CN106244594A - 大豆磷饥饿转录因子GmWRKY75、编码蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种磷饥饿转录因子GmWRKY75、编码蛋白及其应用。该基因的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示。本发明发现通过任何一种可以导入外源基因GmWRKY75的植物表达载体转化植物细胞可获得过表达GmWRKY75的转基因植株，与未转基因植株相比其全磷含量明显升高，侧根及根毛的发育明显受到抑制。本发明公开的基因可作为目的基因导入植物，提高转基因植物对磷元素的吸收，对培育磷高效利用大豆品种有重要意义。

Description

大豆磷饥饿转录因子GmWRKY75、编码蛋白及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种大豆磷饥饿转录因子GmWRKY75、编码蛋白及其应用。
背景技术
在植物所必须的营养元素中，磷是非常重要的一个，它参与了植物的生物合成、信号传导和能量转移等重要生理生化过程。大豆的根系只可以吸收土壤中以无机磷离子形式存在的磷，然而由于风化、侵蚀和金属离子的氧化固定，土壤中可以被大豆所利用的有效磷含量都比较低。植物的生长发育，其实就是内源信号和环境因素间不断相互影响、相互利用的一个动态平衡过程；这依赖的是植物对外界环境的感知以及信号通路的及时响应，并适当地做出一系列生理生化反应，从而对自身和外界造成影响。植物一般可以通过两种方式来达到这个目的，一是依靠外部Pi浓度和自身信号通路的相互影响；另一种是依靠植物体内自身的Pi代谢通路的调控。植物体内自身的Pi代谢平衡的改变会导致磷元素全身供给模式发生改变，进而影响根系表型结构的发育，而且激活Pi摄入的整个过程依靠的是全身性的系统调节来完成的。根据对分根实验的转录组学分析显示，与Pi吸收相关的基因和脂质代谢相关的基因通常是全身性响应调节的，而与应激或激素相关的基因是局部响应调节的。所以，植物对磷饥饿的响应是一个局部与全身系统相互协调的过程。
WRKY转录因子最显著的特征之一是含有一个或两个约60个氨基酸的WRKYGQK结构域，这个保守序列并非一成不变，少数也会有WRRY、WSKY、WKRY、WVKY或WKKY等变异。在其C端有一个非典型的锌指结构C2H2或C2HC。WRKY转录因子根据它的结构域数量和锌指结构类型被分为3组，含有两个结构域的被分在Group I，另外的在其他组，C2HC类型的锌指结构被分在Group III，Group II根据主要氨基酸序列又分为：Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe 5类。
WRKY能够特异识别W-box(T)(T)TGAC(C/T)顺式作用元件并与之结合启动下游基因表达来调控相关生理过程，W-box存在于多种参与生理过程基因的启动子中，并且不只一个，该W-box核心序列TGAC只要有一个氨基酸发生改变，WRKY与W-box结合活性就会迅速下降甚至完全消失，对于含有多个W-box的，其中会有一个W-box在结合上起到关键作用。说明W-box核心序列对于WRKY结合的必要性。
通过现有的转基因、RNAi、基因芯片、反向遗传学等技术，人们已经鉴定并验证了许多WRKY转录因子的功能，它们主要与生长发育、植物非生物胁迫(干旱、冷害、盐害)和生物胁迫(昆虫取食和病原物入侵)等有关。当AtWRKY70过表达时，会增加拟南芥对病原菌的抗性；AtWRKY53是一个叶片衰老早期阶段表达的转录因子；研究发现AtWRKY53过表达的株系显示出了加速叶片衰老的现象，相反，在RNAi和插入突变的AtWRKY53抑制表达株系中，叶片衰老的出现时间被相对延迟；这表明AtWRKY53在调节叶片衰老方面具有重要的作用；AtWRKY6是另外一个衰老相关的重要转录因子，通过分析幼叶、成熟叶和衰老叶中AtWRKY6的表达水平发现，在衰老的叶片中，AtWRKY6的表达水平远远高于前两者。
AtWRKY6/AtWRKY42：早期对WRKY6的研究都集中在衰老和病原菌防御方面，研究表明，WRKY6在叶片衰老期间强烈诱导表达，WRKY6不仅能抑制自身启动子活性，还能抑制同一亚组的WRKY42的活性，分析表明，有些WRKY启动子中也存在W-box，从而可以自我调控和相互调节，另一方面，WRKY6正调控衰老和防御相关PR1启动子活性，叶片衰老强烈诱导的SIRK(The senescence-induced receptor kinase)转录活性依赖于WRKY6。WRKY6通过调控PHO1(Phosphate1)的表达来参与拟南芥响应Pi饥饿胁迫，PHO1能被Pi饥饿诱导。过表达WRKY6株系抑制PHO1表达，使生长受阻、花青素积累以及体内Pi含量减少，此外，WRKY42也能结合PHO1启动子的W-box抑制PHO1的表达。还有报道表明，砷通过植物磷酸盐转运体被吸收和移动，WRKY6能被砷诱导，导致Pi响应基因的特异性抑制(PHT1；1)。
AtWRKY75最早是从拟南芥芯片数据中发现强烈诱导PSI基因，并且许多PSI的启动子中含有W-box。为了破解WRKY75在植物Pi胁迫响应中的作用，通过RNAi沉默抑制其表达，在Pi不足时，该突变体表现出早期花青素积累，包括AtPS1和AtPS2，高亲和转运蛋白Pht1；1和Pht1；4在内的一些关键PSI基因表达减少，推测它们可能参与了Pi运输和信号途径，这样就导致Pi吸收和含量减少，也说明在Pi不足时WRKY75对一些Pi动员、吸收、运输以及信号途径的正调控，WRKY75的沉默能显著增加侧根长度，根毛密度和数量，因此更有利于突变体在更长的时期内吸收更多的Pi。在RNA干扰突变植株中，WRKY75对根系生长发育的调控与Pi含量无关，这就表明，WRKY75对植物根系生长发育调控的功能行使与Pi饥饿的多少无关。进而推测WRKY75作为根系发育的组成性负调控从而影响Pi的吸收。总而言之，这些数据显示WRKY75在维持植物体内Pi平衡中具有重要作用。
发明内容
1、发明要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种大豆磷饥饿转录因子GmWRKY75。
本发明的另一个目的是提供该基因所编码的蛋白。
本发明的另一个目的是提供含有上述基因的重组质粒。
本发明的又一个目的是提供上述基因或重组质粒在调控大豆体内磷代谢平衡及培育磷高效利用大豆品种中的应用。
2、技术方案
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种大豆磷饥饿转录因子GmWRKY75，其核苷酸序列如序列表Seq ID NO.1所示。
本发明还提供了一种大豆磷饥饿转录因子GmWRKY75所编码的蛋白，其氨基酸序列如序列表Seq ID NO.2所示。
进一步地，本发明提供了一种含有该大豆磷饥饿转录因子GmWRKY75的重组质粒，是将大豆磷饥饿转录因子GmWRKY75插入pCAMBIA3301植物过量表达载体和融合表达载体pJIT-166-GFP中而成的。
进一步地，本发明提供了扩增所述大豆磷饥饿转录因子GmWRKY75全长或其任意片段的引物对，该引物对的上游引物如序列表Seq ID No.3所示，下游引物如序列表Seq IDNo.4所示。
进一步地，本发明提供了所述的大豆磷饥饿转录因子GmWRKY75或所述重组质粒在调控大豆体内磷代谢平衡中的应用。
进一步地，本发明提供了所述的大豆磷饥饿转录因子GmWRKY75或所述重组质粒在培育磷高效利用大豆品种中的应用。
进一步地，本发明提供了一种培育转基因植物的方法，就是将所述磷饥饿转录因子GmWRKY75通过重组质粒导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物相比于目的植物全磷含量明显升高，侧根及根毛的发育明显受到抑制。
3、有益效果
⑴本发明所提供的大豆饥饿转录因子GmWRKY75，定位在大豆的第16号染色体Gm16:5308516–5311399区间，包含有2个外显子1个内含子，读码框长度为588bp；在靠近N端有一个最为保守的WRKYGQK结构域，此外该结构域还连有一个C2H2型的锌指结构，属于大豆GmWRKY家族成员；利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明GmWRKY75基因导入植物细胞，可获得全磷含量明显升高，侧根及根毛的发育明显受到抑制的转基因植株；
⑵使用本发明的基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子；为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素、卡那霉素等)；
⑶携带有本发明GmWRKY75的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株；被转化的宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物；
⑷本发明的基因对大豆体内磷元素代谢有积极的调控作用，特别的在培育高磷吸收大豆品种育种中具有重要意义。
附图说明
图1为植物中的WRKY蛋白的系统发生分析与结构分析图。
图2为大豆GmWRKY75基因的PCR检测电泳图。
图3为大豆GmWRKY75基因的表达分析图。
注：用低磷处理大豆幼苗，分别于0h、12h、1d、2d和3d探索基因表达量的变化；数值以3个重复的平均值±标准差形式表示。
图4为大豆GmWRKY75基因的植物过量表达载体构建和融合表达载体构建图。
图5为转基因拟南芥苗的检测效果图。
图6为pCAMBIA3301和pJIT-166-GFP的结构示意图。
图7为转基因拟南芥总磷含量的测定图。
图8为转基因拟南芥侧根长度与数量的测量图。
图9为转基因拟南芥根毛长度与数量的测量图。
图10为转基因拟南芥在不同MS处理下萌发生长图。
图11为转基因拟南芥开花期水培图及其收货种子对比图。
注：1为WT，2-4为转基因拟南芥。
图12为大豆GmWRKY75基因的亚细胞定位图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：GmWRKY75结构分析
GmWRKY75定位在大豆的第16号染色体，位置为Gm16(5 308 516-5 311 399)，具有2个外显子1个内含子。蛋白结构分析(SMART,http://smart.embl-heidelberg.de/)发现，如图1A所示，GmWRKY75的N末端有1个WRKYGQK结构域和1个C2H2-type锌指结构。
以GmWRKY75的氨基酸序列为探针，利用NCBI的BLASTp工具，获得了Arabidopsis，Gossypium raimondii，Medicago truncatula，Oryza sativa和Phaseolus vulgaris中的WRKY75蛋白：AT5G13080，Gorai013G179400，Medtr7g028415，Os07g0680400andPhvul.001G088200。如图1B所示，多重比对发现，这些WRKY75蛋白都包含一个WRKYGQK结构域和1个C-X4-C-X23-H-X1-H锌指结构。之后通过文献查找，检索到至今所有报道过参与调控植物磷酸盐饥饿调控的WRKY蛋白：GmWRKY75，AtWRKY75，AtWRKY6，AtWRKY42，AtWRKY45，OsWRKY74和GbWRKY1；然后对上述所有蛋白进行分析；结果发现，如图1C所示，GmWRKY75在WRKY转录因子家族中属于IIc亚族。
实施例2：大豆磷饥饿转录因子GmWRKY75的克隆
(1)设计引物，提取RNA，反转cDNA：
用RNAiso Reagent(购自TaKaRa)提取低磷处理5天后的大豆品种科丰1号根部总RNA，经1％琼脂糖电泳检测RNA的完整性；cDNA的合成按照TaKaRa公司SYBR PrimeScriptRT-PCR Kit II试剂盒说明操作。扩增基因GmWRKY75的引物序列为：
Seq ID NO.3：GmWRKY75-F 5’-ATGGAGAATTATTCTATGTTGTTCC-3’；
Seq ID NO.4：GmWRKY75-R 5’-AAAGGGAGTGTATATTTTCATC-3’。
(2)PCR扩增，具体步骤如下：
步骤一：按照以下组份顺序配制PCR反应液(50μL体系)：ExTaq酶mix(25μL)，GmWRKY75-F(1μL)，GmWRKY75-R(1μL)，cDNA(1μL)，ddH2O(22μL)；
步骤二：设定反应程序为：95℃，5min；(94℃，30sec；56℃，30sec；72℃，60sec；30个循环)；72℃，10min；4℃保存；
步骤三：PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，如图2所示，经过15分钟的琼脂糖凝胶电泳，获得了588bp大小的单一条带，与目的基因大小一致，回收纯化后将PCR产物连接至pMD19-T Simple质粒；将重组质粒转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，隔夜培养挑取单菌落，培养过夜后进行菌检，将正确的PCR条带送测序；根据测序结果，保存插入片段正确的菌液并提取质粒。
实施例3：大豆磷饥饿转录因子GmWRKY75的荧光定量分析
(1)选取处理时间分别为0h、12h、1d、2d和3d的大豆根与叶的cDNA样品为材料，选用的荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒为IQ SYBR Green(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)；
(2)设计引物
针对GmWRKY75基因序列设计荧光定量特异性引物为：
Seq ID NO.5：上游引物5’-TGTGAGTGATGAGTTAGGTGGTTCC-3’；
Seq ID NO.6：下游引物5’-AACAGCTTTTTGGCCATACTTCCTC-3’。
内参基因选用Tubulin，引物序列如下：
Seq ID NO.7：上游引物5’-GGAGTTCACAGAGGCAGAG-3’；
Seq ID NO.8：下游引物5’-CACTTACGCATCACATAGCA-3’。
(3)荧光定量PCR扩增，具体步骤如下：
步骤一：按照以下组份顺序配制PCR反应体系(20μL体系)：2×SuperReal PreMix(SYBR Green)(10μL)，引物(各0.5μL)，cDNA(2μL)，ddH2O(7μL)；
步骤二：使用CFX96Touch(Bio-Rad)实时荧光定量PCR仪，设定PCR反应程序为，95℃，15min；(95℃，10sec；60℃，30sec；40个循环)；
步骤三：荧光定量PCR所获得的结果，均采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量，具体方法如下，以正常磷环境下生长0h、12h、1d、2d和3d的大豆根和叶组织cDNA的Ct值为对照组，以低磷环境下生长0h、12h、1d、2d和3d的大豆根和叶组织cDNA的Ct值为处理组；设0d的Δ值为1，计算出处理0h、12h、1d、2d和3d相较于0d时的表达倍数；公式如下：2-ΔΔCt＝[(Cttreated-Ct control)sampleA-(Ct treated-Ct control)sampleB]；三次生物学重复所计算出的数据，与对照组数据在Excel 2007软件中进行Student’s t-test检测，获得处理组相对表达量变化三次生物学重复的标准差，以*P＝0.05；**P＝0.01；***P＝0.001的标准绘制成图。
如图3所示，低磷环境的诱导下，大豆叶中GmWRKY75的表达随着磷饥饿胁迫时间的延长在处理1天后，相对表达量显著升高；而大豆根中GmWRKY75的表达随着磷饥饿胁迫时间的延长在处理2天后，相对表达量显著升高。说明低磷环境会诱导GmWRKY75基因的表达。
实施例4：大豆GmWRKY75基因在拟南芥中的表达
(1)GmWRKY75的植物表达载体所使用的载体为pCAMBIA3301，pCAMBIA3301-GmWRKY75载体的构建方法为双酶切法，设计特异性引物，加Nco I、Bgl II酶切位点和保护碱基，特异性引物为：
Seq ID NO.9：上游引物如下
5’-CATGCCATGGATGGAGAATTATTCTAT-3’；
Seq ID NO.10：下游引物如下
5’-GAAGATCTTTAAAAGGGAGTGTATATTTTC-3’；
(2)经过PCR反应程序及PCR产物回收，然后对PCR产物回收和空载pCAMBIA3301进行双酶切，回收纯化正确的片段进行连接。将反应液转化大肠杆菌，挑取单菌落，培养后进行测序，选取正确测序结果提取质粒，获得pCAMBIA3301-GmWRKY75质粒(如图6A所示)，并进行双酶切检测再次检验质粒是否正确，如图4所示，琼脂糖凝胶电泳获得了与目的基因大小一致的条带，证实实验结果真实可信。
(3)将正确含有目的基因的植物表达载体利用滴花法转化拟南芥，具体步骤如下：
步骤一：在拟南芥生生长至刚开花时，剪断主茎以促进侧枝花序生长；
步骤二：当花蕾露白时，培养带有pEarleygate103-GmWRKY75的农杆菌，200rpm 28℃条件下摇菌至OD600值达到1.2-1.8，4000rpm 4℃离心10min；
步骤三：用5％的蔗糖溶液重悬2次，将OD值稀释到0.8-1.0；
步骤四：加入表面活性剂Silwet L-77(用量0.01％)混匀菌液；
步骤五：用枪头将菌液滴到花蕾上，重复一次；
步骤六：用黑色塑料袋套袋，暗培养一天后正常培养；
步骤七：在花期中可多次侵染；
步骤八：待种子成熟后，分株收种。
(4)阳性转基因苗的筛选，具体步骤如下：
步骤一：选取适量的转基因拟南芥种子和野生型拟南芥种子，使用含有20mg·L-1Bar的1/2MS培养基，对拟南芥种子进行培养；。
步骤二：培养2周后进行观察，若植株为阳性苗则可以在筛选培养基上正常生长至长出2片真叶，并且根系发达，而野生型植株和转基因阴性植株则不能正常生长；
步骤三：将初步鉴定的阳性苗转移至营养土中继续培养至即将抽薹；
步骤四：取叶片提取DNA进行PCR检测，阳性苗继续培养收种；
步骤五：重复上述收种、消毒、培养、鉴定的过程，待繁殖到T3代进行功能验证。
(5)荧光定量PCR的方法检测转基因拟南芥中GmWRKY75的表达量
实验材料为拟南芥WT，拟南芥突变体wrky75和过表达转基因植株OXWRKY75；荧光定量PCR验证突变体中AtWRKY75的表达量和过表达株系中GmWRKY75的表达量，结果发现，如图5A所示，wrky75中AtWRKY75表达几乎为0；如图5B所示，过表达株系(OXWRKY75-13和OXWRKY75-14)中GmWRKY75的表达均大幅高于AtWRKY75，说明拟南芥突变体wrky75和过表达转基因植株OXWRKY75均达到了实验要求。
实施例5：转基因植株全磷含量的测定，具体步骤如下：
分别检测了野生型(WT)、突变体wrky75和过表达转基因植株OXWRKY75中的全磷含量。分别将20日龄的WT、wrky75和OXWRKY75置于正常磷(625μM KH2PO4)条件下和低磷(6.25μM KH2PO4)条件下培养，然后取整株幼苗进行后续实验。
步骤一：称取0.02g左右的样品干重，加入8mL ddH2O和2mL HNO3，用微波消解系统(Milestone ETHOS)200℃消煮10min，冷却至室温后，用ddH2O定容至10mL；
步骤二：用PerkinElmer Optima 2100DV ICP-OES system对样品总磷含量进行测定；
步骤三：用磷标样(1000μg/mL)稀释不同浓度，做标准曲线。
如图7所示，发现与WT相比，在正常环境和低磷环境中OXWRKY75的全磷含量均明显升高，而突变体wrky75的全磷含量并没有明显变化。
实施例6：GmWRKY75转基因植株根系统的观察
(1)将生长于1/2MS培养基中10天的拟南芥幼苗转移到正常磷MS和low P培养基中培养15天。使用爱普生EPSON Perfection V700/V750扫描整株后，使用winRHIZO根系分析系统分析相关信息。
(2)根毛形态分析：将生长在1/2MS培养基中10天的拟南芥幼苗转移到全磷MS培养基中培养10天，使用体视镜(OLYMPUS MVX10)拍摄初生根，使用ImageJ来测定该区域内(5mm)的根毛的长度和根毛的总数。
拟南芥根的构造包括三个部分，即初生根、侧根和根毛。初生根分生组织通过细胞的分裂，可以不停增加新的细胞是根部可以无限的生长；侧根的形成增加了根系探索的能力；而根毛的形成可以增加初生根和侧根的总表面面积。当遇到营养缺乏时，它们形态就会发生改变从而影响根的构造和植物在土壤中的状态。通常情况下，缺磷条件下植物的初生根生长会被抑制，而侧根的发育会被增强。
如图8和图9所示，与野生型拟南芥相比，两个GmWRKY75过表达拟南芥株系(OX75-13和OX75-14)侧根的总长度、分枝数和根毛的数量在低磷环境下均显著下降，结果证明GmWRKY75的过表达会抑制拟南芥侧根和根毛的发育。
实施例7：GmWRKY75转拟南芥植株的观察
(1)把野生型WT和GmWRKY75转基因株系放置在的不同磷浓度梯度的萌发培养基上，设置3个重复，3个梯度分别是：正常的1/2MS(2.35mM)中磷酸盐含量、缺磷(减少10-1，0.235mM)和严重缺磷(减少10-2，0.0235mM)的1/2MS，观察野生型和转基因株系生长状况。
(2)正常1/2MS上萌发的幼苗4叶后移栽到模拟低磷水培(10-1倍)溶液，水培集装箱内放置加氧泵，每周换一次营养液，挑选野生型做对照，和GmWRKY75转基因株系，观察拟南芥的开花结实状况。
从图10中可以明显看出，随着磷浓度的缺乏加重，表型也发生不同程度的缺磷症状。特别在10-2严重缺磷的MS上，幼苗表现了叶色浓绿，叶柄和幼茎呈紫红色，侧根发达根毛浓密，而且是野生型植株几乎都不能正常生长，大部分都死亡，而转基因的阳性苗还可以成活，说明GmWRKY75转录因子在低磷胁迫下响应，具有一定的耐低磷环境的功能。
将在正常的1/2MS上萌发的野生型和转基因株系长到4片真叶后移栽到模拟的低磷(10-1MS)水培环境下，营养液中放置加氧泵，每三天换一次营养液，直至开花结实，观察对植株营养生长的影响。
从图11A中可以明显看出，野生型在模拟低磷水培下不能正常生长，植株矮小发育迟缓，叶片小而深绿，表现出缺磷的初步症状，开花期明显延迟。从图11B后期结实情况看，野生型荚数明显少于转基因株系，且多数荚果瘪小，种子发育不成熟。
实施例8：GmWRKY75的亚细胞定位
(1)GmWRKY75的亚细胞定位所使用的载体为pJIT-166-GFP，pJIT-166-GFP-GmWRKY75载体的构建方法为双酶切法，设计特异性引物，加Xba I、BamH I酶切位点和保护碱基。
特异性引物为：
Seq ID NO.11：上游引物如下
5’-GCTCTAGAATGGAGAATTATTCTATGTTGTTCCC-3’；
Seq ID NO.12：下游引物如下
5’-CGGGATCCAAAGGGAGTGTATATTTTCATC-3’；
经过PCR反应程序及PCR产物回收，然后对PCR产物回收和空载pJIT-166-GFP进行双酶切，回收纯化正确的片段进行连接。将反应液转化大肠杆菌，挑取单菌落，培养后进行测序，选取正确测序结果提取质粒，获得pJIT-166-GFP-GmWRKY75质粒(如图6B所示)，并进行双酶切检测再次检验质粒是否正确，琼脂糖凝胶电泳获得了与目的基因大小一致的条带，证实实验结果真实可信(如图4所示)。
(2)使用基因枪轰击洋葱内表皮和PEG转化拟南芥原生质体两种方法来探究GmWRKY75在植物细胞中的定位。
A.基因枪转化洋葱表皮法，具体步骤如下：
步骤一：使用新鲜洋葱，将其鳞茎切成适量大小，剥取内表皮迅速贴到等渗的MS培养基上，倒置25℃暗培养过夜；
步骤二：制备微弹：在1.5mL的无菌离心管中加入8.5μL金粉，涡旋2min，使其均匀悬浮；在该管中依次加入5μL质粒DNA(1μg/μL)，10μL CaCl2(2.5M)，4μL亚精胺(0.1M)，涡旋2-3min充分混匀，4℃静置10min；10000rpm离心10s，弃上清，加入140μL70％乙醇，涡旋2min；重复上一步；加入10μL无水乙醇重悬，充分混匀；
步骤三：基因枪轰击洋葱表皮细胞，通过基因枪将包裹DNA的金粉微弹轰击至洋葱表皮细胞中，25℃暗培养20h后，将洋葱表皮置于载玻片上，使用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光的位置。
观察结果如图12所示，从图中可以看出，荧光信号很强，空载中绿色荧光分布在整个细胞中，而pJIT166-GFP-GmWRKY75的绿色荧光只在细胞核内表达，说明这2个转录因子定位在细胞核内，在核内行使功能。

Claims (8)

1.一种大豆磷饥饿转录因子GmWRKY75，其特征在于，所述磷饥饿转录因子GmWRKY75的核苷酸序列如序列表Seq ID NO.1所示。
2.一种权利要求1所述的磷饥饿转录因子GmWRKY75所编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID NO.2所示。
3.一种含有权利要求1所述的磷饥饿转录因子GmWRKY75的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒是将权利要求1所述的磷饥饿转录因子GmWRKY75插入pCAMBIA3301植物过量表达载体和融合表达载体pJIT-166-GFP中而成的。
4.扩增权利要求1所述磷饥饿转录因子GmWRKY75全长或其任意片段的引物对，其特征在于，所述引物对的上游引物如序列表Seq ID No.3所示，下游引物如序列表Seq ID No.4所示。
5.权利要求1所述磷饥饿转录因子GmWRKY75或权利要求3所述重组质粒在调控大豆体内磷代谢平衡中的应用。
6.权利要求1所述磷饥饿转录因子GmWRKY75或权利要求3所述重组质粒在培育磷高效利用大豆品种中的应用。
7.一种培育转基因植物的方法，其特征在于，所述方法是将权利要求1所述磷饥饿转录因子GmWRKY75导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物相比于目的植物全磷含量升高，侧根及根毛的发育受到抑制。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法中磷饥饿转录因子GmWRKY75是通过权利要求3所述的重组载体导入目的植物的。
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