CN104561045B

CN104561045B - 一种提高白桦抗逆性的转录因子及其编码的蛋白

Info

Publication number: CN104561045B
Application number: CN201510046863.7A
Authority: CN
Inventors: 杨传平; 胡萍; 张凯敏; 王玉成; 王艳敏
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2015-01-30
Filing date: 2015-01-30
Publication date: 2017-10-13
Anticipated expiration: 2035-01-30
Also published as: CN104561045A

Abstract

一种提高白桦抗逆性的转录因子及其编码的蛋白，它涉及一种可提高白桦抗性的基因及其编码的蛋白。本发明的目的是提供一种提高白桦抗逆性的转录因子及其编码的蛋白，通过转基因技术为将来培育和改良高抗逆性白桦品种奠定物质基础。提高白桦抗逆性的转录因子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。其编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明提高白桦抗逆性的转录因子BpWND1基因导入白桦后受干旱和盐胁迫而明显诱导表达，证明本发明BpWND1基因参与白桦的抗旱耐盐胁迫应答反应。

Description

一种提高白桦抗逆性的转录因子及其编码的蛋白

技术领域

本发明涉及一种可提高白桦抗性的基因及其编码的蛋白。

背景技术

白桦(Betula platyphylla Suk.)为桦木科桦属植物，为落叶乔木，生长速度快、是东北地区次生林的先锋树种，耐寒能力强，喜酸性土壤，在胶合板、单板的家具制造以及纸浆材等方面有广泛的应用。由于其重要的生态、观赏和实用经济价值，历来被列为国家科技计划研究的重要树种之一。对白桦品种改良的范围也在不断扩大，其主要目标是培育速生、优质和高抗的林木新白桦品种。但是传统的品种改良手段存在效果不明显，周期长，成功率低的问题。利用基因工程技术进行遗传改良可以解决上述问题，但首先需要找到在白桦中能够提升白桦性能的基因。

转录因子也称反式作用因子，是一类能识别真核生物基因启动子区域中的顺式作用元件，并与之发生特异性结合的蛋白质。通过转基因技术使一个特定转录因子在植物体内过量表达，就可通过该转录因子促使多个功能基因发挥作用，从而达到植物性状获得综合改良的效果。与过量表达个别功能基因相比，在植物体内过量表达一个转录因子是提高植物抗逆性更为有效的方法和途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高白桦抗逆性的转录因子及其编码的蛋白，通过转基因技术为将来培育和改良高抗逆性白桦品种奠定物质基础。

本发明提高白桦抗逆性的转录因子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明提高白桦抗逆性的转录因子所编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明提高白桦抗逆性的转录因子全长为1281bp，编码的蛋白分子由426个氨基酸组成(SEQ ID NO：2)，等电点(PI)为6.16，分子量(MW)为47.98KD，负电荷残基(Asp+Glu)为52，正电荷残基(Arg+Lys)为44，分子式为C₂₀₉₃H₃₂₂₆N₅₉₈O₆₆₁S₂₀，不稳定系数(II)为54.23，平均疏水性(GRAVY)为-0.688，脂肪系数(AI)为62.96。

本发明提高白桦抗逆性的转录因子被命名为BpWND1基因，实验表明本发明提高白桦抗逆性的转录因子BpWND1基因导入白桦后受干旱和盐胁迫而明显诱导表达，证明本发明BpWND1基因参与白桦的抗旱耐盐胁迫应答反应。

在非胁迫条件下本发明BpWND1基因的转基因白桦株系的生长状况与野生型白桦基本一致，说明该基因的大量表达不影响植物的生长；而在NaCl、ABA以及Mannitol的胁迫条件下，BpWND1过表达株系的白桦长势明显优于野生型白桦。

用本发明BpWND1基因构建植物过表达载体，然后通过农杆菌介导法转入野生型白桦中，发现在非胁迫条件下过表达BpWND1的转基因白桦的生长状况与野生型白桦基本一致，说明该基因的大量表达不影响植物的生长；而过表达BpWND1的转基因白桦受NaCl、ABA和Mannitol胁迫后白桦的长势优于对照组野生型白桦。在非生物胁迫下过表达BpWND1的转基因白桦株能够降低体内过氧化氢和活性氧的积累，细胞损伤程度较低，表现出较强的抗逆能力。

附图说明

图1是具体实施方式二中在非胁迫条件(Control)下和在NaCl、ABA、Mannitol的胁迫条件下阳性转基因白桦株系植株(OE3和OE8)与野生型白桦植株(WT)的生长状况图。

图2是具体实施方式二中DAB染色试验的染色结果图。

图3是具体实施方式二中NBT染色试验的染色结果图。

图4是具体实施方式二中Evans blue染色试验的染色结果图。

图5是具体实施方式二中DCFH-DA染色试验的染色结果图。

图6是具体实施方式二中PI染色试验的染色结果图。

图7是具体实施方式二中SOD活性测定试验的活性检测结果图。

图8是具体实施方式二中POD活性测定试验的活性检测结果图。

图9是具体实施方式二中脯氨酸(proline)含量测定试验的活性检测结果图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式提高白桦抗逆性的转录因子BpWND1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本实施方式提高白桦抗逆性的转录因子BpWND1基因所编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本实施方式BpWND1基因全长为1281bp，编码的蛋白分子由426个氨基酸组成(SEQID NO：2)，等电点(PI)为6.16，分子量(MW)为47.98KD，负电荷残基(Asp+Glu)为52，正电荷残基(Arg+Lys)为44，分子式为C₂₀₉₃H₃₂₂₆N₅₉₈O₆₆₁S₂₀，不稳定系数(II)为54.23，平均疏水性(GRAVY)为-0.688，脂肪系数(AI)为62.96。

具体实施方式二：本实施方式对提高白桦抗逆性的转录因子BpWND1基因进行试验：

一、在转录因子BpWND1基因上、下游分别引入酶切位点，设计合成带有酶切位点的BpWND1基因序列及引物；

二、对转录因子BpWND1基因进行PCR扩增，PCR反应程序为94℃预变性2min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸2min，循环30次；最后在72℃延伸7min；

三、收集到的DNA片段纯化后与经酶切的pROK2载体连接，再转化大肠杆菌Top10菌株；

四、PCR验证和测序鉴定正确的重组质粒(pROK2-BpWND1)用电导法转入根癌农杆菌EHA105菌株中，得到阳性重组菌；

五、步骤四获得的阳性重组菌采用根癌农杆菌介导法转化野生型白桦，并在含有卡那霉素(kan)的1/2MS培养基上进行筛选，壮苗后取2～3片叶子提取白桦DNA进行PCR检测，含有BpWND1基因的为阳性转基因白桦株系；

六、将步骤五获得的阳性转基因白桦株系和野生型白桦的组培苗转移到正常的1/2MS培养基，或含有80mmol/L NaCl的1/2MS固体培养基中，或含有100mmol/L Mannitol的1/2MS固体培养基中，或含有50μmol/L ABA的1/2MS固体培养基中，在人工气候室中培养20d，观察各植株的长势情况，结果如图1所示。

本实施方式步骤四中正确的重组质粒pROK2-BpWND1经PCR扩增可得到与BpWND1基因大小一致的条带(基因片段)，再经过测序，该片段与BpWND1基因的核苷酸序列相同。

本实施方式步骤五中壮苗后在苗高6～7cm时取2～3片叶子提取白桦DNA。

本实施方式步骤五获得16个阳性转基因白桦株系，本实施方式步骤六选用其中的两个阳性转基因白桦株系OE3和OE8的组培苗转移到培养基中继续培养。在非胁迫条件(Control)下阳性转基因白桦株系植株(OE3和OE8)的生长状况与野生型白桦植株(WT)基本保持一致；而在NaCl、ABA以及Mannitol的非生物胁迫条件下阳性转基因白桦株系植株(OE3和OE8)的白桦长势优于野生型白桦植株(WT)。实验结果如图1所示，实验表明BpWND1基因在白桦中可成功表达，不影响植物的生长，并使阳性转基因白桦的抗逆性大幅提升。

以培养4周的土培苗为材料，分别用水、浓度为200mmol/L的NaCl溶液、300mmol/L的甘露醇溶液和100μmol/L的脱落酸(ABA)溶液处理阳性转基因白桦株系植株(OE)和野生型白桦植株，在人工气候室中处理6h和12h后，取植株叶片分别进行DAB、NBT、Evans blue等染色，结果如图2～6所示。

1)DAB染色：

分别取各胁迫处理0、6、12h的阳性转基因白桦株系植株(OE)和野生型白桦植株(WT)叶片，置于离心管中，加入DAB染色液，室温染色过夜。染色结束后，用75％乙醇与5％甘油煮沸脱色。

2)NBT染色

分别取各胁迫处理0、6、12h的阳性转基因白桦株系植株(OE)和野生型白桦植株(WT)叶片，置于离心管中，加入NBT染色液，室温染色过夜。染色结束后，用75％乙醇+5％甘油沸水浴脱色。

3)Evans blue染色

分别取各胁迫处理0、6、12h的阳性转基因白桦株系植株(OE)和野生型白桦植株(WT)叶片，置于离心管中，加入Evans blue染色液，真空干燥15min，保持真空6h。染色结束后，用96％乙醇沸水浴脱色。

4)DCFH-DA染色：

分别撕取未胁迫处理和胁迫处理1h的阳性转基因白桦株系植株(OE3和OE8)和野生型白桦植株(WT)叶片的下表皮，放入诱导气孔开放液中2h，然后用10mmol/L的DCFH-DA染色液染色15min。染色结束后，用诱导气孔开放液冲洗下表皮三次，在激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

5)PI染色：

分别取未胁迫处理和胁迫处理12h的阳性转基因白桦株系植株(OE3和OE8)和野生型白桦植株(WT)的根尖，置于PI染色液中，染色30min。然后用去离子水冲洗根尖，在激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

细胞中H₂O₂释放出的氧离子能够氧化DAB，形成棕色沉淀，根据染色的深浅，能判断细胞中H₂O₂释放量的多少，细胞受损伤越严重，H₂O₂释放的越多。DAB染色结果如图2所示。在非胁迫生长条件(Control)下OE和WT植株叶片基本无颜色，且相互之间无明显差异，说明H₂O₂含量大致相同；在ABA、NaCl和Mannitol的非生物胁迫条件下OE和WT植株叶片上的颜色发生明显的变化。阳性转基因白桦株系植株OE叶片上的颜色比野生型白桦叶片上的颜色浅，表明OE植株叶片内的H₂O₂的含量较野生型白桦植株(WT)叶片内的H₂O₂含量少，说明阳性转基因白桦株系植株受胁迫之后的损伤程度低。NBT的染色结果如图3所示，与DAB染色结果相同，在非胁迫生长条件(Control)下OE和WT植株叶片基本无颜色，且相互之间无明显差异，说明H₂O₂含量大致相同；在ABA、NaCl和Mannitol的非生物胁迫条件下OE和WT植株叶片上的颜色发生明显的变化。阳性转基因白桦株系植株OE叶片上的颜色比野生型白桦叶片上的颜色浅，表明OE植株叶片内的H₂O₂的含量较野生型白桦植株(WT)叶片内的H₂O₂含量少，说明阳性转基因白桦株系植株受胁迫之后的损伤程度低。Evans blue染色结果如图4所示，阳性转基因白桦株系植株OE染色明显弱于野生型白桦植株WT，说明了阳性转基因白桦株叶片组织内细胞的死亡率比野生型低。实验结果证明BpWND1基因可在白桦植株体内起抗逆作用。

DCFH-DA能够自由穿过细胞膜进入细胞内，胞内的酯酶能将DCFH-DA水解生成DCFH，细胞内的活性氧可以将无荧光的DCFH氧化成有荧光的DCF，通过DCF荧光的强弱可以判断细胞内ROS(reactive oxygen species)的水平。利用DCFH-DA的染色原理，能够通过绿色荧光的多少鉴别转基因白桦细胞内ROS的含量。DCFH-DA染色结果如图5所示。从图5中可以看到，在非胁迫生长条件(Control)下OE3和OE8和WT植株叶片气孔保卫细胞上的绿色荧光均很弱，说明ROS含量很低；在NaCl、ABA和Mannitol的非生物胁迫条件下阳性转基因白桦株系植株(OE3和OE8)和WT植株叶片气孔保卫细胞上的绿色荧光虽均发生变化，但阳性转基因白桦株系植株(OE3和OE8)叶片气孔保卫细胞上的绿色荧光较WT弱，说明OE3和OE8植株叶片内ROS的含量比WT少，证明BpWND1基因的表达能增强植株的抗逆能力。实验结果说明BpWND1基因在白桦中能够正向调控植物的抗逆功能。

PI(Propidium Iodide)能进入膜不完整的损伤细胞内，与DNA结合后将细胞染成红色，利用PI染色原理，根据染色的深浅鉴别白桦细胞的损伤情况。PI染色结果如图6所示。在非胁迫条件(Control)下OE3和OE8和WT植株根尖上的红色荧光较弱，且相互之间无明显差异，说明细胞损伤情况基本一致；在NaCl、ABA和Mannitol的非生物胁迫条件下OE3和OE8和WT根尖的荧光强度有不同程度的加深。阳性转基因白桦株系植株(OE3和OE8)的根尖的红色荧光比WT的弱，说明OE3和OE8植株根尖的损伤程度较WT根尖的损伤程度低。实验结果表明BpWND1基因在白桦中能提高白桦植株的抗逆能力。

以两个月的土培苗为材料，分别用水和浓度为200mmol/L的NaCl溶液、100μmol/L的脱落酸(ABA)溶液和浓度为300mmol/L的甘露醇(Mannitol)溶液处理阳性转基因白桦株系植株(OE3和OE8)和野生型白桦植株(WT)，在人工气候室中培养7～10天，取叶片为材料进行SOD和POD活性及脯氨酸含量的测定。

1、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定：

1)先取1.5ml离心管称重，然后取白桦叶片，液氮研磨后称重，加入1.5ml浓度为1/15mol/L的磷酸缓冲液，4℃静置30min，11000r/min、4℃离心20min，上清即为待测样品酶液，每个样品设3个生物学重复；

2)取酶液500μL，加1.5ml SOD反应液，6级光照30℃培养箱内反应10min；

3)取出后立即用722S分光光度计测各样品560nm处的OD值，用去离子水替代酶液的反应体系作为对照值，并用去离子水替代SOD反应液的反应体系作为对照调零；

4)SOD活性计算：A_SOD＝(△A₅₆₀％×V)/(50％×W×T×v)

式中：△A＝(对照A值-测定A值)/对照A＝(A1-A2)/A1；

V为提取的酶液总体积(ml)；v为反应的酶液体积(ml)；T为反应时间(min)；W为植物材料粉末的净重(g)。

SOD可以催化超氧阴离子自由基的歧化反应，抵抗活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的损伤，从而提高植物的抗逆能力，SOD活性测定结果如图7所示。

在非胁迫条件(Control)下OE3、OE8和WT的SOD活性大致相同；在NaCl、ABA和Mannitol的非生物胁迫条件下OE3、OE8和WT的SOD活性发生了变化。阳性转基因白桦株系植株(OE3和OE8)的SOD活性高于WT，说明OE3和OE8植株的抗逆境胁迫能力比WT植株强。实验结果表明BpWND1基因在白桦中能够正向调控SOD活性。

2、过氧化物酶(POD)活性测定：

1)取叶片，液氮研样，称重；

2)加1.5ml浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲液，4℃反应30min，11000r/min、4℃离心20min，上清即为待测样品酶液，每个样品设3个生物学重复；

3)取酶液0.5ml加0.8％H₂O₂0.5ml和0.1mol/L磷酸缓冲液0.5ml以及0.1mol/L愈创木酚0.5ml；

4)30℃水浴反应10min；

5)用722S分光光度计测各样品470nm处的OD值，以去离子水替代酶液的反应体系为对照值，并以去离子水替代H₂O₂溶液的反应体系为对照调零；

6)POD活性计算：POD＝(N×△A)/(W×T)

式中：N为稀释倍数，△A＝(对照A值-测定A值)/对照A＝(A1-A2)/A1，W为材料重量(g)，T为反应时间(min)

在过氧化物酶(POD)催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物，过氧化物酶是植物体内降低氧自由基伤害的重要保护酶，和植物的抵御逆境胁迫能力紧密相关，POD活性测定结果如图8所示。

在非胁迫条件(Control)下OE3、OE8和WT的POD活性大致相同；在NaCl、ABA和Mannitol的非生物胁迫条件下OE3、OE8和WT的POD活性发生了变化。阳性转基因白桦株系植株(OE3和OE8)的POD活性高于WT，说明OE3和OE8植株的抵御逆境胁迫能力比WT强。实验结果表明BpWND1基因在白桦中能够通过调控植物体内的抗氧化酶活性来提高植物的抗逆能力。

3、脯氨酸(proline)含量测定：

1)制作标准曲线

①取7只具塞刻度试管按下表加入各试剂，编号为1-7号的试管中脯氨酸含量依次为0、2、4、8、12、16和20ug，将7支试管置于沸水中加热40min。

试管号	1	2	3	4	5	6	7
								标准液(ml)	0	0.2	0.4	0.8	1.2	1.6	2.0
水(ml)	2.0	1.6	1.2	0.8	0.4	0.2	0
								冰乙酸(ml)	2	2	2	2	2	2	2
显色液(ml)	3	3	3	3	3	3	3

②取出冷却后向各试管加入5ml甲苯充分振荡，静置，分层，吸取甲苯层，以1号管为对照测各样品520nm处的OD值。

③以光吸收值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，制作标准曲线。

2)样品测定

①脯氨酸提取：取白桦叶片，液氮研样，称重0.1～0.2g，置于大试管，加入2ml 3％磺基水杨酸溶液，管口加盖，沸水浴中浸提10min。

②取出试管，冷却至室温后，11000rpm离心5min。

③吸上清1ml，加1ml冰乙酸和1.5ml显色液，沸水中加热40min。

④取出冷却后加入2.5ml甲苯充分振荡，静置，分层，吸取甲苯层，以1号管为对照测各样品的OD₅₂₀值。

3)脯氨酸含量计算

从标准曲线中查出脯氨酸浓度，脯氨酸含量计算公式：

y＝(C×V1)/(V2×W)

式中：C为提取液中脯氨酸含量(μg)；V1为提取液总体积(ml)；V2为测定时所吸取的体积(ml)；W为样品重(g)；y为脯氨酸含量(μg/g)

在逆境胁迫条件下，植物体内通过游离脯氨酸(proline)的大量积累来提高自身的抗逆能力，脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，脯氨酸(proline)含量测定结果如图9所示。

在非胁迫条件(Control)下OE3、OE8和WT的脯氨酸含量大致相同；在NaCl、ABA和Mannitol的非生物胁迫条件下OE3、OE8和WT的脯氨酸含量发生了变化。阳性转基因白桦株系植株(OE3和OE8)的脯氨酸含量高于WT，说明OE3和OE8植株的抵御逆境胁迫能力比WT强。实验结果表明BpWND1基因在白桦中能够通过积累植物体内的脯氨酸含量来提高植物的抗逆能力。

以上试验结果表明BpWND1基因在白桦中具有明显的抗旱、耐盐能力，且不影响白桦的生长。盐和渗透刺激条件下BpWND1基因的转录水平与植物体内POD、SOD的活性和脯氨酸的含量呈正相关，通过提高逆境下植物体内的活性氧或其他过氧化物自由基的清除能力和脯氨酸的积累，进而提高转基因植物的抗旱耐盐能力。本发明BpWND1基因可用于白桦抗逆性品种的转基因培育。

Claims

1.一种提高白桦抗逆性的转录因子，其特征在于编码该转录因子的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

2.如权利要求1所述提高白桦抗逆性的转录因子，其特征在于该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。