nitrogen source without assistance from otherorganisms.Proceedings of the National Academy of Sciences,2008,105:4524-4529.)。

氮运输NPF家族包括NRT1和PTR亚家族，不同成员在植株不同部位运输硝酸根、寡肽或氨基酸等，在植株生长发育上起不同的作用(Rentsch D,Schmidt S,TegederM.Transporters for uptake and allocation of organic nitrogen compounds inplants.Febs Letters,2007,581:2281-2289.)。OsNPF2.2介导了木质部硝酸根的卸载，影响水稻植株生长(Li Y,Ouyang J,Wang Y Y,et al.Disruption of the rice nitratetransporter OsNPF2.2hinders root-to-shoot nitrate transport and vasculardevelopment.Scientific reports,2015,5:9635.)。OsNPF7.2对硝酸根有低亲和运输，能够影响植株生长(Hu R,Qiu D,Chen Y,et al.Knock-down of a tonoplast localizedlow-affinity nitrate transporter OsNPF7.2affects rice growth under highnitrate supply.Frontiers in plant science,2016,7.)。

虽然已知氮营养可以促进植物生长发育，但是氮营养影响了植株什么类型的生长发育目前还没有系统的了解。另外水稻NPF家族有80多个成员，氮营养是通过NPF基因家族什么成员进行响应，在什么部位介导了氮营养运输，从而影响了植株什么类型的生长发育，目前也几乎未知。所以，挖掘出NPF家族中可能具有氮高效运输基因，特别是能够控制水稻农艺性状的氮运输关键基因，将有利于水稻高产品种的培育。本发明通过长期研究后发现，NPF家族OsNPF8.6基因转录后有两种剪接，分别是OsNPF8.6a和OsNPF8.6b，其中OsNPF8.6b对水稻产量提高重要的作用。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供OsNPF8.6b基因在提高水稻产量中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明以水稻OsNPF8.6b基因为对象，从水稻中花11中克隆了OsNPF8.6b的cDNA序列。通过构建OsNPF8.6b基因的超表达载体，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常粳稻品种中花11中，得到OsNPF8.6b基因的超表达植株，超表达植株的分蘖、有效穗、灌浆籽粒数和灌浆籽粒干重等与对照野生型中花11相比显著提高。同时构建了OsNPF8.6b基因的CRISPR基因敲除载体，将CRISPR基因敲除载体导入中花11中，得到OsNPF8.6b基因的突变体植株，其分蘖、有效穗、灌浆籽粒数和灌浆籽粒干重等与中花11相比显著降低。这些结果表明，通过提高OsNPF8.6b基因表达，可以促进水稻产量的提高；可通过分子育种应用于水稻品种改良中。

基于本发明发现的OsNPF8.6b基因的功能，其可用于促进水稻产量的提高。具体可通过基因工程实现，即提高OsNPF8.6b基因的表达，使水稻分蘖、有效穗、单株灌浆籽粒数、单株灌浆籽粒干重等增加。

所述的OsNPF8.6b基因编码的OsNPF8.6b蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的OsNPF8.6b基因的cDNA序列优选如SEQ ID NO.2所示。

应该理解为，在不影响OsNPF8.6b蛋白活性的前提下(即不在蛋白的活性中心)，本领域技术人员可对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。因此，OsNPF8.6b蛋白还包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸获得的具有同等活性的蛋白质。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明的优点和效果：

(1)本发明克隆的OsNPF8.6b基因提高表达后可以使水稻分蘖、有效穗、单株灌浆籽粒数、单株灌浆籽粒干重增加，说明OsNPF8.6b基因对提高水稻产量提高有较明显作用，因此，通过基因工程技术提高OsNPF8.6b基因的表达能够提高植物产量。这不仅有助于通过减少氮肥使用培育高产水稻，还可以通过分子育种进行植物的品种改良。

(2)尽管目前已克隆到了一些氮营养途径中的基因，但氮营养途径是如何对植物发挥影响的仍不清楚。而本发明克隆的OsNPF8.6b基因能够提高水稻产量，对确定植物高产的关键因素有极大的推动作用。

附图说明

图1是大田种植下对照中花11(WT)、OsNPF8.6b基因超表达植株T2代的3个株系(OsNPF8.6b-OE)和OsNPF8.6b基因突变体植株T2代(OsNPF8.6b-C)的整株表型图。

图2是大田种植下对照中花11(WT)、OsNPF8.6b基因超表达植株T2代的3个株系(OsNPF8.6b-OE)和OsNPF8.6b基因突变体植株T2代(OsNPF8.6b-C)的分蘖数统计图。数据采用SPSS软件进行变量分析(ANOVA)，使用Duncan’s在0.05、0.01、0.001三个水平上进行差异显著性分析，具有三种水平显著的分别标为*、**、***。

图3是大田种植下对照中花11(WT)、OsNPF8.6b基因超表达植株T2代的3个株系(OsNPF8.6b-OE)和OsNPF8.6b基因突变体植株T2代(OsNPF8.6b-C)的有效穗统计图。数据采用SPSS软件进行变量分析(ANOVA)，使用Duncan’s在0.05、0.01、0.001三个水平上进行差异显著性分析，具有三种水平显著的分别标为*、**、***。

图4是大田种植下对照中花11(WT)、OsNPF8.6b基因超表达植株T2代的3个株系(OsNPF8.6b-OE)和OsNPF8.6b基因突变体植株T2代(OsNPF8.6b-C)的单株灌浆籽粒数表型图。

图5是大田种植下对照中花11(WT)、OsNPF8.6b基因超表达植株T2代的3个株系(OsNPF8.6b-OE)和OsNPF8.6b基因突变体植株T2代(OsNPF8.6b-C)的单株灌浆籽粒数统计图。数据采用SPSS软件进行变量分析(ANOVA)，使用Duncan’s在0.05、0.01、0.001三个水平上进行差异显著性分析，具有三种水平显著的分别标为*、**、***。

图6是大田种植下对照中花11(WT)、OsNPF8.6b基因超表达植株T2代的3个株系(OsNPF8.6b-OE)和OsNPF8.6b基因突变体植株T2代(OsNPF8.6b-C)的单株灌浆籽粒干重统计图。数据采用SPSS软件进行变量分析(ANOVA)，使用Duncan’s在0.05、0.01、0.001三个水平上进行差异显著性分析，具有三种水平显著的分别标为*、**、***。

图7是大田种植下对照中花11(WT)、OsNPF8.6b基因超表达植株T2代的3个株系(OsNPF8.6b-OE)的OsNPF8.6b基因的表达量检测结果图。数据采用SPSS软件进行变量分析(ANOVA)，使用Duncan’s在0.05、0.01、0.001三个水平上进行差异显著性分析，具有三种水平显著的分别标为*、**、***。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术(参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Ma X et al，A robust CRISPR/Cas9system forconvenient,high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicotplants.Mol Plant.2015,8(8):1274-1284.)完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1OsNPF8.6b基因超表达植株的构建

提取水稻中花11的RNA，并将其反转录成cDNA，利用引物对：

F1：5'-AGATCTATGGAAGAGGCAGCAGAAGATAGGCGA-3'(Bgl II)，

R1：5'-CTTAAGTCATGCTTTCTTGTATCTGTATCTCAT-3'(Afl II)；

利用F1和R1引物分别通过PCR扩增OsNPF8.6b基因的cDNA后，通过Bgl II和Afl II酶切后连入pCAMBIA-1301载体(pCAMBIA-1301载体购自Cambia公司)，构建出OsNPF8.6b基因的超表达载体OsNPF8.6b-p1301。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将超表达载体分别导入正常水稻品种中花11中。

将得到的所有转基因小苗移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待小苗长高约10cm时，将50株水稻转基因小苗浸泡于500mL蒸馏水制备的浓度为50mg/L的潮霉素溶液48小时，之后叶子为绿色并舒张、生长状态良好的植株为阳性转基因植株；而叶子枯黄并卷曲的植株为阴性植株，随即死亡。阳性植株单株种植并收种，直至T2代鉴定出在上述潮霉素溶液中无任何叶子枯黄并卷曲的为纯合的转基因植株，即得到OsNPF8.6b基因的超表达植株。将超表达植株、中花11的种子在培养皿上用蒸馏水浸种3天并培养7天后，转入水稻营养液培养，培养20天，种植于大田，统计分蘖数、有效穗、单株灌浆籽粒数、单株灌浆籽粒干重，结果见图1-6。由图1-6可见在大田培养下，OsNPF8.6b基因超表达植株T2代与对照中花11植株相比，分蘖数、有效穗、单株灌浆籽粒数和单株灌浆籽粒干重都比对照增加，三个株系都达到差异显著。检测超表达植株OsNPF8.6b基因的表达量，显示OsNPF8.6b基因表达与对照相比得到提高，如图7所示。

实施例2OsNPF8.6b基因突变体植株的构建

F2：5'-AGAAATGTTACAACTTGGCAGGG-3'，

F3：5'-ATTCTTACTGGGGAAAGTACTGG-3'。

利用上述F2和F3两个靶标序列，构建出OsNPF8.6b基因的基因敲除载体OsNPF8.6b-C(方法参考Ma X et al，A robust CRISPR/Cas9system for convenient,high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants.MolPlant.2015,8(8):1274-1284.)。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将基因敲除表达载体导入正常粳稻品种中花11中。

将得到的所有转基因小苗移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待小苗长高约10cm时，将50株水稻转基因小苗浸泡于500mL蒸馏水制备的浓度为50mg/L的潮霉素溶液48小时，之后叶子为绿色并舒张、生长状态良好的植株为阳性转基因植株，而叶子枯黄并卷曲的植株为阴性植株，随即死亡。阳性植株在T1代时进行测序，确定基因已经敲除，单株收种并种植，直至T2代得到突变体植株。将突变体植株、中花11的种子在培养皿上用蒸馏水浸种3天并培养7天后，转入水稻营养液培养，培养20天，种植于大田，统计分蘖数、有效穗、单株灌浆籽粒数、单株灌浆籽粒干重，结果见图1-6。由图1-6可见在大田培养下，OsNPF8.6b基因突变体植株T2代与对照中花11植株相比，分蘖数、有效穗、单株灌浆籽粒数和单株灌浆籽粒干重都比对照减少，达到差异显著。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉生物工程学院

<120> OsNPF8.6b基因在提高水稻产量中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 540

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 1

Met Phe Phe His Pro Ser Leu Val Thr Gly Asp Glu Cys Cys Glu Arg

1 5 10 15

Leu Ala Tyr Tyr Gly Ile Ala Lys Asn Leu Val Thr Tyr Leu Lys Thr

20 25 30

Asn Leu His Gln Gly Asn Leu Glu Ala Ala Arg Asn Val Thr Thr Trp

35 40 45

Gln Gly Thr Cys Tyr Leu Thr Pro Leu Ile Gly Ala Leu Leu Ala Asp

50 55 60

Ser Tyr Trp Gly Lys Tyr Trp Thr Ile Ala Ala Phe Ser Ala Ile Tyr

65 70 75 80

Phe Ile Gly Leu Val Ala Leu Thr Leu Ser Ala Ser Val Pro Ala Leu

85 90 95

Gln Pro Pro Lys Cys Ser Gly Ser Ile Cys Pro Glu Ala Ser Leu Leu

100 105 110

Gln Tyr Gly Val Phe Phe Ser Gly Leu Tyr Met Ile Ala Leu Gly Thr

115 120 125

Gly Gly Ile Lys Pro Cys Val Ser Ser Phe Gly Ala Asp Gln Phe Asp

130 135 140

Asp Ser Asp Pro Ala Asp Arg Val Lys Lys Gly Ser Phe Phe Asn Trp

145 150 155 160

Phe Tyr Phe Cys Ile Asn Ile Gly Ala Phe Val Ser Gly Thr Val Ile

165 170 175

Val Trp Ile Gln Asp Asn Ser Gly Trp Gly Ile Gly Phe Ala Ile Pro

180 185 190

Thr Ile Phe Met Ala Leu Ala Ile Ala Ser Phe Phe Val Ala Ser Asn

195 200 205

Met Tyr Arg Phe Gln Lys Pro Gly Gly Ser Pro Leu Thr Arg Val Cys

210 215 220

Gln Val Val Val Ala Ala Phe Arg Lys Trp His Thr Glu Val Pro His

225 230 235 240

Asp Thr Ser Leu Leu Tyr Glu Val Asp Gly Gln Thr Ser Ala Ile Glu

245 250 255

Gly Ser Arg Lys Leu Glu His Thr Ser Glu Leu Glu Phe Phe Asp Lys

260 265 270

Ala Ala Ile Ile Ser Ser Asp Asp Ala Lys Ser Asp Ser Phe Thr Asn

275 280 285

Pro Trp Arg Leu Cys Thr Val Thr Gln Val Glu Glu Leu Lys Ile Leu

290 295 300

Ile Arg Met Phe Pro Ile Trp Ala Thr Thr Ile Ile Phe Asn Ala Val

305 310 315 320

Tyr Ala His Asn Ser Ser Met Phe Ile Glu Gln Gly Met Val Leu Asp

325 330 335

Lys Arg Val Gly Ser Phe Ile Val Pro Pro Ala Ser Leu Ser Thr Phe

340 345 350

Asp Val Ile Ser Val Ile Ile Trp Ile Pro Phe Tyr Gly Arg Val Leu

355 360 365

Val Pro Ile Ala Arg Lys Phe Thr Gly Arg Glu Lys Gly Phe Ser Glu

370 375 380

Leu Gln Arg Ile Gly Ile Gly Leu Ala Leu Ser Ile Leu Ala Met Leu

385 390 395 400

Ser Ala Ala Leu Val Glu Leu Arg Arg Leu Gly Ile Ala Arg Ser Glu

405 410 415

Gly Leu Ile His Glu Asp Val Ala Val Pro Met Ser Ile Leu Trp Gln

420 425 430

Ile Pro Gln Tyr Phe Leu Val Gly Ala Ala Glu Val Phe Ala Ala Ile

435 440 445

Gly Gln Val Glu Phe Phe Tyr Asn Glu Ala Pro Asp Ala Met Arg Ser

450 455 460

Leu Cys Ser Ala Phe Ala Leu Val Thr Val Ser Leu Gly Ser Tyr Leu

465 470 475 480

Ser Ser Ile Ile Leu Thr Leu Val Ser Tyr Phe Thr Thr Gln Gly Gly

485 490 495

Asp Pro Gly Trp Ile Pro Asp Asn Leu Asn Glu Gly His Leu Asp Arg

500 505 510

Phe Phe Ser Leu Ile Ala Gly Ile Asn Phe Val Asn Leu Leu Val Phe

515 520 525

Thr Gly Cys Ala Met Arg Tyr Arg Tyr Lys Lys Ala

530 535 540

<210> 2

<211> 1623

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 2

atgttttttc atcctagttt ggtgacaggg gatgaatgct gtgagagact ggcctattat 60

ggtattgcaa agaacctagt tacttatctg aaaacaaatc ttcatcaagg caaccttgaa 120

gctgcaagaa atgttacaac ttggcagggg acatgctacc taacacccct cattggtgcc 180

ctcctagcag attcttactg gggaaagtac tggactattg ctgctttctc agcaatttat 240

tttattggtc tggttgcttt gacgctgtca gcatcagttc cagctctgca gccgcctaaa 300

tgttcaggat ctatttgtcc agaagcaagc ttactccagt atggtgtatt tttctctggc 360

ctctatatga tagccctcgg gactggaggc atcaaacctt gtgtatcatc ctttggagct 420

gatcaatttg atgacagtga tccagcagac agagtaaaga agggctcctt cttcaattgg 480

ttttacttct gtataaatat cggtgcattt gtatcaggca ccgttatagt ttggatacaa 540

gataactcag gttgggggat aggatttgcc attcctacta tatttatggc attagcgatt 600

gcaagtttct ttgttgcctc aaatatgtac agatttcaga aacctggtgg aagccctctt 660

acaagagtgt gtcaggttgt tgttgcagca ttccgtaagt ggcacactga agtgccacat 720

gatacatctc ttttatatga ggttgatggc cagacttcag cgattgaggg aagccggaag 780

ctggagcaca caagtgaact tgaattcttt gacaaggctg ccatcatctc atctgatgat 840

gccaagagtg actcctttac aaatccgtgg aggctatgca ctgtcaccca ggtggaagaa 900

ctgaaaattc taatcagaat gtttcccatt tgggccacta ctattatatt caacgcggtg 960

tatgctcaca actcttctat gttcatagag cagggaatgg ttcttgacaa gcgagttgga 1020

tctttcattg tccctcctgc atccctctca acttttgatg tcatcagtgt catcatctgg 1080

attccgtttt atggccgtgt gcttgtgcca atagctagaa agttcactgg aagggagaag 1140

ggtttctctg agttacagcg gattggaatc ggattagccc tctccatcct tgcaatgcta 1200

tctgcagctc ttgttgagtt gaggcgttta gggatcgcca gatctgaagg tcttattcat 1260

gaggatgttg ctgttccgat gagcattctt tggcaaatac cgcagtattt cttggttggc 1320

gctgctgagg tctttgctgc cataggtcag gttgagttct tctacaatga agcccctgat 1380

gccatgagga gtttgtgtag tgcatttgcg cttgtaacag tctcactggg gagctattta 1440

agctcaatca tattaacctt ggtgtcatat tttacaactc aaggagggga tcctggatgg 1500

atcccagata acctgaatga aggccaccta gatcggttct tttcattgat tgctgggatc 1560

aactttgtga atttactggt tttcactggt tgtgcaatga gatacagata caagaaagca 1620

tga 1623

Claims

1.OsNPF8.6b基因在提高水稻分蘖数中的应用。

2.OsNPF8.6b基因在提高水稻有效穗数中的应用。

3.OsNPF8.6b基因在提高水稻产量中的应用。

4.根据权利要3所述的应用，其特征在于：所述的水稻产量包括水稻单株籽粒粒数和单株籽粒干重。

5.OsNPF8.6b基因在水稻品种改良中的应用。

6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于：通过提高OsNPF8.6b基因的表达，实现所述应用。

7.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于：所述的OsNPF8.6b基因编码的OsNPF8.6b蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或OsNPF8.6b蛋白为SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸获得的具有同等活性的蛋白质。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的OsNPF8.6b基因的cDNA序列如SEQID NO.2所示。