CN108034672B - 硝酸根运输基因OsNRT1.9b在水稻选育中的应用 - Google Patents

硝酸根运输基因OsNRT1.9b在水稻选育中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了硝酸根运输基因OsNRT1.9b在水稻选育中的应用，属于植物基因工程领域。OsNRT1.9b基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过构建水稻OsNRT1.9b基因超表达植株、OsNRT1.9a基因的突变体植株，发现通过提高OsNRT1.9b基因表达，可以使正常的水稻分蘖数和每株穗数增加，单株灌浆粒数和单株产量增加，因此OsNRT1.9b基因可用于水稻选育中以提高水稻产量。OsNRT1.9b基因在阐述氮素影响植物生长及发育过程方面以及在水稻株型改良方面具有重要的应用价值。

Description

硝酸根运输基因OsNRT1.9b在水稻选育中的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及硝酸根运输基因OsNRT1.9b在水稻选育中的应用。
背景技术
中国水稻种植面积占世界作物总种植面积的20％，但氮肥施用量却占到世界总施用量的37％；1995年中国氮肥生产量和使用量已达世界第一位，但氮肥使用效率较低，氮肥的施用量已较50年前增长20倍，按这种趋势，预计到2050年，将会再翻3倍。氮肥施用过量会导致水体富营养化等生态污染问题[徐国华，范晓荣.水稻硝转运蛋白基因OsNRT1.1b和OsNRT1.1b的功能研究.南京农业大学，2011：4-6]。更多的氮素营养通过反硝化作用、水土流失、自然挥发、微生物利用等途径遭到浪费。
如果将氮素的吸收效率提高1％，就相当于每年节约了十多亿美元的开支。从中国国情分析，扩大种植面积提高总产量的潜力已经很有限，唯一的出路是在有限的土地上生产出更多的稻谷，即提高单位面积产量。在过去的传统耕作中，通过选择氮利用效率更高的作物，来提高氮的利用效率；但与分子水平上的育种相比，这个过程显得缓慢而低效[张洪程，戴其根.水稻氮素利用的基因型差异与生理机理研究.扬州大学，2008：10-13]。要提高氮利用率，必须从氮的分子吸收机制中寻找突破口。硝酸根运输基因家族分为低亲和力硝酸根运输基因与高亲和力硝酸根运输基因两类[周诗毅.糖类和氨基酸对水稻诱导型高亲和力硝酸盐转运系统的影响.华中科技大学，2009：15-16]。通过氮同化作用，将硝态氮和铵态氮吸收并转化为氨基酸，称为氮的第一类吸收。通过对氮的运输使种子营养物质增加，增加饱满度，称为氮的第二类吸收，也就是氮的再利用[Kbnt S,Bi Y,Steven J,etal.Understanding plant response to nitrogen limitation for the improvement ofcrop nitrogen use efficiency.Journal of Experimental,2011,62(4):1499-1509]。增加氮吸收积累量或氮转运量，都可以增产。因此，在现代化农业建设中，通过分子育种手段来提高水稻对氮肥的利用效率，可以减少氮肥污染，还能增加产量。
NRT1/PTR家族(NRT1/PTR family,NPF)是指能够介导2-3个氨基酸残基的小分子肽及硝酸根等物质进行跨膜运输的蛋白[Rentsch D,Schmidt S,Tegeder M.Transportersfor uptake and allocation of organic nitrogen compounds in plants.FEBS Let,2007,581:2281-2289]。NRT1/PTR家族成员参与了种子形成过程中蛋白质的积累和萌发中蛋白降解后小分子多肽形式转运[Martre P,Porter J R,Jamieson P D,et al.Modelinggrain nitrogen accumulation and protein composition to understand the sink/source regulations of nitrogen remobilization for wheat.Plant Physiol,2003,133:1959-1967]。目前关于NPF家族成员研究的报道很少，本发明涉及的OsNRT1.9基因是水稻NPF基因家族的一个硝酸根运输同源基因。本发明发现OsNRT1.9基因转录后加工能形成两种剪接，其中第二种剪接形式OsNRT1.9b对水稻分蘖有非常重要的作用，可应用于植物株型改良从而使水稻增产。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供水稻NPF基因家族成员硝酸根运输基因OsNRT1.9b在水稻选育中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明以水稻的NPF基因家族成员硝酸根运输基因OsNRT1.9b为对象，从水稻中花11中克隆了OsNRT1.9b的cDNA序列。通过构建OsNRT1.9b基因超表达载体，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常粳稻品种中花11中，得到OsNRT1.9b基因超表达植株，其分蘖数、有效穗数、灌浆籽粒数和产量与对照野生型中花11相比显著提高。通过CRISPR技术构建OsNRT1.9b基因敲除载体，将敲除载体导入中花11中，得到OsNRT1.9b基因的突变体植株，突变体植株的分蘖数、有效穗数、灌浆籽粒数和产量与中花11相比显著降低。这些结果表明，通过提高OsNRT1.9b基因的表达，可以使正常的水稻分蘖数增加，从而提高穗数、灌浆粒数和水稻产量。
基于本发明发现的OsNRT1.9b基因的功能，OsNRT1.9b基因可用于水稻选育中。所述的水稻选育为提高水稻分蘖数，从而提高穗数、灌浆粒数和水稻产量。具体可通过提高OsNRT1.9b基因的表达使水稻分蘖数和每株穗数、灌浆粒数增加，达到提高水稻产量的目的。
OsNRT1.9b基因也可用于提高其他植物的产量，如通过转基因使OsNRT1.9b基因在植物中(超量)表达，来提高植物的分枝数量，进而使植物的产量得到提高。所述的植物是指单子叶植物或双子叶植物；如：小麦、番茄、草坪草或苜蓿等。
所述的OsNRT1.9b基因编码的OsNRT1.9b蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的OsNRT1.9b基因的cDNA序列优选如SEQ ID NO.2所示。
应该理解为，在不影响OsNRT1.9b蛋白活性的前提下(即不在蛋白的活性中心)，本领域技术人员可对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。因此，OsNRT1.9b蛋白还包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸获得的具有同等活性的蛋白质。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
本发明的优点和效果：
(1)本发明克隆的OsNRT1.9b基因超表达后使水稻分蘖能力增强，说明OsNRT1.9b基因对提高水稻产量较明显，因此，通过基因工程技术提高OsNRT1.9b基因的表达能够提高植物产量。这不仅有助于通过正常施氮条件下培育高产水稻，还可以通过分子育种进行植物的品种改良。
(2)OsNRT1.9b基因的成功克隆，进一步证实了NPF家族在氮吸收过程中的重要作用，对阐明NPF家族的生物学功能有重要的意义，另外对进一步了解植物氮代谢途径，提高氮吸收效率有极大的推动作用。
(3)尽管目前已克隆到了一些提高植物产量的基因，但对植物增产的分子机制仍不清楚。而本发明克隆的OsNRT1.9b基因能够提高水稻的产量，对确定植物增产的关键因素有极大的推动作用。
附图说明
图1是对照中花11、OsNRT1.9b基因超表达植株3个株系、OsNRT1.9b基因突变体植株的整株表型图。
图2是对照中花11、OsNRT1.9b基因超表达植株3个株系、OsNRT1.9b基因突变体植株分蘖数的统计柱状图，数据采用SPSS软件进行变量分析(ANOVA)，使用Duncan’s在0.05、0.01和0.001三个水平上进行差异显著性分析，与对照相比分别用*、**和***表示。
图3是对照中花11、OsNRT1.9b基因超表达植株3个株系的OsNRT1.9b基因表达量检测结果图，数据采用SPSS软件进行变量分析(ANOVA)，使用Duncan’s在0.05、0.01和0.001三个水平上进行差异显著性分析，与对照相比分别用*、**和***表示。
图4是对照中花11、OsNRT1.9b基因超表达植株3个株系、OsNRT1.9b基因突变体植株单株灌浆籽粒表型图。
图5是对照中花11、OsNRT1.9b基因超表达植株3个株系、OsNRT1.9b基因突变体植株单株灌浆籽粒数量统计图，数据采用SPSS软件进行变量分析(ANOVA)，使用Duncan’s在0.05、0.01和0.001三个水平上进行差异显著性分析，与对照相比分别用*、**和***表示。
图6是对照中花11、OsNRT1.9b基因超表达植株3个株系、OsNRT1.9b基因突变体植株单株产量统计图，数据采用SPSS软件进行变量分析(ANOVA)，使用Duncan’s在0.05、0.01和0.001三个水平上进行差异显著性分析，与对照相比分别用*、**和***表示。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术(参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
实施例1OsNRT1.9b基因超表达植株的构建
提取水稻中花11的RNA，并将其反转录成cDNA，利用引物对：
F1：5'-AGATCTATGCAGGATGTAGGTTCAGAATAC-3'(Bgl II)，
R1：5'-CTTAAGTCACTGCGACAGCGCCAAGCACGA-3'(Afl II)；
通过PCR扩增OsNRT1.9b基因的cDNA后，通过Bgl II、Afl II酶切后连入pCAMBIA-1301载体(pCAMBIA-1301载体购自Cambia公司)，构建出OsNRT1.9b基因的超表达载体OsNRT1.9b-p1301。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常水稻品种中花11中。
将得到的所有转基因小苗移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待小苗长高约10cm时，种于大田中，待苗长大后，提取基因组DNA通过PCR对转基因植株进行检测，检测引物对为：
F2：5'-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3'，
R2：5'-TCGTTATGTTTATCGGCACTTT-3'。
若扩增出517bp的片段，则说明转基因植株为阳性植株。阳性植株单株收种并种植，直至T2代鉴定出纯合的转基因植株，即得到OsNRT1.9b基因超表达植株。OsNRT1.9b基因超表达植株的分蘖数远多于对照中花11植株，差异显著，如图1、2中所示。检测超表达植株OsNRT1.9b基因的表达量，显示OsNRT1.9b基因的表达与对照相比得到提高，如图3所示。单株收取种子统计，结果表明超表达植株每株灌浆籽粒增加，且每株产量增加，如图4、5、6所示。
实施例2OsNRT1.9b基因突变体植株的获得
F3：ACACTTATTGGGGCAGATACTGG，
F4：ATCGTTCCGTAGTGTATCTAGGG。
利用上述两个靶标序列，构建出OsNRT1.9b基因的基因敲除载体OsNRT1.9b-C(方法参考Ma X et al，A robust CRISPR/Cas9system for convenient,high-efficiencymultiplex genome editing in monocot and dicot plants.Mol Plant.2015,8(8):1274-1284)。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将基因敲除表达载体导入正常粳稻品种中花11中。突变体植株在T0代时进行测序，确定基因已经敲除，继续繁种到T1代，即得到OsNRT1.9b基因的突变体植株。OsNRT1.9b基因突变体植株的分蘖数远少于对照中花11植株，差异显著，如图1、2中所示。单株收取种子统计，结果表明突变体植株每株灌浆籽粒减少，且每株产量减少，如图4、5、6所示。
上述结果表明，通过提高OsNRT1.9b基因的表达，可以增加水稻的分蘖数，进而提高穗数、灌浆籽粒数和水稻产量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉生物工程学院
<120> 硝酸根运输基因OsNRT1.9b在水稻选育中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 491
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 1
Met Gln Asp Val Gly Ser Glu Tyr Thr Arg Asp Gly Ser Val Asp Ile
1 5 10 15
Asn Lys Glu Pro Ala Leu Lys His Ser Thr Gly Asn Trp Arg Ala Cys
20 25 30
Phe Leu Ile Leu Gly Val Glu Phe Cys Glu Asn Met Thr Tyr Phe Val
35 40 45
Ile Ser Arg Asn Leu Val Thr Phe Leu Thr Thr Val Leu His Glu Ser
50 55 60
Lys Val Asp Ala Ala Arg Asn Val Ser Ala Trp Val Gly Ala Cys Phe
65 70 75 80
Leu Thr Pro Val Val Gly Ala Phe Leu Ala Asp Thr Tyr Trp Gly Arg
85 90 95
Tyr Trp Thr Ile Val Val Phe Leu Pro Val Tyr Ile Thr Gly Met Leu
100 105 110
Ile Val Thr Val Ser Ala Ser Leu Pro Met Phe Leu Thr Ser Ser Glu
115 120 125
His Gly Asn Val His Arg Ser Val Val Tyr Leu Gly Leu Tyr Leu Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Ser Gly Ala Met Lys Pro Cys Thr Ser Ser Phe Gly Ala
145 150 155 160
Asp Gln Phe Asp Ser Thr Asp Leu Glu Glu Leu Pro Lys Lys Ala Ser
165 170 175
Phe Phe Ser Trp Ser Phe Tyr Met Thr Thr Val Ser Thr Leu Leu Ser
180 185 190
Ser Thr Val Leu Val Trp Leu Gln Asp Asn Val Gly Trp Gly Val Gly
195 200 205
Cys Ala Ile Pro Thr Val Phe Met Ile Ile Ser Phe Pro Val Phe Ile
210 215 220
Ala Gly Ser Arg Val Tyr Arg Phe Arg Asn Leu Gly Phe Ser Pro Leu
225 230 235 240
Lys Ser Leu Cys Gln Val Ile Val Ala Ala Val Arg Lys Cys His Leu
245 250 255
Gln Leu Pro Glu Asn Lys Ser Leu Leu Tyr Glu Pro Ser Asn Ser Ser
260 265 270
Ser Thr Thr Glu Ala Ser His Lys Ile Gln Pro Thr Asn Gln Phe Arg
275 280 285
Phe Leu Asp Lys Ala Ala Ile Val Leu Pro Pro Ser Asp Glu Thr Cys
290 295 300
Ile Lys Pro Met Ser Ser Trp Ser Leu Cys Thr Val Thr Gln Val Glu
305 310 315 320
Glu Leu Lys Met Leu Leu Arg Met Phe Pro Thr Trp Ala Ser Phe Val
325 330 335
Ile Phe Phe Ala Val Asn Gly Gln Met Ser Ser Thr Phe Ile Glu Gln
340 345 350
Gly Met Ala Met Asp Asn His Val Gly Ser Phe Ala Ile Pro Pro Ala
355 360 365
Ser Leu Thr Ile Ile Ala Val Leu Ser Val Leu Val Leu Val Pro Val
370 375 380
Tyr Glu Ile Ile Ser Val Pro Leu Val Lys His Phe Thr Gly Gln Asp
385 390 395 400
Lys Gly Phe Ser His Ala Gln Arg Ile Gly Ile Gly Leu Ser Leu Ser
405 410 415
Met Ile Met Met Val Tyr Ala Ala Leu Leu Glu Met Lys Arg Leu Ala
420 425 430
Ile Val Gln Ser Ser Gly Leu Ala Asp His Asn Val Ala Ala Pro Met
435 440 445
Ser Ile Leu Trp Gln Thr Pro Ala Tyr Phe Leu Gln Gly Val Ser Glu
450 455 460
Ile Phe Ser Cys Ile Gly Met Ser His Ser Gln Ser Leu Gln Glu Leu
465 470 475 480
Thr Ser Thr Arg Ser Cys Leu Ala Leu Ser Gln
485 490
<210> 2
<211> 1476
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 2
atgcaggatg taggttcaga atacacaagg gatggttcag ttgacatcaa caaggagcca 60
gccctgaagc acagcacagg gaactggagg gcgtgcttct tgattttagg tgttgaattt 120
tgtgaaaaca tgacctactt tgtaatctcg aggaatctag tcacattcct caccactgtg 180
ctccacgaaa gcaaggtcga tgctgccaga aatgtctctg cctgggttgg agcttgcttc 240
ctcacaccgg ttgttggtgc ctttctggca gacacttatt ggggcagata ctggacaatt 300
gttgttttcc tcccggtgta catcactgga atgctcatcg tgacagtttc agcatcactt 360
ccaatgttct tgacatcttc tgaacatggc aatgttcatc gttccgtagt gtatctaggg 420
ctctatcttg ctgcccttgg gagtggtgca atgaaaccat gcacttcatc ctttggggcc 480
gaccagtttg atagcactga tctggaggag ttaccgaaga aggcctcctt cttcagttgg 540
tccttctaca tgactactgt cagcaccttg ctgtcaagca cagtgcttgt ttggttgcaa 600
gacaatgttg gatggggggt gggttgcgca atcccgactg tgttcatgat catcagtttc 660
cctgtattca ttgccggctc aagagtttac aggtttagga acctgggatt tagccccctc 720
aagagcctct gtcaggtgat tgttgcagct gttaggaagt gccatctgca attgccagaa 780
aataagtcac ttttatatga gccatccaat tcatcttcaa caactgaagc aagtcataaa 840
attcagccca ccaatcaatt caggttcctt gacaaggcag ccattgtact gcccccatca 900
gacgaaacgt gcatcaagcc catgagctca tggtcgctct gcacagtgac acaagttgag 960
gagctgaaga tgctgctgcg gatgttcccc acctgggcat ctttcgtgat ctttttcgcg 1020
gtcaatgggc agatgtcctc aacgttcatt gagcagggaa tggccatgga caaccatgtt 1080
ggttcatttg caatcccacc tgcatccctc accatcatcg ccgtgctcag cgtccttgtc 1140
ttggttcctg tgtatgagat catatcagtg ccactggtga agcatttcac cggacaggac 1200
aaaggcttct cacatgcgca gcgcatcgga atcggccttt cactgtccat gatcatgatg 1260
gtgtacgcag cattgctcga gatgaagcgg ctggcaatcg tgcaatcaag tggcttagca 1320
gaccacaatg tagctgctcc aatgagtatc ctgtggcaga caccagcata ctttctgcaa 1380
ggggtttcag agattttcag ctgcatcggt atgtcacact cgcaatcgct tcaggagctt 1440
acttcaacac gttcgtgctt ggcgctgtcg cagtga 1476

Claims (4)

1.OsNRT1.9b 基因在水稻选育中的应用，其特征在于：所述的水稻选育为提高水稻分蘖数；所述的OsNRT1.9b 基因编码的OsNRT1.9b 蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示；通过提高OsNRT1.9b 基因的表达实现所述应用。
2.OsNRT1.9b 基因在提高水稻穗数中的应用，其特征在于：所述的OsNRT1.9b 基因编码的OsNRT1.9b 蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示；通过提高OsNRT1.9b 基因的表达实现所述应用。
3.OsNRT1.9b 基因在提高水稻灌浆粒数中的应用，其特征在于：所述的OsNRT1.9b 基因编码的OsNRT1.9b 蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示；通过提高OsNRT1.9b 基因的表达实现所述应用。
4.根据权利要求1-3 任一项所述的应用，其特征在于：所述的OsNRT1.9b 基因的cDNA序列如SEQ ID NO.2 所示。
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