CN111018958B - 突变型atpA基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种突变型atpA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。突变型atpA基因具有提高植物抗非生物胁迫的功能，其可用于生产高抗性的植物，还应用于鉴定或辅助鉴定高抗性植物。

Description

突变型atpA基因及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种突变型atpA基因及其应用。
背景技术
植物需要应对持续变化的环境，包括经常性的不利于植物生长和发育的胁迫环境。这些不良环境包括生物胁迫(如病原体感染和食草动物的啃食)和非生物胁迫(例如干旱、高温、冷害、营养匮乏、盐害以及土壤中铝、砷、镉等有毒金属毒害)。干旱、盐害以及温度胁迫是影响植物的地理分布、限制农作物产量，并威胁粮食安全的主要环境因子。极端天气越来越频繁的出现，将加剧非生物胁迫对农业生产的不利影响。因此，提高作物非生物胁迫抗性，已经成为农业发展的当务之急。
发明内容
本申请发明人从番茄纯和材料09888-6中克隆得到atpA基因，经对比发现，本发明克隆到的atpA基因与Genbank上公布的atpA基因(序列号为：AC_000188)相比，第674位碱基由T变为C，其编码第225位氨基酸的碱基从GTA(Val V亮氨酸)变为GCA(Ala A丙氨酸)。经研究证实，本发明克隆到的atpA基因具有较强的抗非生物胁迫(例如高盐、干旱)的功能，这在以前是没有报道过的，为植物抗高盐和干旱研究提供新的思路。
本发明所采取的技术方案是：
一种蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种核酸分子，其编码上述的蛋白质。
作为优选的，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，也即突变型atpA基因。
含有上述核酸分子的重组载体、重组菌或转基因细胞系。
以上所述的蛋白质、核酸分子、重组载体、重组菌或转基因细胞系在提高植物非生物胁迫抗性中的应用。
作为优选的，所述非生物胁迫包括高盐或干旱。
一种高抗性植物的生产方法，包括将以上所述的核酸分子导入受体植物中，从而得到高抗性植物，所述抗性是指非生物胁迫抗性，包括高盐或干旱。
进一步优选地，所述受体植物优选为茄科植物。
用于检测上述蛋白质或核酸分子的试剂在高抗性植物辅助育种中的应用，所述抗性是指非生物胁迫抗性，包括高盐或干旱。
所述试剂可以是蛋白质提纯及测序试剂、基因克隆及测序试剂或者是其他可用于蛋白质、核酸定性检测的试剂。
一种高抗性植物辅助育种试剂盒，其包括用于检测上述蛋白质的抗体，或者是用于检测上述核酸分子的PCR引物，或者是其他可用于蛋白质、核酸定性检测的试剂。所述抗性是指非生物胁迫抗性，包括高盐或干旱。
本发明的有益效果是：
本发明克隆到的atpA基因具有提高植物抗非生物胁迫的功能，可以为植物抗高盐和干旱研究提供新的思路。
附图说明
图1为atpA基因全长cDNA核苷酸序列和推理的氨基酸序列。
图2为转基因烟草Kan抗性筛查及驯化移栽，其中：a)侵染后外植体；b)愈伤分化；c)抗性芽分化；d)抗性芽生长；e)转基因烟草生根；f)转基因烟草。
图3为转atpA基因烟草DNA水平PCR鉴定，PCR模板分别为：Water：水，P：质粒，N-t：非转基因烟草DNA，1-23：各转基因株系DNA。
图4为转atpA基因烟草RNA水平qRT-PCR鉴定。
图5为转基因与对照(WT)株系在不同浓度NaCl胁迫下种子萌发率比较，其中，WT：野生型；OE17、21、30：转基因株系。
图6为转基因与对照(WT)株系在不同浓度NaCl胁迫下籽苗生长状态比较。
图7为转基因与WT株系幼苗抗不同浓度NaCl胁迫能力鉴定。
图8为叶绿素荧光成像观察盆栽植株抗盐能力。
图9为叶绿素荧光成像观察盆栽植株耐干旱能力。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
本发明所用到的番茄纯和材料09888-6由东北农业大学园艺园林学院番茄研究所赠与。
实施例1 atpA基因的克隆
以番茄叶绿体基因组的atpA基因为模板设计特异性引物，序列如下所示：
F：5’-ATGGTAACCATTCGAGCTGACG-3’(SEQ ID NO.3)；
R：5’-TTATGCTTGTTCCTGAAGTATAAAACG-3’(SEQ ID NO.4)
番茄纯和材料09888-6为模板，利用特异性引物，采用RT-PCR技术，从番茄总RNA中扩增得到本研究atpA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所编码的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
经对比发现，本发明克隆到的atpA基因与Genbank上公布的番茄atpA基因(序列号为：AC_000188相比，第674位碱基由T变为C，其编码第225位氨基酸的碱基从GTA(Val V亮氨酸)变为GCA(Ala A丙氨酸)，具体见图1。
实施例2 atpA基因的功能认证
1、转基因烟草株系的制备
将切好的烟草叶盘放入制备好的具有较高侵染能力的脓杆菌菌液(含有atpA基因过量表达质粒)中，20min震荡侵染完成后，将叶盘背面向上平铺在培养基上，共培养48h后转移到含有SM及Kan抗性的愈伤和芽诱导培养基上，两周后叶盘的切口边缘长出抗性愈伤组织或芽，以后10天更换一次芽诱导培养基，芽长到5cm时，切除大块愈伤，将芽转移至生根培养基中进行生根培养。待植株根系生长繁茂，可移栽到土中驯化，洗掉植株根部的琼脂，移栽至湿润无菌土壤，喷水保湿。转化过程如图2所示。
在DNA水平上，利用PCR技术筛选转基因烟草阳性植株，采用改良的SDS法提取各个株系叶片总DNA，根据质粒上35s序列设计引物，共801bp，选取经PCR鉴定转基因烟草呈阳性的植株，如图3所示。
Trizol法提取获得所有在DNA水平上检测呈阳性的转基因烟草植株的RNA，测定每个样品RNA浓度，经过反转录获得相应cDNA模板，qRT-PCR检测各个植株atpA基因表达量，如图4所示。
2、转基因烟草抗高盐胁迫能力增强
(1)转基因株系在盐胁迫下萌发早，萌发率高
WT、OE17、OE21、OE30四个株系分别种植于1/2MS培养基、含有150mM NaCl的1/2MS培养基、含有250mM NaCl的1/2MS培养基上(种子种植方法同2.4.2.2)，9天之后，拍照记录四个株系种子萌发情况，并调查15天内四个株系种子的发芽势(每个培养皿内种植20个种子、每个株系在每个NaCl浓度梯度上各种植三个培养皿，三次生物学重复)。转基因株系(OE17、OE21、OE30)与野生株系(WT)种子在含不同NaCl浓度培养基中萌发率分析表明，转基因株系在盐胁迫下萌发早，萌发率高(图5)。
表1不同浓度NaCl处理下，15天内，各烟草种子萌发率
Figure BDA0002310317320000041
(2)转基因烟草籽苗抗高盐胁迫能力增强。
种植于1/2MS培养基中的WT、OE17、OE21、OE30四个株系种子，生长7天之后转移至含有0，150，250mM NaCl的1/2MS培养基中继续生长7天之，发现转基因株系与WT籽苗之间生长状态差异显著，由图6可以明显看出，在不含NaCl的1/2MS培养基中四个株系籽苗长势基本一致；在含有150mM NaCl的1/2MS培养基中，与转基因籽苗相比，WT籽苗的根长和子叶的生长均遭到抑制，具体表现为根长较短，子叶较小且有变黄现象；在含有250mM NaCl的1/2MS培养基中，高浓度NaCl对四个株系籽苗都存在不同程度的抑制作用，但是WT籽苗受NaCl胁迫伤害的程度要远远高于对照，表现为植株较矮小且子叶变黄。并且在盐胁迫后，转基因植株的根长和鲜重显著高于野生型，尤其是250mM NaCl处理。
(3)水培转基因烟草幼苗抗高盐胁迫能力增强。
四个株系种子种植于1/2MS培养基中的，生长三周后移入1/2Hoagland培养液中培养，待幼苗长至四片真叶期转移至分别含有0，150，250mM NaCl的1/2Hoagland培养液中，随时观察幼苗表形变化，结果表明，在盐胁迫36h时，在含150mM NaCl的培养液中，WT与转基因株系生长状态存在差异，主要表现为WT株系出现变黄现象，苗体略微倾斜；含有250mM NaCl的培养液中转基因株系与WT相比生长状态差距较大，与转基因株系相比，WT株系枯黄萎蔫严重，产生严重倒伏现象(图7)。
用250mM NaCl浇灌生长50天盆栽烟草，持续5天后，检测各个株系抗盐能力及高盐胁迫对各个株系光合作用的影响。荧光成像技术分析盐胁迫后叶绿素荧光强弱，结果表明，随着收到NaCl胁迫的发生，转基因株系与WT相比表现出更强的荧光(图8)，并且WT株系部分严重萎蔫叶片在YII荧光下，没有成像显示。由此可见，转基因烟草高盐胁迫下萎蔫程度减轻，并且具有较高的光合作用活性。
3、转基因烟草抗干旱胁迫能力增强
转基因烟草干旱胁迫下萎蔫程度减轻，并且具有较高的光合作用活性。
长50天盆栽烟草，停止浇水6天后，检测各个株系抗干旱能力及干旱胁迫对各个株系光合作用的影响。结果表明，在干旱胁迫6天以后，WT盆栽植株出现大面积叶片黄化倒伏现象，相比之下，转基因植株黄化现象相对较少且倒伏较轻。荧光成像技术分析干旱胁迫后叶绿素荧光强弱，结果表明，随着干旱胁迫的发生，转基因株系与WT相比表现出更强的荧光(图9)，并且WT株系部分严重萎蔫叶片在YII荧光下，没有成像显示。
以上实验结果表明，本发明克隆到的atpA基因具有提高植物抗非生物胁迫的功能，可以为植物抗高盐和干旱研究提供新的思路。
以上实施例仅用于对本发明技术方案进行说明，但并不局限于此。本领域技术人员可以理解，除了可将atpA基因导入烟草中，提高烟草的非生物胁迫抗性外，还可以将其导入其他受体植物尤其是茄科植物中，以提高受体植物的非生物胁迫抗性。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所
<120> 突变型atpA基因及其应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1524
<212> DNA
<213> atpA
<400> 1
atggtaacca ttcgagctga cgaaattagt aatattatcc gtgaacgtat tgaacaatat 60
aatagagaag taaagattgt aaatacaggt accgtacttc aagtaggcga tggcattgct 120
cgtattcacg gtcttgatga agtaatggcg ggtgaattag tagaatttga agagggtaca 180
ataggcattg ctctgaattt ggaatcaaat aatgttggtg ttgtattaat gggcgacggt 240
ttgttgatac aagaaggaag ttctgtaaaa gcaacgggaa gaattgctca gatacccgtg 300
agtgaggctt atttgggtcg tgttgtaaat gccctggcta aacctattga tggtagaggt 360
gaaatttcag cttctgaatt tcgattaatt gaatctgccg cccccggtat tatttcgcgc 420
cgttccgtat atgagcctct tcaaaccgga cttattgcta ttgattcgat gatccctata 480
ggacgtggtc aacgagaatt aattattggg gacagacaga ccggtaaaac agcagtagcc 540
acagatacga ttctcaatca acaaggtcaa aatgtaatat gtgtttatgt agctattggg 600
caaaaagcgt cttctgtggc ccaggtagta actactttac aggaaagggg agcgatggaa 660
tacactattg tggcagccga aacggcggat tcccctgcta cattacaata ccttgctcct 720
tatacaggag cagctctggc tgaatatttt atgtatcgtg aacgacacac tttaatcatt 780
tatgatgatc tctccaaaca agcgcaagct tatcgccaaa tgtctcttct attacgaaga 840
ccgcccggtc gtgaagctta tccaggagat gttttttatt tgcattcacg ccttttggaa 900
agagccgcta aattaagttc gagtttaggt gaaggaagta tgactgcctt accaatagtt 960
gaaactcaat ccggagatgt ttcggcttat attcctacta atgtaatttc cattactgat 1020
ggacaaatct tcttatccgc cgacctattc aattctggaa tcagacctgc tattaatgtg 1080
ggtatctccg tttccagagt ggggtccgca gctcaaataa aagccatgaa acaggtagct 1140
ggtaaattaa aattagaact agcgcaattc gcagaattag aagcctttgc acaatttgct 1200
tctgatctcg ataaagctac tcagaatcaa ttggcaagag gtcaacgatt acgtgaattg 1260
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ggaacaaacg gctatcttga ttcattagaa gttggacagg taaggaaatt tcttgttgag 1380
ctacgtactt acttaaaaac tactaaacct cagttccaag aaatcatatc ttctaccaag 1440
acatttaccg aggaagcaga agcccttttg aaggaagcta ttcaggaaca aatggatcgt 1500
tttatacttc aggaacaagc ataa 1524
<210> 2
<211> 507
<212> PRT
<213> atpA
<400> 2
Met Val Thr Ile Arg Ala Asp Glu Ile Ser Asn Ile Ile Arg Glu Arg
1 5 10 15
Ile Glu Gln Tyr Asn Arg Glu Val Lys Ile Val Asn Thr Gly Thr Val
20 25 30
Leu Gln Val Gly Asp Gly Ile Ala Arg Ile His Gly Leu Asp Glu Val
35 40 45
Met Ala Gly Glu Leu Val Glu Phe Glu Glu Gly Thr Ile Gly Ile Ala
50 55 60
Leu Asn Leu Glu Ser Asn Asn Val Gly Val Val Leu Met Gly Asp Gly
65 70 75 80
Leu Leu Ile Gln Glu Gly Ser Ser Val Lys Ala Thr Gly Arg Ile Ala
85 90 95
Gln Ile Pro Val Ser Glu Ala Tyr Leu Gly Arg Val Val Asn Ala Leu
100 105 110
Ala Lys Pro Ile Asp Gly Arg Gly Glu Ile Ser Ala Ser Glu Phe Arg
115 120 125
Leu Ile Glu Ser Ala Ala Pro Gly Ile Ile Ser Arg Arg Ser Val Tyr
130 135 140
Glu Pro Leu Gln Thr Gly Leu Ile Ala Ile Asp Ser Met Ile Pro Ile
145 150 155 160
Gly Arg Gly Gln Arg Glu Leu Ile Ile Gly Asp Arg Gln Thr Gly Lys
165 170 175
Thr Ala Val Ala Thr Asp Thr Ile Leu Asn Gln Gln Gly Gln Asn Val
180 185 190
Ile Cys Val Tyr Val Ala Ile Gly Gln Lys Ala Ser Ser Val Ala Gln
195 200 205
Val Val Thr Thr Leu Gln Glu Arg Gly Ala Met Glu Tyr Thr Ile Val
210 215 220
Ala Ala Glu Thr Ala Asp Ser Pro Ala Thr Leu Gln Tyr Leu Ala Pro
225 230 235 240
Tyr Thr Gly Ala Ala Leu Ala Glu Tyr Phe Met Tyr Arg Glu Arg His
245 250 255
Thr Leu Ile Ile Tyr Asp Asp Leu Ser Lys Gln Ala Gln Ala Tyr Arg
260 265 270
Gln Met Ser Leu Leu Leu Arg Arg Pro Pro Gly Arg Glu Ala Tyr Pro
275 280 285
Gly Asp Val Phe Tyr Leu His Ser Arg Leu Leu Glu Arg Ala Ala Lys
290 295 300
Leu Ser Ser Ser Leu Gly Glu Gly Ser Met Thr Ala Leu Pro Ile Val
305 310 315 320
Glu Thr Gln Ser Gly Asp Val Ser Ala Tyr Ile Pro Thr Asn Val Ile
325 330 335
Ser Ile Thr Asp Gly Gln Ile Phe Leu Ser Ala Asp Leu Phe Asn Ser
340 345 350
Gly Ile Arg Pro Ala Ile Asn Val Gly Ile Ser Val Ser Arg Val Gly
355 360 365
Ser Ala Ala Gln Ile Lys Ala Met Lys Gln Val Ala Gly Lys Leu Lys
370 375 380
Leu Glu Leu Ala Gln Phe Ala Glu Leu Glu Ala Phe Ala Gln Phe Ala
385 390 395 400
Ser Asp Leu Asp Lys Ala Thr Gln Asn Gln Leu Ala Arg Gly Gln Arg
405 410 415
Leu Arg Glu Leu Leu Lys Gln Ser Gln Ser Ala Pro Leu Thr Val Glu
420 425 430
Glu Gln Ile Met Thr Ile Tyr Thr Gly Thr Asn Gly Tyr Leu Asp Ser
435 440 445
Leu Glu Val Gly Gln Val Arg Lys Phe Leu Val Glu Leu Arg Thr Tyr
450 455 460
Leu Lys Thr Thr Lys Pro Gln Phe Gln Glu Ile Ile Ser Ser Thr Lys
465 470 475 480
Thr Phe Thr Glu Glu Ala Glu Ala Leu Leu Lys Glu Ala Ile Gln Glu
485 490 495
Gln Met Asp Arg Phe Ile Leu Gln Glu Gln Ala
500 505
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atggtaacca ttcgagctga cg 22
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttatgcttgt tcctgaagta taaaacg 27

Claims (5)

1.一种蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种核酸分子，其编码权利要求1所述的蛋白质。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.权利要求1所述的蛋白质、权利要求2或3所述的核酸分子在提高植物非生物胁迫抗性中的应用，所述非生物胁迫为高盐或干旱，所述植物为烟草。
5.一种高抗性植物的生产方法，包括将权利要求2或3所述的核酸分子导入受体植物中，从而得到高抗性植物，所述抗性是指高盐或干旱抗性，所述受体植物为烟草。
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