CN109097367B - 一种橡胶树HbWRKY82基因及其应用 - Google Patents
一种橡胶树HbWRKY82基因及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种橡胶树HbWRKY82基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供了该HbWRKY82基因编码的蛋白质及该基因的应用。本发明首次从橡胶树中克隆得到HbWRKY82基因，该基因具有转录因子功能，定位于细胞核中，该基因的表达受乙烯利诱导，且在叶片衰老过程中和死皮橡胶树中下调表达,具有反向调控功能。过量表达后能提高转基因植株对高盐和干旱等胁迫环境的耐受力,同时还具有调控叶片衰老的功能，在橡胶树的生长发育及响应生物与非生物逆境胁迫反应中起着重要的调控作用。将来利用HbWRKY82基因对植物进行遗传改良，可为提高植物耐盐性和耐旱性等抗逆性，以及延迟叶片衰老提供有效的基因资源。
Description
技术领域
本发明生物技术领域，涉及一种橡胶树HbWRKY82基因及其应用。
背景技术
天然橡胶作为不可替代的工业原料和重要战略资源，有很强的弹性、绝缘性好、可塑性强、隔水隔气的气密性以及耐磨性等特性，而被广泛运用于国防军工、医药卫生和交通等重要领域。目前，天然橡胶的主要来源为巴西橡胶树，其主要在非洲、中美洲和亚洲等热带地区种植。我国作为橡胶树的非传统植胶区，在天然橡胶的生产上受到风害、干旱以及低温寒暑等逆境胁迫的严重影响，从而对橡胶树品种的抗逆性有了更高的要求，而培育高产多抗的橡胶树新品种也是我国天然橡胶生产中的主要研究课题之一。
WRKY转录因子家族广泛参与植物各种生物和非生物胁迫等的响应过程，是植物特有的一类转录调控因子家族。目前，对于WRKY转录因子功能的研究，大多集中在拟南芥、水稻等模式植物或一些经济草本作物中，在橡胶树中的报道相对较少。
发明内容
本发明从橡胶树叶片转录组测序的基础上，从叶片cDNA中克隆得到了一个WRKY转录因子，并命名为HbWRKY82，经过序列比对，该基因与Li等(2014)预测的81个橡胶树WRKY转录因子家族基因没有显著关系，随后对其转录活性和亚细胞定位进行了验证，并对其在不同组织和不同发育期叶片，乙烯利刺激和死皮树中的表达特性进行了分析，并通过构建HbWRKY82过表达载体获得转基因拟南芥植株，对其生物学功能进行验证。显示HbWRKY82的过表达可提高转基因植株的耐盐性、耐旱性以及调控叶片衰老等特性。
本发明的第一个方面是提供一种橡胶树HbWRKY82基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
本发明的第二个方面是提供一种蛋白质，其为本发明第一个方面所述的橡胶树HbWRKY82基因编码的蛋白质，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明的第三个方面是提供一种本发明第一个方面所述的橡胶树HbWRKY82基因的克隆方法，包括以下步骤：(1)从橡胶树的根、芽、树皮、木质部、叶片、胶乳和/或叶片(可为任意发育期的叶片，例如古铜期、变色期、淡绿期、稳定期、衰老期等)中提取总RNA；(2)以总RNA为模板进行反转录获得cDNA；(3)设计HbWRKY82基因全长序列扩增引物对，进行PCR扩增，回收PCR产物，其中，HbWRKY82基因全长序列扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；(4)PCR产物连接载体，转化，测序，获得HbWRKY82基因全序列。
本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的橡胶树HbWRKY82基因在亚细胞内定位和/或转录激活活性分析中的应用。
本发明的第五个方面是提供如本发明第一个方面所述的橡胶树HbWRKY82基因在提高植物抗逆性中的应用。
本发明的第六个方面是提供如本发明第一个方面所述的橡胶树HbWRKY82基因在提高植物耐盐性和/或耐旱性中的应用。
本发明的第七个方面是提供如本发明第一个方面所述的橡胶树HbWRKY82基因在调控植物叶片衰老中的应用。
本发明的第八个方面是提供如本发明第一个方面所述的橡胶树HbWRKY82基因在培育抗逆性以及抗叶片衰转基因橡胶树中的应用。
本发明的第九个方面是提供一种表达载体，其含有本发明第一个方面所述的橡胶树HbWRKY82基因。
本发明的第十个方面是提供一种引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示。该引物对可用于HbWRKY82基因全长序列扩增。
本发明的第十一个方面是提供一种引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQID NO:6所示。
本发明的第十二个方面是提供一种引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQID NO:8所示
本发明的第十三个方面是提供一种引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:9和SEQID NO:10。
本发明首次从橡胶树中克隆得到HbWRKY82基因，该基因属于WRKY家族，调控植物生长发育及响应生物与非生物逆境胁迫反应。通过亚细胞定位分析表明该基因定位于细胞核，并具有转录激活活性，符合转录因子的特征。该基因的表达受乙烯利诱导，且在叶片衰老过程和死皮橡胶树中下调表达,具有反向调控功能。进一步将该基因转化到拟南芥中，获得转基因植株，发现能提高植株对高盐和干旱等胁迫环境的耐受力,同时还具有调控叶片衰老的功能，获得的转基因植株具有较强的抗逆性，表现出植株长势好、花期提前以及生长周期延长等特点，表明该基因在橡胶树的生长发育及响应生物与非生物逆境胁迫反应中起着重要的调控作用。将来利用HbWRKY82基因对植物进行遗传改良，可为提高植物耐盐性、耐旱性以及延迟叶片衰老提供有效的基因资源。
附图说明
图1为橡胶树HbWRKY82基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列。
图2为橡胶树HbWRKY82与其他植物WRKY转录因子系统进化树分析图。
图3为HbWRKY82与其他植物WRKY蛋白的多重序列比对图，划线部分表示WRKY结构域；WRKYGQK基序和NLS在序列上端标出；↓表示C2H2锌指结构基序。
图4为转录因子HbWRKY82的亚细胞定位分析图。
图5为HbWRKY82转录激活活性分析图。
图6为HbWRKY82基因在橡胶树不同组织中的表达分析结果。
图7为HbWRKY82基因在橡胶树不同发育时期叶片中的表达分析结果。
图8为HbWRKY82基因在乙烯利处理橡胶树叶片(稳定期)中的表达分析结果。
图9为HbWRKY82基因在死皮和健康橡胶树胶乳和树皮中的表达分析结果。
图10为转基因和野生型拟南芥植株中HbWRKY82的表达分析结果。
图11为各转基因拟南芥株系和野生型植株生长情况比较。
图12为盐胁迫下HbWRKY82过表达因株系和野生型拟南芥种子的发芽率变化。
图13为盐胁迫下转基因和野生型拟南芥植株根系长度的变化。
图14为干旱胁迫下转基因和野生型拟南芥种子的发芽率变化。
图15为干旱胁迫对转基因及野生型拟南芥植株根系长度的影响。
图16为ABA处理下转基因与野生型拟南芥植株种子发芽率的变化。
图17为ABA处理下转基因与野生型拟南芥植株根系长度变化。
图18为ERD10基因在野生型及转基因拟南芥植株中的表达情况。
图19为在转基因拟南芥中表达量上升的抗逆相关基因的表达情况。
图20为乙烯利处理下转基因与野生型拟南芥植株生长变化。
图21为转基因和野生型拟南芥植株中叶片衰老标记基因的表达情况。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。
1、材料
本实验中所用巴西橡胶树材料取自种植于中国热带农业科学院试验场六队的实生树(热研7-33-97)与试验场五队的芽接苗(热研7-33-97)。烟草(Nicotiana tabacum L.)(本生烟)和野生型拟南芥均由死皮防控机理课题组提供。
橡胶树叶片处理是以五队的长势相同且叶片无病虫害的芽接苗稳定期叶片为样品进行活体处理，分别在取样0、2、6、8、12、18、24、48h前对叶片喷洒0.4％的ET进行处理，同一时间点取样，每个时间点以每株苗上三片长势相同的叶片为一组，设三组重复，取下后置于-80℃保存备用。
橡胶树不同组织材料(根、树皮、木质部、芽、胶乳、叶片)和不同发育时期叶片的材料(古铜期叶、变色期叶、淡绿期叶、稳定期叶、衰老期叶)采自种植于中国热带农业科学院试验场六队的实生树，同一时间点采样，液氮冻存后，于-80℃保存备用。
本实验所用胶乳和树皮采自六队割龄为5年的实生树，采样前观察三次，采样时，每三株树为一组，其树皮和胶乳相对应，共三组重复，胶乳和树皮采下后立即放入液氮中，并置于-80℃保存备用。
本实验中所用引物如表1和表2所示。
表1橡胶树HbWRKY82基因克隆及表达载体构建所用引物
表2拟南芥抗逆及衰老相关基因的引物序列
本实验中，橡胶树胶乳RNA的提取方法参考曾日中等(2003)的方法，其他RNA提取方法参照TaKaRa植物提取试剂盒的方法。
2、橡胶树HbWRKY82基因的克隆
取橡胶树的叶片组织参照TaKaRa植物提取试剂盒的方法提取RNA，得到符合后续试验要求的总RNA。根据反转录试剂盒说明书(PrimeScript RT Reagent Kit With gDNAEraser)进行反转录，得到cDNA。设计读码框PCR扩增引物(见表1)，以获得的cDNA作为模板，进行PCR扩增，回收PCR产物，测序，得到正确的橡胶树HbWRKY82基因。
3、橡胶树HbWRKY82基因生物信息学分析
根据巴西橡胶树中叶片转录组筛选出的HbWRKY82基因序列，利用NCBI数据库中的ORF finder找到ORF及推测氨基酸序列。据此设计引物，以叶片cDNA为模板进行PCR扩增测序，获得HbWRKY82完整的开放读码框(ORF)，通过分析，HbWRKY82的ORF为558bp，编码由185个氨基酸组成的蛋白质(图1)，其蛋白质分子量推测为21.23kD，等电点(pI)为9.632。通过SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)和NCBI CDD数据库预测分析发现，其在第106-164氨基酸之间存在一个WRKY家族转录因子特有的WRKYGQK保守motif和C2-H2zinc-finger motif(C–X4–C–X23–H–X1–C)(Fig.1)，在该序列的N-端含有一个核定位信号(KPGKKKGEKKIRKPR)，符合gourp II WRKY是转录因子的基本特征。
通过Clustal W以及MEGA6.0(用Neighbor-Joing法，bootstrap值设为1000)软件构建HbWRKY82与其他植物WRKY蛋白的系统进化树。系统进化分析用WRKY类转录因子均来自NCBI数据库。系统进化树结果表明,HbWRKY82与水稻OsWRKY72和蓖麻WRKY转录因子RcWRKY75距离较近(图2)，均属于group IIc类WRKY家族转录因子。根据系统进化结果，应用DNAMAN V6.0.3软件对HbWRKY82和与其关系较近的WRKY蛋白进行多序列比对，结果表明，HbWRKY82与其他group IIc类WRKY蛋白具有较高的同源性，均具有1个典型的WRKY结构域和一个C2H2锌指结构基序(图3)。
4、亚细胞定位分析
设计特异性引物(表1)对HbWRKY82完整编码区(去除终止密码子)进行克隆并构建至表达载体pCAMBIA1304中GFP的5’端形成pCAMBIA1304：HbWRKY82：GFP融合表达蛋白，pCAMBIA1304空载体做对照；通过农杆菌EHA105侵染烟草表皮细胞，通过激光共聚交荧光显微镜。
培养2-5d后在激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP2,Germany)下，检测GFP信号，结果如图4所示，相对于空载对照中单独GFP的荧光充满整个细胞，HbWRKY82:GFP的荧光信号主要存在于细胞核中，是核定位蛋白。
5、转录激活功能分析
设计特异性引物(表1)对HbWRKY82完整编码区进行克隆并构建至酵母载体pGBKT7的GAL4DNA-binding结构域，形成pGBKT7-HbWRKY82重组质粒，pGBKT7和HbNAM分别作为阴性和阳性对照，将这些质粒转化酵母菌株Y2HGold，通过转化子在不同培养基上的生长状态分析是否具有转录激活活性。
在不同培养基上酵母生长状况如图5所示，在SD/-Trp培养基上，pGBKT7-HbWRKY82融合表达蛋白、pGBKT7-HbNAM阳性对照以及pGBKT7空载对照均能正常生长，而在SD/-Trp/-His/-Ade培养基上，只有pGBKT7-HbWRKY82以及pGBKT7-HbNAM阳性对照能正常生长，且在X-α-gal存在时显示蓝色。这说明HbWRKY82编码的蛋白含有转录激活域，能够与载体中的GAL4DB结合，激活报告基因的表达。
6、橡胶树不同组织中HbWRKY82基因表达分析
提取橡胶树不同组织RNA，设计荧光定量PCR引物(表1)对HbWRKY82进行表达特性分析。以PCR产物和cDNA混合物为模板，经过梯度稀释后，参照
Premix Ex TaqTM说明书配制20μL的PCR体系，使用荧光定量PCR仪(Bio-Rad)进行荧光定量PCR，反应程序为：95℃，预变性30s；95℃，预变性5s，58℃，退火30s，40个循环，制作引物扩增的标准曲线。采用同材料的cDNA作为模板和对应的荧光定量引物，进行荧光定量PCR反应，每个材料做3独立重复和技术重复，每轮PCR反应做一个无模板(dd H2O)对照。荧光定量反应体系及程序同上。以Hb18SrRNA作为内参基因，并结合所做的标准曲线，采用2-△△CT方法处理数据并利用SAS(v8.0)进行显著性分析。
提取橡胶树不同组织(根、芽、树皮、木质部、叶片和胶乳)RNA后，以Hb18SrRNA作为内参基因，采用实时荧光定量技术对HbWRKY82在正常生长条件下的橡胶树不同组织中的表达模式进行了分析。结果如图6所示，HbWRKY82在橡胶树不同组织中有一定量的表达，但表达量存在显著差异。HbWRKY82在根中的相对表达量最高，而在叶片(稳定期)和叶柄中的相对表达量最低。
提取橡胶树不同发育时期叶片(古铜期、变色期、淡绿期、稳定期、衰老早期、衰老中期和衰老晚期)RNA后，以Hb18SrRNA作为内参基因，采用实时荧光定量技术对HbWRKY82在正常生长条件下的橡胶树不同发育时期叶片中的表达模式进行了分析。结果如图7所示，HbWRKY82在淡绿期的叶片中相对表达量最高，而在稳定期和衰老晚期的叶片中表达量最低；并且其在衰老早期、衰老中期和衰老晚期呈现下调的趋势。
对橡胶树叶片在乙烯利处理不同时间下，分析了HbWRKY82的表达特性(图8)，结果表明，HbWRKY82在乙烯利处理下的叶片中呈上调表达，并在处理后24h达到峰值，在24h之前则呈双峰趋势，说明乙烯利刺激可显著诱导橡胶树叶片HbWRKY82的表达。
在健康和死皮橡胶树的胶乳和树皮中对HbWRKY82的表达特性进行了分析(图9)，结果表明，死皮橡胶树树皮和胶乳中HbWRKY82的表达量显著低于健康树的树皮和胶乳中的表达量，因此，死皮对HbWRKY82的表达有显著影响。
7、HbWRKY82转基因拟南芥的研究
7.1、转基因植株中HbWRKY82基因的表达水平检测
将HbWRKY82ORF构建至植物表达载体pCAMBIA1304，转化农杆菌EHA105，通过侵染花盘方法侵染野生型拟南芥(在光照培养箱中光照强度100-120μmol·m-2·sec-1，温度24℃，湿度为80％，设定合适的光照时间(16h光照，8h黑暗)，收集种子。通过连续潮霉素筛选和PCR检测得到纯化的T3代HbWRKY82过表达转基因种子。
将3个T3代转HbWRKY82基因纯合株系和野生型拟南芥的种子于4℃冰箱春化3天并进行消毒处理。将所有种子播种在MS培养基中生长1周，待子叶长出后，选择长势一致的幼苗移至营养土中生长两周，分别取样提取RNA，并反转录为cDNA，以作模板。实时荧光定量结果显示(图10)，HbWRKY82在转基因株系中均有表达，株系82-2表达量最高，而野生型拟南芥中未检测到该基因的表达。
7.2、转基因拟南芥株系的表型
HbWRKY82过表达植株与野生型拟南芥相在MS培养基下生长2周后(图11A)对比发现：HbWRKY82过表达植株的植株大小及叶片都会比野生型拟南芥大。在营养土中培养7周过表达植株与野生型拟南芥相比，有的过表达植株莲座叶比野生型拟南芥多，且分蘖多；有些过表达植株虽然莲座叶比野生型拟南芥少，长得较高(图11B)。培养观察发现，过表达植株比野生型植株生长周期长，培养至3个月后(图11C)，过表达植株与野生型植株均枯黄死亡，野生型植株比过表达植株先衰老枯死。
7.3、HbWRKY82过表达转基因拟南芥的耐盐性
(1)转基因拟南芥在不同盐浓度下的萌发率
在NaCl处理条件下，比较3个转基因拟南芥HbWRKY82-L1，L2，L3和野生型拟南芥的情况。拟南芥纯合株系种子HbWRKY82-L1，L2，L3和野生型拟南芥的种子播种于添加了不同浓度的(0、100mM、200mM)NaCl固体培养基上。在培养基上培养一周后观察记录(图12)。当生长在MS培养基上时，过表达三系和野生型拟南芥的种子几乎全部萌发且长出子叶，长势无明显区别；在NaCl浓度100mM时，HbWRKY82-L1，L2，L3过表达三系萌发率为96.66％，97.49％和97.33％，野生型萌发率则为95.50％，过表达三系几乎全部萌发，大部分长出子叶，而野生型拟南芥虽然种子几乎全部萌发，但是仅有少部分长出子叶；在NaCl浓度200mM时，HbWRKY82-L1，L2，L3过表达三系萌发率为76.88％，81.77％和87.43％，野生型萌发率为29.00％，而且过表达三系的种子大部分都露白，而野生型拟南芥的萌发率已经受到严重影响。实验数据表明，转基因植株纯系种子比野生型种子更具有耐盐性。本次实验重复三次，不同浓度处理的种子约210粒。
(2)转基因拟南芥在不同盐浓度下的根系长度变化
HbWRKY82过表达拟南芥纯合株系种子HbWRKY82-L1，L2，L3和野生型拟南芥的种子播种在MS培养基垂直培养5天，选取生长状态相同、根长一致的幼苗，转移到含有不同浓度(0、100mM、200mM)NaCl固体培养基上，垂直培养一周，观察记录实验结果(图13)。在MS对照培养基上，过表达三系和野生型拟南芥的根系长度无明显差别。过表达三系的主根平均长度为2.55cm，2.57cm和2.57cm，野生型平均主根长度为2.52cm。当NaCl浓度达到100mM时，过表达系和野生型拟南芥根的生长均受到明显的抑制，但野生型拟南芥根的生长受到的抑制更加显著。过表达三系的主根平均长度为2.20cm，2.10cm和1.85cm，野生型平均主根长度为1.22cm。在NaCl浓度为200mM时，野生型拟南芥生长受抑制，生长基本停滞，植株白化，而过表达植株叶片虽然不继续生长，但绝大部分叶片呈绿色。过表达三系的主根平均长度为0.61cm，0.62cm和0.67cm，野生型平均主根长度为0.64cm。实验数据表明，转基因植株HbWRKY82-L1，L2，L3比野生型的纯系幼苗耐盐性高。本次实验重复3次，不同浓度处理的幼苗需6株。
7.4、HbWRKY82过表达转基因拟南芥的耐旱性
(1)转基因拟南芥在不同甘露醇浓度下的种子萌发率
在甘露醇处理条件下，比较3个转基因拟南芥HbWRKY82-L1，L2，L3和野生型拟南芥的情况。拟南芥纯合株系种子HbWRKY82-L1，L2，L3和野生型拟南芥的种子播种于添加了不同浓度的(0、100mM、200mM)甘露醇固体培养基上。在培养基上培养一周后观察记录(图14)。当生长在MS培养基上时，过表达三系和野生型拟南芥的种子几乎全部萌发且长出子叶，长势无明显区别；在甘露醇浓度为100mM时，HbWRKY82-L1，L2，L3过表达三系萌发率为96.33％，96.00％和97.67％，野生型萌发率则为94.33％。过表达三系几乎全部萌发，但长势受到一定的影响，而野生型拟南芥虽然种子几乎全部萌发，但是少于一半的幼苗长出子叶；在甘露醇浓度200mM时，HbWRKY82-L1，L2，L3过表达三系萌发率为95.00％，96.67％和97.67％，野生型萌发率为48.08％。过表达三系的幼苗大部分都长出子叶，而野生型拟南芥的萌发率已经受到严重影响，但也有少部分幼苗长出子叶。实验数据表明，转基因植株纯系种子比野生型种子更具有耐旱性。本次实验重复三次，不同浓度处理的种子约210粒。
(2)转基因拟南芥在不同甘露醇浓度下的根系长度变化
拟南芥纯合株系种子HbWRKY82-L1，L2，L3和野生型拟南芥的种子播种在MS培养基垂直培养5天，选取生长状态相同、根长一致的幼苗，转移到含有不同浓度(0、100mM、200mM)甘露醇固体培养基上，垂直培养一周，观察记录实验结果(图15)。当甘露醇浓度达到100mM时，过表达系和野生型拟南芥根的生长已经出现明显的区别，野生型拟南芥相比于过表达三系，根的生长明显受到抑制。过表达三系的主根平均长度为2.17cm，2.10cm和2.08cm，野生型平均主根长度为1.23cm。在甘露醇浓度为200mM时，野生型拟南芥相比于过表达三系，根的生长明显受到抑制。过表达三系的主根平均长度为1.73cm，1.90cm和1.73cm，野生型平均主根长度为1.02cm。实验数据表明，转基因植株HbWRKY82-L1，L2，L3比野生型的纯系幼苗耐旱性高。本次实验重复三次，不同浓度处理的幼苗需6株。
7.5、HbWRKY82过表达转基因拟南芥对脱落酸ABA响应的变化
(1)转基因拟南芥在不同ABA浓度下的种子萌发率
在甘露醇处理条件下，比较3个转基因拟南芥HbWRKY82-L1，L2，L3和野生型拟南芥的情况。拟南芥纯合株系种子HbWRKY82-L1，L2，L3和野生型拟南芥的种子播种于添加了不同浓度的(0、0.5μM、1.0μM)ABA固体培养基上在培养基上培养一周后观察记录(图16)。当生长在MS培养基上时，过表达三系和野生型拟南芥的种子几乎全部萌发且长出子叶，长势无明显区别；在ABA浓度0.5μM ABA时，HbWRKY82-L1，L2，L3过表达三系萌发率为75.25％，72.95％和70.25％，野生型萌发率则为44％。过表达三系萌发已经受到影响，幼苗子叶难以展开。而野生型拟南芥种子萌发受到严重影响。在ABA浓度1.0μM ABA时，HbWRKY82-L1，L2，L3过表达三系萌发率为28.56％，27.55％和31.71％，野生型萌发率为12.78％。过表达三系和野生型拟南芥的萌发率均已经受到严重影响，野生型比过表达三系受到的影响强度大。实验数据表明，转基因植株纯系种子相对于野生型种子对ABA的敏感性降低。本次实验重复3次，不同浓度处理的种子约210粒。
(2)转基因拟南芥在不同ABA浓度下的根系长度变化
拟南芥纯合株系种子HbWRKY82-L1，L2，L3和野生型拟南芥的种子播种在MS培养基垂直培养5天，选取生长状态相同、根长一致的幼苗，转移到含有不同浓度(0、0.5μM、1.0μM)ABA固体培养基上，垂直培养一周，观察记录实验结果(图17)。在ABA浓度0.5μM ABA时，过表达系和野生型拟南芥根的生长已经出现明显的区别，野生型拟南芥相比于过表达三系，根的生长明显受到抑制。过表达三系的主根平均长度为2.35cm，2.32cm和2.38cm，野生型平均主根长度为1.93cm。在ABA浓度1.0μM ABA时，过表达三系的主根平均长度为2.13cm，2.16cm和2.07cm，野生型平均主根长度为1.66cm。实验数据表明，转基因植株HbWRKY82-L1，L2，L3与野生型的纯系幼苗相比，主根的生长对ABA的敏感性比野生型降低。本次实验重复3次，不同浓度处理的幼苗需6株。
7.5、HbWRKY82过表达转基因拟南芥抗逆相关基因的表达
收集拟南芥种子WT，HbWRKY82-1，82-2，82-3，4℃，冰箱中春化3天后消毒，分别播种于MS培养基平板上，于光照培养箱正常培养至萌发。培养一周后，选择长势一致的幼苗移入有营养土中继续培养两周。培养的材料直接取材，放入液氮中，提取RNA。反转录后用于做模板。选取15个抗逆相关基因用于检测转基因拟南芥的抗逆境能力，各逆境相关基因及其功能如表3。以证明抗逆相关的基因设计特异性引物(表2)，采用q-PCR技术，以TUB2(TUB2-F:CTCAAGAGGTTCTCAGCAGTA；TUB2-R:TCACCTTCTTCATCCGCAGTT)为内参基因对抗逆相关的基因在转基因拟南芥各株系中的表达特性进行分析。结果表明，除了ERD10基因外(图18)，其余15个抗逆基因在转基因拟南芥中的表达量都高于野生型拟南芥植株(图19)。
表3植物逆境相关基因及其功能
7.6、转基因拟南芥对乙烯利响应的变化
将3个T3代纯合株系拟南芥HbWRKY82-L1，L2，L3和野生型的种子放于4℃冰箱中春化3天后，对拟南芥种子表面进行灭菌处理，播种于MS固体培养基上生长(图20)。在MS培养基上生长一周后，将长势一致的过表达三系和野生型拟南芥幼苗分别移至营养土中继续生长三周后，用不同浓度(0.05％、0.1％、0.2％)的乙烯利均匀喷施在拟南芥幼苗的叶片上，恢复培养4天和8天。实验结果表明，喷施乙烯利后，过表达三系和拟南芥表型发生了变化。在喷施浓度0.05％乙烯利4天后，过表达三系和野生型拟南芥表型变化不明显，8天后，四系都有叶片枯萎死亡，除了47-3株系枯萎死亡较少，其他并没有显著差异。在喷施浓度0.1％乙烯利4天后，四系都有部分叶片枯萎死亡，但过表达三系绿叶率明显高于野生型拟南芥，8天后，过表达三系植株已经开始恢复长出新的叶片，但野生型的叶片枯萎死亡现象更明显。在喷施浓度0.2％乙烯利4天后，四系都有部分叶片枯萎死亡，但过表达三系绿叶率明显高于野生型拟南芥，8天后，过表达三系植株已经开始恢复长出新的叶片，但野生型的叶片几乎全部死亡。
7.7、转基因拟南芥叶片衰老标记基因的表达
本实验选择EIN3、WRKY53、AtNAP、SRG2、GST和RBCS1A这6个植物叶片衰老标记基因，通过观察转HbWRKY82基因拟南芥植株中各衰老基因表达的变化，探明HbWRKY82在植物叶片衰老过程中的调控作用。根据拟南芥中以证明衰老标记基因设计特异性引物(表2)，采用q-PCR技术，以TUB2(TUB2-F:CTCAAGAGGTTCTCAGCAGTA；TUB2-R:TCACCTTCTTCATCCGCAGTT)为内参基因对其在转基因拟南芥各株系中的表达特性进行分析研究结果表明，WRKY53、EIN3、和RBCS1A在转基因拟南芥植株中的表达量显著高于野生型植株，而AtNAP的表达量则显著低于野生型植株(图21)。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国热带农业科学院橡胶研究所
<120> 一种橡胶树HbWRKY82基因及其应用
<130> 123345
<160> 50
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 558
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> HbWRKY82基因
<400> 1
atggaaaagt ttcaaatgtt atttcctttt tcatcgacag ggtcgccttc ttatcctgta 60
tcgtcaacca tgacaaattc tcatgttttt aacaattttc aaggggatac ttcaaatggg 120
ttcttggggt tgaagatgga caatcaagca gcagcactac taccaagaac agaattcaag 180
gaccttaact catcatcaca aagtgcaagc tttgcaagtg ggtctgaaac tgagctaaaa 240
ccaggcaaaa agaaggggga aaagaagatt agaaaaccca gatatgcttt ccaaactagg 300
agccaagttg atatactcga tgatggttat cggtggagga agtatggcca aaaagctgtc 360
aaaaacaaca aattcccgag gagctactat cggtgcacgc atcaagggtg caatgtaaag 420
aaacaagtgc aacgcctaac caaagatgaa ggcattgtag taacaactta tgaagggatg 480
catactcatc ctatagacag gcaaactgac aactttgaac atatcttgaa ccagatgcaa 540
atttacactt ccttttga 558
<210> 2
<211> 185
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HbWRKY82蛋白
<400> 2
Met Glu Lys Phe Gln Met Leu Phe Pro Phe Ser Ser Thr Gly Ser Pro
1 5 10 15
Ser Tyr Pro Val Ser Ser Thr Met Thr Asn Ser His Val Phe Asn Asn
20 25 30
Phe Gln Gly Asp Thr Ser Asn Gly Phe Leu Gly Leu Lys Met Asp Asn
35 40 45
Gln Ala Ala Ala Leu Leu Pro Arg Thr Glu Phe Lys Asp Leu Asn Ser
50 55 60
Ser Ser Gln Ser Ala Ser Phe Ala Ser Gly Ser Glu Thr Glu Leu Lys
65 70 75 80
Pro Gly Lys Lys Lys Gly Glu Lys Lys Ile Arg Lys Pro Arg Tyr Ala
85 90 95
Phe Gln Thr Arg Ser Gln Val Asp Ile Leu Asp Asp Gly Tyr Arg Trp
100 105 110
Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Ala Val Lys Asn Asn Lys Phe Pro Arg Ser
115 120 125
Tyr Tyr Arg Cys Thr His Gln Gly Cys Asn Val Lys Lys Gln Val Gln
130 135 140
Arg Leu Thr Lys Asp Glu Gly Ile Val Val Thr Thr Tyr Glu Gly Met
145 150 155 160
His Thr His Pro Ile Asp Arg Gln Thr Asp Asn Phe Glu His Ile Leu
165 170 175
Asn Gln Met Gln Ile Tyr Thr Ser Phe
180 185
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> HbWRKY82-F
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atggaaaagt ttcaaatgtt 20
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> HbWRKY82-R
<400> 4
tcaaaaggaa gtgtaaattt g 21
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> HbWRKY82-NdeI
<400> 5
cgccatatga tggaaaagtt tcaaatgtta ttt 33
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> HbWRKY82-XmaI
<400> 6
ctccccgggt caaaaggaag tgtaaatttg 30
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> HbWRKY82-NcoI
<400> 7
ctcccatgga tggaaaagtt tcaaatgtta t 31
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> HbWRKY82-SpeI
<400> 8
cgcactagtt caaaaggaag tgtaaatttg c 31
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> HbWRKY82-Fq
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<220>
<223> HbWRKY82-Rq
<400> 10
ttggtagtag tgctgctgct tg 22
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Hb18SrRNA-F
<400> 11
gctcgaagac gatcagatac c 21
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Hb18SrRNA-R
<400> 12
ttcagccttg cgaccatac 19
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> EIN3-F
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ccgattggac cgactcctca tac 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> EIN3-R
<400> 14
atagcaagcc aggtagcact ctc 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RBCS1A-F
<400> 15
agaggaatgg tgctgttggt gag 23
<210> 16
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RBCS1A-R
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caagtcaagg acacggtgaa tgc 23
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> WRKY53-F
<400> 17
gatcacaaga acaccaccat tagcc 25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> WRKY53-R
<400> 18
aaagttgtgt caatctcgac cgttg 25
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> AtNAP-F
<400> 19
atcatggaag taacttccca atc 23
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> AtNAP-R
<400> 20
ttcagttctt ctctctgctt c 21
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> AtNHX1-F
<400> 21
ccgtgcatta ctactggaga caat 24
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> AtNHX1-R
<400> 22
gtacaaagcc acgacctcca a 21
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SOS1-F
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tcgtttcagc caaatcagaa agt 23
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SOS1-R
<400> 24
tttgccttgt gctgctttcc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SKOR-F
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ccgggataag atggctgata 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SKOR-R
<400> 26
cacggatgtt cctaccgagt 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> AtCLCa-F
<400> 27
cacagagctc catggtctga 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> AtCLCa-R
<400> 28
ccggtgtgaa cttttcccta 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ERD10-F
<400> 29
agcaccacat tcggtagagg 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ERD10-R
<400> 30
ggtgtggtgt tgacgacttg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ABF3-F
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ggtgggttag ctgttggtgt 20
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ABF3-R
<400> 32
ccttcatcag ctccttccag 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ABF4-F
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tacagcggta gcgcaacct 19
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ABF4-R
<400> 34
cgaaccttgc ctctggagat t 21
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DREB1A-F
<400> 35
gctgactcgg cttggagact 20
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DREB1A-R
<400> 36
ccgccttttg gatgtcctt 19
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> AtP5CS-F
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<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> AtP5CS-R
<400> 38
aacaggaacg ccaccataag 20
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> COR414-F
<400> 39
gcttaggtta tcgggtga 18
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> COR414-R
<400> 40
attgtagact attggcagaa 20
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CSD1-F
<400> 41
gaactgccac cttcacaatc a 21
<210> 42
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CSD1-R
<400> 42
tggacaacaa cagccctacc 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 43
ggaccacatt tcaaccctaa ca 22
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CSD2-R
<400> 44
ccatcggcat tggcattt 18
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<212> DNA
<213> Artificial
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<223> FSD3-F
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gatgctttgg agccgtatat 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> FSD3-R
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agacaagcct gacccatcc 19
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RbohD-F
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ctggtggttt gtgaaaggag tg 22
<210> 48
<211> 20
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<213> Artificial
<220>
<223> RbohD-R
<400> 48
accaaggcgt agcgagtgta 20
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ZAT12-F
<400> 49
gagtcacaag aagcctaaca acg 23
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ZAT12-R
<400> 50
atcggaaact ccactccaca t 21
Claims (10)
1.一种橡胶树HbWRKY82基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种蛋白质，其特征在于，其为权利要求1所述的橡胶树转录因子HbWRKY82基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种权利要求1所述的橡胶树HbWRKY82基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）从橡胶树根、芽、树皮、木质部、叶片、胶乳和/或叶片中提取总RNA；（2）以总RNA为模板进行反转录获得cDNA；
（3）设计HbWRKY82基因全长序列扩增引物对，进行PCR扩增，回收PCR产物，其中，HbWRKY82基因全长序列扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；
（4）PCR产物连接载体，转化，测序，获得HbWRKY82基因序列。
4.如权利要求1所述的橡胶树HbWRKY82基因在细胞内定位和/或转录激活活性分析中的应用。
5.如权利要求1所述的橡胶树HbWRKY82基因在提高植物抗逆性中的应用。
6.如权利要求1所述的橡胶树HbWRKY82基因在提高植物耐盐性和/或耐旱性中的应用。
7.如权利要求1所述的橡胶树HbWRKY82基因在调控植物叶片衰老中的应用。
8.如权利要求1所述的橡胶树HbWRKY82基因在培育抗逆以及抗叶片衰老转基因橡胶树中的应用。
9.一种表达载体，其含有权利要求1所述的橡胶树HbWRKY82基因。
10.一种引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示、或者SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示、或者如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，或者如SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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