CN102492029A - 棉花nac类转录因子nst亚家族及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明利用生物信息学和3′-race成功从开花后10天的棉花纤维中克隆得到三条全长基因，生物信息学比对及进化树分析得到的三个基因属于NAC类NST亚家族，分别命名为GhNST1、GhNST2和GhNST3，它们的氨基酸序列分别如Seq ID No.1～3所示。对棉纤维发育及各时期转录水平表达谱进行分析，发现基因GhNST3在棉花纤维次生壁合成期特异表达，推测该基因与细胞壁的合成有关，为进一步研究基因GhNST3在植物生长发育、激素调节和抵抗逆境等方面中的作用提供了可靠的理论依据。

Description

棉花NAC类转录因子NST亚家族及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及棉花NAC类转录因子NST亚家族及其应用。

背景技术

在植物基因表达调控中，转录因子的调控是一个严格控制的有序过程。NAC转录因子是近十年来新发现的具有多种生物功能的植物特异转录因子，1997年Aida等首先报道了NAC结构域，发现在矮牵牛NAM基因、拟南芥ATAFI/2和CUC2基因编码蛋白的N端包含一段保守的氨基酸序列，取三基因首字母命名为NAC。研究表明，NAC转录因子在植物的生长发育、器宫建成、激素调节和防御抵抗多种生物和非生物胁迫等方面发挥着重要作用。该家族转录因子的共同特点是其N端为保守的大约150个氨基酸的NAC结构域，C端为高度变异的转录调控区.它们在植物生长发育、激素调节和抵抗逆境等方面发挥着重要的作用。

棉花是我国重要的一种经济作物，在棉花纤维发育过程中，次生壁的沉积过程是决定棉花产量的关键因素。次生壁很大程度上决定了纤维的品质，在纤维发育中揭示转录因子在转录调控机制中的作用起着重要的作用。虽然在次生壁的合成过程中发现了一系列的NAC家族编码的基因和其它转录因子的表达高调，但是这些转录因子没有一个在纤维次生壁合成过程中起着主导作用。近几年，在拟南芥中新发现的NAC类转录因子NST亚家族(NAC SECONDARY WALLTHICKENING PROMOTING FACTOR)，其中包括三个成员，NST1(NAC SECONDARY WALL THICKENING PROMOTINGFACTOR1)、NST2和NST3/SND1(SECONDARY WALL-ASSOCIATEDNAC DOMAIN PROTEIN1)，该家族在拟南芥茎秆维管束间纤维和木质纤维中特异表达，同时，NST1和NST2在花粉壁的增厚过程中具有明显的冗余性，NST1和NST3在维管束细胞次生壁的增厚过程中也具有功能上的冗余性。抑制SND1基因的表达使纤维次生壁的厚度明显下降，如果同时抑制了NST1和SND1的表达则没有了次生壁的积累；在拟南芥中过表达SND1基因，导致正常细胞中次生壁的异常沉积，激活了次生壁增厚过程中特异表达的转录因子和次生壁合成过程中相关功能基因的高表达，由此认为该亚家族SND1/NST3是控制纤维次生壁合成的主要转录调控开关家族。然而，尚未发现棉花NAC类转录因子NST亚家族的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供棉花NAC类转录因子NST亚家族及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种棉花NAC类转录因子NST亚家族，其包括：i)GhNST1，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示；ii)GhNST2，其氨基酸序列如Seq ID No.2所示；以及iii)GhNST3，其氨基酸序列如Seq ID No.3所示；或者Seq ID No.1～3的序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，

例如，在GhNST1的非活性区段，将第15位的F替换为H，或是将第193位的K缺失，或是在372位添加R均不会影响蛋白的功能；在GhNST2的非活性区段，将第26位的E替换为D，或是将第195位的D缺失，或是在382位添加S均不会影响蛋白的功能；在GhNST3的非活性区段，将第20位的R替换为D，或是将第199位的K缺失，或是在365位添加S均不会影响蛋白的功能。

本发明还提供编码棉花NAC类转录因子GhNST3的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供含有编码棉花NAC类转录因子GhNST3的基因的载体以及含有该载体的宿主细胞。

本发明还提供编码棉花NAC类转录因子GhNST3的基因在调节植物生长发育中的应用。

本发明还提供编码棉花NAC类转录因子GhNST3的基因在提高植物抗逆性中的应用。

本发明进一步提供编码棉花NAC类转录因子GhNST3的基因在植物细胞壁次生壁合成中的应用。

前述的应用，所述的植物为拟南芥、棉花等。

NST(NAC Secondary Wall Thickening Promoting Factor)是NAC类转录因子亚家族，N端含有保守的NAM(No apical meristem)结构域，该亚家族的NST3/SND1基因被证明在启动植物细胞壁次生壁的沉积过程中起着重要的开关作用。本发明利用生物信息学方法，在NCBI数据库中，以拟南芥中NST亚家族三条序列NST1/At2g46770，NST2/At3g61910和NST3/SND1/AtlG32770为探针序列，在棉花纤维伸长期特异表达的EST数据库中进行tblastn，找到4条同源est，经进一步比对，发现四条序列在其N端均含有一段NAC类转录因子的保守序列NAM结构域，且N端是完整的，运用3′-race的方法成功从开花后10天的棉花纤维中克隆得到了三条全长基因，并分别命名为GhNST1、GhNST2和GhNST3。经过生物信息学分析，转录水平表达谱分析，及对棉花纤维伸长期特异表达的基因进行了功能研究分析。新克隆的三条基因在转录水平上，发现基因GhNST3在棉花纤维伸长期特异表达，据此结果本发明设计了三组实验来进一步验证其功能：第一，用酵母单杂交的方法验证了基因GhNST3的转录因子活性，同时证明该基因的下游调控元件是直接调控次生壁合成的MYB46基因；第二，通过瞬时转化技术基因枪法，在洋葱表皮细胞中进行了亚细胞定位发现基因GhNST3定位于细胞核中；第三，在野生型哥伦比亚拟南芥中过表达基因GhNST3，通过kan筛选及分子生物学鉴定得到了转基因植株，发现转基因植株整体非常羸弱，茎始终处于匍匐的状态，初步断定，GhNST3的过表达与植株的支持功能有很重要的关系。而细胞壁的功能最重要的一点是对植株的支持作用，因此推测该基因与细胞壁的合成之间存在着内在的联系，从而进一步探究棉花GhNST3的转录因子功能及与纤维发育相关功能。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明首次提出棉花NAC类转录因子NST亚家族的三个基因GhNST1、GhNST2和GhNST3，并发现在转录水平上，基因GhNST3在棉花纤维伸长期特异表达。

(二)本发明通过酵母单杂交验证了基因GhNST3的转录因子活性。

(三)在野生型拟南芥中过表达基因GhNST3，发现该基因的过表达与植株的支持功能有很重要的关系。

附图说明

图1为棉铃开花10天后总RNA提取结果及3’-race获得的片段结果，其中，A为棉铃开花10天后总RNA提取结果，B为3’-race结果，1：GhNST1，；2：GhNST2；3：GhNST3，M：DNA marker DL2000。

图2为本发明棉花GhNST亚家族转录因子与典型的NAC类家族成员的系统进化树分析结果。

图3为RT-PCR验证GhNST亚家族在棉花不同器官(根、茎、叶、花)和开花后不同时期棉花纤维的转录表达谱。

图4为基因枪转基因技术瞬时转化洋葱表皮细胞定位分析结果；A、B：洋葱表皮细胞中空载体pava120的瞬时转化；C、D：35S::GhNST3-GFP在洋葱表皮细胞中表达；其中，A、C是明场拍摄；B、D是在UV激发光下拍摄。

图5为酵母单杂交GhNST3转录活性的检测结果；A：酵母激活实验改造后的载体图；B、C、D为酵母单杂交载体构建图；E：激活实验结果。

图6为酵母单杂交转录因子与DNA结合活性的实验结果；其中1～4为pGAD424+pLaczi酵母单杂交体系中GhNST3实验结果，5～8为pGAD424+pHisi酵母单杂交体系中GhNST3实验结果；1.pLaczi-AtMyb46-p6-6+pGAD424-AtSND1，正对照，有蓝色反应；2.pLaczi-AtMyb46-p6-6+pGAD424-GhNST3，实验组，有蓝色反应；3.pLaczi-AtMyb46-p6-6+pGAD424，无显色反应；4.pLaczi-AtMyb46-p6-6，在含有X-gal的SD/-Leu-Ura的缺陷培养基上不生长；5.pHisi-AtMyb46-p6-6+pGAD424-AtSND1，正对照，有白色菌落长出；6.pHisi-AtMyb46-p6-6+pGAD424-GhNST3，实验组，有白色菌落长出；7.pHisi-AtMyb46-p6-6+pGAD424，生长状态很微弱；8.pHisi-AtMyb46-p6-6，在SD/-Leu-His的缺陷培养基上不生长。

图7为转基因拟南芥植株的筛选；其中，A：过表达35S::GUS空载体后0.5μg/ml Kan MS板筛选；B：过表达35S::GhNST3-GUS转基因拟南芥植株1μg/ml KAN板MS筛选；C：12周的野生型拟南芥植株；D：筛选出的拟南芥植株，依此35S::GhNST3-GUS转基因植株、35S::GUS转基因植株和野生型哥伦比亚拟南芥植株；E：转基因拟南芥植株的PCR鉴定结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另外说明，所用原料均为市售商品。

实施例棉花NAC类转录因子NST亚家族的三个基因GhNST1、GhNST2和GhNST3的获得及其功能

1材料和方法

1.1植物材料、菌株、质粒载体

1.1.1植物材料

河南安阳陆地棉(Gossypium hirsutum)珂字304种植于北京师范大学生命科学学院生物园，常规田间管理(4月份种植，8-9月份取材)。棉铃在开花当天挂牌，作为开花0天。取不同发育时期0d、3d、5d、10d、15d和20d的棉铃，迅速将纤维和胚珠进行剥离置于液氮中。取幼嫩的叶，花置于液氮速冻，根、茎取自温室培养的15d幼苗。-80℃保存备用。

哥伦比亚野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)种子经无菌处理后，播于MS培养基上。4℃下暗处理3-4天，置于光照条件下使其发芽，待长出5-6片莲座叶时，将之移栽入装有蛭石与营养土混合(2∶1)物的盆中。放入温室中培养。光照条件为：16h光照/8h黑暗，光照强度为30-40μmo1·m^-2·s^-1。培养温度：分别维持在23℃(光照条件下)和21℃(黑暗条件下)。

1.1.2菌株和载体

大肠杆菌菌株E.coli DH5α、农杆菌GV3101、酵母菌株EGY48和YM4271均为市售商品。

pMD18-T Simple购自TaKaRa公司，pG222载体、pYF503载体、pYF504载体、pHisi载体、pLacZi载体，pAVA120载体、pGAD424载体购自嘉美生物技术有限公司。

1.2棉花纤维总RNA的提取

使用TIANGEN多酚多糖RNA提取裂解液和Invitrogen公司植物RNA提取试剂盒提取开花后不同天数的棉花纤维总RNA，裂解方法参照TIANGEN多酚多糖RNA提取裂解液产品使用说明书，纯化方法参照Invitrogen公司产品使用手册完成。

1.33′-RACE

按照TaKaRa的RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0说明书进行，将开花后10天的棉花纤维总RNA反转录成cDNA。按试剂盒中给出的下游引物(M13 primer M4是3’RACE引物，可与反转录产物中带的OligodTadaptor结合完成cDNA 3’末端的扩增)及预克隆基因的特异序列为上游引物(序列见表1)进行PCR扩增获得目的基因。产物回收连接pMD18-T Simple载体，转化大肠杆菌DH5α，送华大基因测序。

1.4生物信息学方法

通过InterPro Scan&ScanProsite分析确定保守结构域，使用ProtParam分析蛋白质分子量、等电点、氨基酸组成及可能的修饰位点，用PSORT分析该蛋白的亚细胞定位，用TMHMM和TMpred分析该蛋白的跨膜区域，在swissmodel中预测了该基因家族的三维结构，通过culstalX8.0对从棉花中新克隆的基因与拟南芥中的NAC类相关基因进行了比对，并用MEGA3.1进行了生物信息树分析。

1.5RT-PCR

分别提取棉花开花后0d、3d、5d、10d、15d、20d及根、茎、叶、花不同组织的总RNA，反转录合成cDNA，PCR反应，引物设计及反应条件见表1，同时设棉花ubiquitin7作为内参对照。

表1引物及反应条件

1.6酵母单杂交激活活性分析

采用Ye等在2004年改进的酵母单杂交体系，方法同Ye R，YaoQH，Xu ZH(2004)Development of an efficient method for the isolationof factors involved in gene transcription during rice embryo development.Plant J.Apr；38(2)：348-357冲的描述。

1.7酵母单杂交结合活性分析

报告载体构建：合成的正反链单链DNA在65℃退火5min后缓慢冷却至常温，形成含有两个重复的AtMYB48p6-6的短DNA片段，两端带有EcoR I、Xba I粘端，克隆至pHISi(或pLacZi)报告载体的EcoRI/Xba I位点。所得报告质粒pHISi-AtMYB48-p6-6，pLacZi-AtMYB48p6-6经测序确认无误后备用(质粒构建如图5所示)。

下游响应元件整合到酵母基因组DNA(1)pHISi-AtMYB46-p6-6以XhoI单酶切线性化后转化YM4271酵母，培养于SD/-his选择平板；(2)placzi-AtMYB46-p6-6以NcoI单酶切线性化后转化YM4271酵母，培养于SD/-ura选择平板。

载体构建：合成的正反链单链DNA在65℃退火5min后缓慢冷却至常温，形成含有两个重复的AtSND1和GhNST3的短DNA片段，两片段两端均带有EcoR I、SalI粘端，克隆至pGAD424载体的EcoR I/XbaI位点。所得质粒AtSND1-pGAD424，GhNST3-pGAD424经测序确认无误后备用

转化及显色：将构建成功的表达载体pGAD424转化已融合有pHISi-AtMYB46-p6-6和pLaczi-AtMYB46-p6-6的酵母感受态YM4271，将构建于pHISi-AtMYB46-p6-6载体内的质粒涂布在SD/-Leu-His的选择平板上，观察是否有菌落的生成，然后把含pHisi-AtMYB46-p6-6和AtSND1-pGAD424、pHisi-AtMYB46-p6-6和GhNST3-pGAD424、pHisi-AtMYB46-p6-6和pGAD424空载体、pHisi-AtMYB46-p6-6的菌斑划线于SD/-Leu-His的选择平板，观察表达情况。将构建于pLaczi-AtMYB46-p6-6载体内的质粒涂布在SD/-Leu-Ura平板上，长出的阳性菌落划线于添加了1×碱性buffer、40mg/L X-Gal的SD/-Leu-Ura显色平板上，然后把含有pLaczi-AtMYB46-p6-6和AtSND1-pGAD424、Laczi-AtMYB46-p6-6和GhNST3-pGAD424、Laczi-AtMYB46-p6-6和pGAD424空载体、Laczi-AtMYB46-p6-6的菌斑划线于SD/-Leu-Ura的显色平板上显色反应。。

1.8基因枪法转化洋葱表皮

采用Deng等在1998年改造的含35S启动子、瞬时表达元件和GFP的载体pava120作为瞬时表达载体，轰击洋葱表皮细胞。在暗环境22℃培养16h后，Co-focal照相。(见Von Arnim and Deng，Cloning vectorsfor the expression of green fluorescent protein fusion proteins intransgenic plants，Gene 221(1998)35-43)

基因枪法转化洋葱表皮细胞的全过程：

1.8.1仪器和药品

(1)氦气压力表，真空表，氦气瓶总阀，氦气调节阀，可裂膜固定帽；

(2)载体膜，可裂膜，金粉(常用1μm)

(3)无水乙醇，70％乙醇(7ml无水乙醇+3ml水)现用现配，ddH₂O，50％甘油(现用现配)，2.5M CaCl₂(2.78g无水CaCl₂+10mlH₂O)，70％异丙醇(7ml异丙醇+3mlH₂O)，质粒浓度＞＝1μg/ul，0.1M亚精胺(3.15μL亚精胺+200μL H₂O)。

1.8.2金粉制备

(1)称取15mg钨粉(1μm)，放入2mL圆底离心管中；

(2)向离心管中加入1mL 70％的乙醇，涡旋震荡5min，静置15min，离心2s(不能超时)；(3)弃上清，向管中加入1mL水，震荡1min，静置1min，离心2s(不能超时)；

(4)弃上清，向得到的金粉中加入250μL50％的甘油。

1.8.3DNA的包埋

(1)按1∶10∶10∶0.4的比例依次加入DNA，金粉，CaCl₂(aq)和亚精胺(0.1M)；

(2)涡旋震荡3min，静置1min，弃上清；

(3)沉淀中加入140μL70％乙醇，轻轻拍散，离心，弃上清；

(4)沉淀中加入140μL无水乙醇，轻轻拍散，离心，弃上清；

(5)加入28μL无水乙醇，轻拍，涡旋震荡。

1.8.4基因枪的操作

1开机

(1)旋开氦气瓶总阀门(逆时针)；

(2)顺时针旋压力调节阀(黄)至目的压强；

(3)打开枪的电源。

2准备样品

(1)将载体膜固定到载体膜支架上；

(2)放入铺有无水氯化钙的小平皿中；

(3)涡旋震荡制好的微载体，至充分悬起，将金粉悬滴至载体膜中央，计时10min；

(4)放好终止屏，稍稍用70％异丙醇洗可裂膜，并安装好；

(5)10min后，放好载体膜支架，放好样品，准备轰击。

3轰击

(1)关闭枪体门，将中间按钮扳至“VAC”挡抽真空；

(2)至真空表示数为28-29，扳至“HOLD”维持真空：

(3)按住“Fire”键，氦气压力表示数上升，至可裂膜破裂压强时，可裂膜破裂，释放按钮；

(4)将中间按钮扳至“VENT”挡，至真空表示数归0，放好样品，准备下一次轰击。

4关机

(1)弃去用过的可裂膜，载体膜和终止屏，装好组件；

(2)关闭枪体门，关闭氦气瓶总阀门(顺时针)；

(3)按键扳至“VAC”挡，抽真空，“HOLD”，按住“Fire”，至压力调节阀表示数均为0时释放，扳至“VENT”挡，至真空度为0，关闭电源；

(4)逆时针旋松压力调节阀(黄)，关闭总电源。

1.8.5实验材料的培养

轰击结束后，加入10ml MS液体培养基在培养皿中，置于黑暗16℃温箱中培养16h左右。

1.9蘸花法转化野生型拟南芥植株

用市售的pBI121质粒构建pBI121-ghnst3重组质粒，转化农杆菌GV3101感受态细胞，以空载体pBI121为阴性对照，菌落PCR鉴定后提质粒进行双酶切鉴定正确后，通过蘸花法农杆菌转化野生型拟南芥植株，获得T1代种子，经过Kan筛选，得到了转基因植株，两周后移植为土培。提取转基因植株茎的DNA，检测PCR转化结果，在根据转化载体上，GhNST3连接到GUS基因序列的前方，因而在设计引物的时候，从GhNST3基因上选取上游序列，从GUS基因上选取下游序列，验证转化结果。为了验证仅含GUS空载的转化效果，在GUS基因上设计了一对引物：GUS-正向引物5′-GTGGCAGTGAAGGGCGAACAGT-3′和GUS-反向引物5′-TGTGAGCGTCGCAGAACATTA-3′，验证空载的转化效果。

2实验结果

2.13′-RACE三条棉花中NST基因序列

图1所示为棉铃开花10天后总RNA提取结果及3’-race获得的片段结果。

克隆得到的棉花纤维NST亚家族基因的基本信息及其编码蛋白的生物信息学分析分别如表2和表3所示，GhNST1、GhNST2和GhNST3的氨基酸序列分别如Seq ID No.1～3所示，基因GhNST3的核苷酸序列如Seq ID No.4所示。

表2克隆得到的棉花纤维NST亚家族基本信息

表3：棉花纤维NST亚家族的生物信息学分析

棉花GhNST亚家族转录因子与典型的NAC类家族成员的系统进化树分析如图2所示。

2.2RT-PCR扩增结果

使用三条序列的特异引物ghnst1：5′-ATGGGCAGTCTCAGGTCCCTCCTGG-3′，ghnst2：5′-CAGAAGACATGAATCTATCAATAAATGG-3′，ghnst3：5′-ATGTCAGAAGATATGAATCTATCC-3′，分别从棉花的根、茎、叶、花、开花后的10天的胚珠及开花后纤维发育各时期的cDNA为模板进行PCR扩增。电泳分析结果表明，只有GhNST3在纤维发育的特异时期表达，在其他时期不表达(图3)。

2.3GhNST3转录因子活性的鉴定

2.3.1GhNST3亚细胞定位

利用基因枪法转化洋葱表皮细胞对基因GhNST3进行亚细胞定位，以空载体作为对照，将轰击后的洋葱块，在暗环境22℃培养16h后，Co-focal照相，结果如图4所示，确定GhNST3基因定位在核内，与生物信息学推测的该基因转录因子定位一致。

2.3.2GhNST3转录激活功能的鉴定

将表达GAL4结合结构域与GhNST3的融合蛋白的质粒转入酵母中，能够使GAL4顺式序列调控下的报告基因LacZ得到表达，形成蓝色菌落。证明GhNST3蛋白在酵母中具有转录激活活性(图5)。

2.3.3GhNST3转录结合功能的鉴定

线性化的phisi-AtMYB46-p6和placzi-AtMyb46-p6质粒转化入YM4271酵母后，在含有3-AT存在下不能生长的克隆为报告株，命名为YMMYB46P6-HIS。线性化后的placzi-AtMyb46-p6转化入YM4271酵母，培养于SD/-Ura缺陷平板，挑取能在其上生长的克隆作为报告株，命名为YMMYB46P6-LacZ。将表达GAL4激活结构域与GhNST3的融合蛋白的质粒转入酵母中，以拟南芥中与之同源性最高的SND1的融合蛋白也与表达GAL4激活结构域结合做为阳性对照。如果该转录因子具有结合DNA的活性，则其读码框ORF与Gal4AD的融合蛋白可以与pHis中的DNA序列结合，Gal4AD可以激活pHisi下游的His基因表达，菌落可以在缺省His和Leu的培养基上生长。为了进一步确定结果的可靠性，使用pLaczi代替pHisi构建报告载体，具有结合活性的转录因子阳性菌落在含有X-gal的SD/-Leu-Ura的显色板上显示蓝色。成功检测了GhNST3的转录因子结合活性(图6)。

2.4拟南芥中过表达GhNST3基因体内功能验证

用Kan板筛选蘸花后获得的转基因种子，将筛选的绿色植株转为土培，分别提取三种植株茎部组织的DNA，分子生物学鉴定转化植株，从分子生物学的角度验证了所筛选植株的正确性。10周左右植株长势，野生型植株长势良好茎干直挺，转空载体pBI121的植株长势比野生型相比略微矮小，但是茎干直挺，转35S::GhNST3-GUS的植株不仅植株整体弱小而且茎部弯曲不能直立(图7)。

3讨论

本发明首次从棉花中克隆得到了NAC类GhNST亚家族的三条基因，在结构上三条基因具有典型的NAM结构域，同源性非常高。转录水平表达谱发现，GhNST3是棉花纤维伸长期次生壁合成过程中特异表达的基因，生物信息学比对及进化树分析该基因与拟南芥中的SND1/NST3基因同源性最高。关于该基因亚家族的研究主要集中在最近几年，拟南芥茎中特异表达的AtSND1基因的研究为该亚家族的研究拉开了序幕，Zhong等发现该基因是启动次生壁合成的主要开关因子，同时发现AtSND1基因的直接下游基因是AtMYB46转录因子，AtMYB46直接作用于细胞中纤维素、木聚糖、木质素的合成途径，它们又是次生壁的主要组成成分，过表达AtMYB46基因导致细胞中次生壁成分的非特异性增厚和异位表达及一些相关次生壁合成的转录因子比如MYB85、KANT7基因表达的上调。在拟南芥次生壁合成的信号通路中AtSND1类转录因子在转录调控网中起到了网络枢纽的作用。

棉花中该亚家族的克隆及棉花纤维特异时期表达基因GhNST3的转录活性、基因定位及转基因的研究为下一步的研究提供了基础。我们的研究揭示了以下几个方面的内容，首先，发现了一个在棉花纤维特异时期表达的基因GhNST3；其次，证明GhNST3该基因亚细胞定位于核中；三是，验证了GhNST3基因具有转录激活活性及与下游DNA结合的活性；最后，在拟南芥中过表达该基因发现对植株茎的影响，整个植株茎部处于匍匐羸弱状态。拟南芥SND1基因在拟南芥中的过表达诱导了次生壁合成基因的表达，导致不同细胞中次生壁的非特异性沉积。但是SND1基因在纤维细胞中抑制次生壁的沉积，揭示出在纤维细胞中SND1的表达量在次生壁沉积中的作用中是受到严格控制的。编码NAC转录因子的NAP基因在细胞伸长机制中的表达是下调的，过表达该基因则抑制了细胞的伸长。另一种引起过表达植株茎部羸弱的原因是GhNST3的过表达造成内源的拟南芥SND1基因在次生壁合成中产生了共抑制作用。在拟南芥中，SND1的过表达诱导了叶中和花器官以及茎表皮中次生壁的合成，然而在其他组织的薄壁细胞中几乎没有次生壁的异位表达，表明在薄壁细胞中分化出了不同的复合体被SND1诱导激活。在不能被SND1诱导的细胞中可能缺乏所需的功能基因，也可能存在SND1的抑制因子或快速降解SND1的作用机制。然而，SND1过表达引起叶、茎和花器官中次生壁的非特异性沉积表明SND1只是在特定的细胞中诱导次生壁的合成。过表达NST1和NST2也只是在特定的细胞中诱导次生壁的合成。由于SND1和NST1、NST2是同一个家族同源性很高，可能在不同的细胞中行使同样的功能。VND6和VND7分别调控次生木质部和原生木质部的分化。

本发明在拟南芥中过表达GhNST3，经切茎后间苯三酚染色发现茎部次生壁结构有管状加厚。Zhong等认为SND1基因过表达引起的次生壁异位沉积不同于纤维壁的一致性加厚，反而，增厚型类似管状细胞的模型。SND1的过表达引起次生壁增厚型是由细胞的类型决定的。Baskin等发现控制次生壁沉积调控是由周质微管决定的，所以SND1在拟南芥茎中不是控制次生壁的沉积模式，而是SND1引起的次生壁的异位表达可能是通过不同细胞类型中的周质微管组织形成的。本文发现与拟南芥中SND1最为同源的GhNST3可以作用于次生壁合成相关的转录因子比如MYB46，该转录因子又可依次激活次生壁合成中不同基因的表达。基因数据库中比对发现，GhNST3在拟南芥、白杨和云杉等植物中都存在许多同源基因，这表明在植物中该类基因可能在不同的植物中具有普遍的机制。棉花、白杨、云杉等植物中存在丰富的纤维细胞需要大量的次生壁的合成。棉纤维是棉纺织业的主要原料，GhNST3次生壁转录开关的发现对于生物技术的研究具有显著影响。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.棉花NAC类转录因子NST亚家族，其特征在于，包括：

i)GhNST1，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；

ii)GhNST2，其氨基酸序列如Seq ID No.2所示或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；以及

iii)GhNST3，其氨基酸序列如Seq ID No.3所示或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

2.一种棉花NAC类转录因子GhNST3，其氨基酸序列如Seq ID No.3所示或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

3.编码权利要求2所述棉花NAC类转录因子GhNST3的基因。

4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID No.4所示。

5.含有权利要求3或4所述基因的载体。

6.含有权利要求5所述载体的宿主细胞。

7.权利要求3或4所述的基因在调节植物生长发育中的应用。

8.权利要求3或4所述的基因在提高植物抗逆性中的应用。

9.权利要求3或4所述的基因在植物细胞壁次生壁合成中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其中所述的植物为拟南芥、棉花。

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