CN107056909A

CN107056909A - OsNPF5.11基因在提高水稻产量中的应用

Info

Publication number: CN107056909A
Application number: CN201710368834.1A
Authority: CN
Inventors: 方中明; 黄玮婷; 汪杰; 吕凯
Original assignee: Wuhan Bioengineering Institute
Current assignee: Wuhan Bioengineering Institute
Priority date: 2017-05-23
Filing date: 2017-05-23
Publication date: 2017-08-18
Anticipated expiration: 2037-05-23
Also published as: CN107056909B

Abstract

本发明公开了OsNPF5.11基因在提高水稻产量中的应用，属于植物基因工程领域。OsNPF5.11基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过构建水稻OsNPF5.11基因超表达植株、OsNPF5.11基因干扰植株，发现通过提高OsNPF5.11基因表达，可以使正常的水稻分蘖数、每株灌浆粒数增加，因此OsNPF5.11基因可用于水稻选育中以提高水稻产量。OsNPF5.11基因在阐述氮素影响植物生长及发育过程方面以及在水稻株型改良方面具有重要的应用价值。

Description

OsNPF5.11基因在提高水稻产量中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及OsNPF5.11基因在提高水稻产量中的应用。

背景技术

植物通过吸收土壤中的氨、硝酸根、氨基酸、可溶性肽等来获得氮素；氮的吸收和转运主要依靠铵根运输蛋白（AMT）、硝酸根运输蛋白（NRT）、氨基酸运输蛋白（AAT）、肽运输蛋白（PTR）等运输蛋白来完成（Williams L, Miller A. Transporters responsible forthe uptake and partitioning of nitrogenous solutes. Annual Review of PlantPhysiology and Plant Molecular Biology, 2001, 52: 659-688.）。铵通过植物AMT吸收后再通过谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合酶（GOGAT）合成谷氨酰胺和谷氨酸，后者再进一步形成其它氨基酸（Sonoda Y, Ikeda A, Saiki S, et al. Feedback regulation ofthe ammonium transporter gene family AMT1 by glutamine in rice. Plant CellPhysiology, 2003, 44: 1396-1402.）。植物可通过高亲和转运系统（HATS）的NRT2和低亲和转运系统（LATS）的NRT1吸收环境中的硝酸盐，由硝酸还原酶（NR）和亚硝酸还原酶（NiR）还原形成铵，再进一步形成氨基酸（Paungfoo-Lonhienne C, Lonhienne T G, Rentsch D,et al. Plants can use protein as a nitrogen source without assistance fromother organisms. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2008, 105:4524-4529.）。

氮运输NPF家族包括NRT1和PTR亚家族，不同成员在植株不同部位运输硝酸根、寡肽或氨基酸等，在植株生长发育上起不同的作用（Rentsch D, Schmidt S, Tegeder M.Transporters for uptake and allocation of organic nitrogen compounds inplants. Febs Letters, 2007, 581: 2281-2289.）。OsNPF2.2介导了木质部硝酸根的卸载，影响水稻生长（Li Y, Ouyang J, Wang Y Y, et al. Disruption of the ricenitrate transporter OsNPF2.2 hinders root-to-shoot nitrate transport andvascular development. Scientific reports, 2015, 5: 9635.）。OsNPF7.2对硝酸根有低亲和运输，能够影响植株生长（Hu R, Qiu D, Chen Y, et al. Knock-down of atonoplast localized low-affinity nitrate transporter OsNPF7.2 affects ricegrowth under high nitrate supply. Frontiers in plant science, 2016, 7.）。

虽然已知氮营养可以促进植物生长发育，但是氮营养影响了植株什么类型的生长发育目前还没有系统的了解。另外水稻NPF家族有80多个成员，氮营养是通过NPF基因家族什么成员进行响应，在什么部位介导了氮营养运输，从而影响了植株什么类型的生长发育，目前也几乎未知。所以，挖掘出NPF家族中可能具有氮高效运输基因，特别是能够控制水稻株型的氮运输关键基因，将有利于水稻高产品种的培育。本发明通过长期研究后发现，NPF家族OsNPF5.11基因有两种选择性剪接形式，第一种剪接形式发挥主要作用，对水稻分蘖有重要的正调控作用。序列通过超表达后，可直接应用于植物株型改良，从而使水稻增产。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供水稻NPF基因家族成员OsNPF5.11基因在提高水稻产量中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明以水稻的NPF基因家族成员OsNPF5.11基因为对象，从水稻中花11中克隆了OsNPF5.11的cDNA序列。通过构建OsNPF5.11基因超表达载体，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常粳稻品种中花11中，得到OsNPF5.11基因超表达植株，其分蘖数、灌浆粒数与对照野生型中花11相比显著提高。通过RNAi技术构建OsNPF5.11基因干扰表达载体，将干扰表达载体导入中花11中，得到OsNPF5.11基因表达量下降的干扰植株，干扰植株的分蘖数、灌浆粒数与中花11相比显著降低。这些结果表明，通过提高OsNPF5.11基因的表达，可以使正常的水稻分蘖数、灌浆粒数增加，从而提高水稻产量。

基于本发明发现的OsNPF5.11基因的功能，OsNPF5.11基因可用于水稻选育中。所述的水稻选育为提高水稻分蘖数、灌浆粒数，从而提高水稻产量。具体可通过提高OsNPF5.11基因的表达使水稻分蘖数和每株灌浆粒数增加，达到提高水稻产量的目的。

OsNPF5.11基因也可用于提高其他植物的产量，如通过转基因使OsNPF5.11基因在植物中（超量）表达，来提高植物的分枝数量，进而使植物的产量得到提高。所述的植物是指单子叶植物或双子叶植物；如：小麦、番茄、草坪草或苜蓿等。

所述的OsNPF5.11基因编码的OsNPF5.11蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的OsNPF5.11基因的cDNA序列优选如SEQ ID NO.2所示。

应该理解为，在不影响OsNPF5.11蛋白活性的前提下（即不在蛋白的活性中心），本领域技术人员可对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。因此，OsNPF5.11蛋白还包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸获得的具有同等活性的蛋白质。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明的优点和效果：

（1）本发明克隆的OsNPF5.11基因超表达后使水稻分蘖数和灌浆粒数增加，说明OsNPF5.11基因对提高水稻产量有明显影响，因此，通过基因工程技术提高OsNPF5.11基因的表达能够提高植物产量。这不仅有助于通过正常施氮条件下培育高产水稻，还可以通过分子育种进行植物的品种改良。

（2）OsNPF5.11基因的成功克隆，进一步证实了NPF家族在氮吸收过程中的重要作用，对阐明NPF家族的生物学功能有重要的意义，另外对进一步了解植物氮代谢途径，提高氮吸收效率有极大的推动作用。

（3）尽管目前已克隆到了一些提高植物产量的基因，但对植物增产的分子机制仍不清楚。而本发明克隆的OsNPF5.11基因能够提高水稻的产量，对确定植物增产的关键因素有极大的推动作用。

附图说明

图1是对照中花11、OsNPF5.11基因超表达植株2个株系和OsNPF5.11基因干扰植株2个株系的整株表型图。

图2是对照中花11、OsNPF5.11基因超表达植株2个株系和OsNPF5.11基因干扰植株2个株系分蘖数的统计柱状图，数据采用SPSS软件进行变量分析（ANOVA），使用Duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，不同组别小写字母（a、b、c）表示差异显著。

图3是对照中花11、OsNPF5.11基因超表达植株2个株系和OsNPF5.11基因干扰植株2个株系的每株种子灌浆粒数图。

图4是对照中花11、OsNPF5.11基因超表达植株2个株系和OsNPF5.11基因干扰植株2个株系每株种子灌浆粒数的统计柱状图，数据采用SPSS软件进行变量分析（ANOVA），使用Duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，不同组别小写字母（a、b、c）表示差异显著。

图5是对照中花11、OsNPF5.11基因超表达植株2个株系和OsNPF5.11基因干扰植株2个株系中OsNPF5.11基因相对表达量的统计柱状图，数据采用SPSS软件进行变量分析（ANOVA），使用Duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，不同组别小写字母（a、b、c）表示差异显著。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术（参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约）完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1 OsNPF5.11基因超表达植株的构建

提取水稻中花11的RNA，并将其反转录成cDNA，利用引物对：

F1：5'-GGTACCATGTCGGGGAAGAAGCCGACGGCG-3'（kpnI），

R1：5'-TCTAGAGTAGTACTTGCACAAGTGTGTGAA-3'（XbaI）；

通过PCR扩增OsNPF5.11基因的cDNA后，通过kpnI、XbaI酶切后连入pCAMBIA-1306载体（pCAMBIA-1306载体购自Cambia公司），构建出OsNPF5.11基因的超表达载体OsNPF5.11-p1306。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常水稻品种中花11中。

将得到的所有转基因小苗移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待小苗长高约10cm时，种于大田中，待苗长大后，提取基因组DNA通过PCR对转基因植株进行检测，检测引物对为：

F2：5'-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3'，

R2：5'-TCGTTATGTTTATCGGCACTTT-3'。

若扩增出517bp的片段，则说明转基因植株为阳性植株。阳性植株单株收种并种植，直至T2代鉴定出纯合的转基因植株，即得到OsNPF5.11基因超表达植株。OsNPF5.11基因超表达植株的分蘖数远多于对照中花11植株，差异显著，如图1、2中所示。单株收取种子，发现超表达植株每株灌浆粒数显著多于对照中花11植株，如图3、4中所示。

取OsNPF5.11基因超表达植株叶片，提取RNA并将其反转录成cDNA，通过实时荧光定量PCR检测OsNPF5.11基因的表达量，结果显示（图5）超表达植株OsNPF5.11基因的表达量与对照中花11相比显著升高。实时荧光定量PCR所用引物对为：

F3：5'-AGGCTGAGCAGGGCATGCGTGA-3'，

R3：5'-AGCATGGACGTCACCCCGCT-3'。

实施例2 OsNPF5.11基因干扰植株的构建

提取水稻中花11的RNA，并将其反转录成cDNA，利用引物对：

F4：5'-GGTACCAGGCTGAGCAGGGCATGCGTGA-3'（KpnI），

R4：5'-GGATCCTGTAGCCGCCTTGGCCGATGGA-3'（BamH I）；

F5：5'-ACTAGTAGGCTGAGCAGGGCATGCGTGA-3'（SpeI），

R5：5'-GAGCTCTGTAGCCGCCTTGGCCGATGGA-3'（Sac I）；

各自PCR扩增出OsNPF5.11基因的cDNA片段后，通过相应的限制性内切酶酶切后连入pTCK303载体，构建出OsNPF5.11基因的干扰表达载体OsNPF5.11-pTCK303。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将干扰表达载体导入正常粳稻品种中花11中。

F2：5'-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3'，

R2：5'-TCGTTATGTTTATCGGCACTTT-3'。

若扩增出517bp的片段，则说明转基因植株为阳性植株。阳性植株单株收种并种植，直至T2代鉴定出纯合的转基因植株，即得到OsNPF5.11基因干扰植株。OsNPF5.11基因干扰植株的分蘖数远少于对照中花11植株，差异显著，如图1、2中所示。单株收取种子，发现干扰植株每株灌浆粒数明显少于对照中花11植株，如图3、4中所示。

取OsNPF5.11基因干扰植株叶片，提取RNA并将其反转录成cDNA，通过实时荧光定量PCR检测 OsNPF5.11基因的表达量，结果显示（图5）干扰植株OsNPF5.11基因的表达量与对照中花11相比显著降低。实时荧光定量PCR所用引物同实施例1。

上述结果表明，通过提高OsNPF5.11基因的表达，可以增加水稻的分蘖数和灌浆粒数，进而提高水稻产量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉生物工程学院

<120> OsNPF5.11基因在提高水稻产量中的应用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 535

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 1

Met Ser Gly Lys Lys Pro Thr Ala Ala Pro Pro Thr Ala Arg Leu Ser

1 5 10 15

Arg Ala Cys Val Met Ile Ile Val Val Ala Ser Val Glu Arg Phe Ala

20 25 30

Tyr Lys Gly Val Ala Ser Asn Leu Val Thr Tyr Leu Thr Glu Val Val

35 40 45

Glu Met Ser Thr Ser Ala Ala Ala Lys Ser Val Ser Ala Trp Ser Gly

50 55 60

Val Thr Ser Met Leu Pro Leu Leu Thr Ala Val Leu Ala Asp Ser Tyr

65 70 75 80

Trp Asp Arg Tyr Ser Thr Ile Thr Ala Ser Ser Leu Leu Tyr Val Val

85 90 95

Gly Leu Ile Gly Leu Thr Leu Trp Ala Leu Leu His Thr Arg Met Pro

100 105 110

Cys Ser Thr Leu Phe Phe Pro Leu Tyr Leu Ile Ser Ile Gly Gln Gly

115 120 125

Gly Tyr Asn Pro Ser Leu Gln Ala Phe Gly Ala Asp Gln Leu Asp Ile

130 135 140

Gly Asp Asp Asp Asp Asp Gly Asp Asn Gly Ala Thr Ala Ala Thr Glu

145 150 155 160

Glu Gln Arg Ser Lys Val Lys Ser Leu Phe Phe Gln Trp Trp Tyr Phe

165 170 175

Gly Ile Cys Ser Gly Ser Leu Leu Gly Asn Thr Thr Met Ser Tyr Val

180 185 190

Gln Asp Thr Val Gly Trp Gly Leu Gly Phe Ala Val Pro Ala Ala Val

195 200 205

Met Ala Val Ser Val Ala Ala Phe Phe Cys Cys Thr Pro Leu Tyr Lys

210 215 220

Gln Arg Gln Pro Arg Ala Val His Arg Lys Pro Cys Arg Asp Ser Val

225 230 235 240

Leu Lys Ala Leu Lys Ser Leu Leu Ala Ser Val Thr Gly Ala Arg Lys

245 250 255

Ile Thr Leu Pro Ser Arg Asp Gly Asp Asp Asp Thr Asp Ile Val Ser

260 265 270

Glu Leu Glu Leu Gln Glu Lys Pro Leu Lys Leu Ala Asp Gln Lys Gln

275 280 285

Glu Ala Ala Met Gly Glu Ala Ala Ala Pro Ser Val Ala Lys Ile Ile

290 295 300

Val Arg Leu Leu Pro Ile Trp Thr Met Leu Leu Met Phe Ala Val Ile

305 310 315 320

Phe Gln Gln Pro Met Thr Phe Phe Thr Lys Gln Gly Met Leu Met Asp

325 330 335

His Arg Val Gly Ala Val Phe Val Ile Pro Pro Ala Met Leu Gln Ser

340 345 350

Ser Ile Thr Val Ser Ile Ile Leu Leu Met Pro Leu Tyr Asp Thr Val

355 360 365

Val Val Pro Leu Ala Gly Leu Val Ala Gly His Gly Lys Gly Ile Thr

370 375 380

Val Leu Gln Arg Ile Gly Val Gly Met Val Leu Ser Ile Val Ala Met

385 390 395 400

Ala Val Ala Ala Leu Val Glu Ala Arg Arg Leu Arg Ala Ala Ala Ser

405 410 415

Ser Ser Ser Gly Gly Arg Leu Ser Ile Phe Trp Leu Leu Pro Gln Tyr

420 425 430

Val Leu Leu Gly Val Ser Asp Val Phe Thr Val Val Gly Met Gln Glu

435 440 445

Phe Phe Tyr Thr Gln Val Pro Ser Ala Met Arg Thr Val Gly Ile Ala

450 455 460

Leu Tyr Leu Ser Val Phe Gly Val Gly Ser Phe Val Gly Ala Phe Leu

465 470 475 480

Ile Thr Ala Leu Glu Met Val Thr Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly His

485 490 495

Asp His Gly Trp Phe Ser Asp Asp Pro Arg Glu Ala Arg Leu Asp Lys

500 505 510

Tyr Tyr Trp Phe Leu Ala Leu Leu Ser Cys Val Ser Phe Val Val Phe

515 520 525

Thr His Leu Cys Lys Tyr Tyr

530 535

<210> 2

<211> 1608

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 2

atgtcgggga agaagccgac ggcggcgccg ccgacggcga ggctgagcag ggcatgcgtg 60

atgatcatag tggtggcgag cgtggagagg ttcgcgtaca agggggtggc gtcgaacctg 120

gtgacgtacc tgacggaggt ggtggagatg agcacgtcgg cggcggcgaa gagcgtcagc 180

gcgtggagcg gggtgacgtc catgctgccg ctcctcaccg ccgtcctcgc cgactcctac 240

tgggaccgct actccaccat caccgcctcc tccctcctct acgtcgtcgg gctaataggc 300

ctaactttat gggcactgct acacacacgg atgccatgct ccacgctctt cttcccgctc 360

tacctcatct ccatcggcca aggcggctac aacccttcgc tgcaagcctt cggcgccgac 420

cagctcgaca tcggcgacga cgacgatgac ggcgacaatg gcgcaacagc agcaacagaa 480

gagcagagga gcaaggtgaa gagcctcttc ttccagtggt ggtacttcgg catctgcagc 540

ggcagcctgc tggggaacac gacaatgtcg tacgtccagg acaccgtcgg ctggggcctc 600

ggcttcgccg tcccggccgc cgtcatggcc gtctccgtcg ccgccttctt ctgctgcacc 660

cccctctaca agcagaggca acccagagct gttcatcgca agccctgtcg tgacagcgtc 720

ctcaaagccc tgaaatcgct tctcgcaagt gtcactggcg ccagaaagat caccctgcca 780

tccagagacg gcgacgatga cactgacatc gtatctgagc tagagttgca ggagaagcca 840

ctgaagctgg ctgatcagaa gcaggaggcg gccatgggag aggctgcagc accaagtgta 900

gccaagatca tagtgaggct gctcccaatc tggacgatgc tgctcatgtt cgcggtcatc 960

ttccagcagc cgatgacgtt cttcaccaag caggggatgc tgatggacca ccgcgtcggc 1020

gccgtgttcg tgatcccccc ggcgatgctg cagagctcca tcaccgtctc catcatcctc 1080

ctcatgccgc tctacgacac ggtggtggtg ccgctcgccg gcctcgtcgc cggccacggc 1140

aaggggatca cggtgctcca gcggatcggc gtcgggatgg tgctctccat cgtcgccatg 1200

gcggtcgccg cgctcgtcga ggcgcgccgc ctccgcgccg ccgcgtcgtc ctcgtccggc 1260

ggccgcctga gcatattctg gctcctcccg cagtacgtgc tcctcggcgt ctccgacgtg 1320

ttcacggtgg tgggcatgca ggagttcttc tacacccagg tccccagcgc catgaggacc 1380

gtcggcatcg cgctctacct cagcgtcttc ggcgtcggca gcttcgtcgg cgcgttcctc 1440

atcaccgcgc tcgagatggt gacggcgggg ggcggcggcg gcgggcacga tcacgggtgg 1500

ttctccgatg atccccggga ggcgcggctg gacaagtact actggttctt ggcgctcctc 1560

agctgcgtca gcttcgtcgt cttcacacac ttgtgcaagt actactag 1608

Claims

1.OsNPF5.11基因在提高水稻分蘖数中的应用，其特征在于：通过提高OsNPF5.11基因的表达使水稻分蘖数增加。

2.OsNPF5.11基因在提高水稻灌浆粒数中的应用，其特征在于：通过提高OsNPF5.11基因的表达使水稻灌浆粒数增加。

3. OsNPF5.11基因在提高水稻产量中的应用，其特征在于：通过提高OsNPF5.11基因的表达使水稻产量提高。

4. OsNPF5.11基因在水稻选育中的应用。

5.OsNPF5.11基因在提高植物分枝数和产量中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的植物指单子叶植物或双子叶植物。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述的植物包括小麦、番茄、草坪草或苜蓿。

8.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于：所述的OsNPF5.11基因编码的OsNPF5.11蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或OsNPF5.11蛋白为SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸获得的具有同等活性的蛋白质。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的OsNPF5.11基因的cDNA序列如SEQID NO.2所示。