CN114350675A - 一种调控亚麻次生壁合成的LuNAC基因及其应用 - Google Patents
一种调控亚麻次生壁合成的LuNAC基因及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114350675A CN114350675A CN202210024000.XA CN202210024000A CN114350675A CN 114350675 A CN114350675 A CN 114350675A CN 202210024000 A CN202210024000 A CN 202210024000A CN 114350675 A CN114350675 A CN 114350675A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lunac
- flax
- gene
- synthesis
- gene silencing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 52
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 52
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 43
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 title claims abstract description 31
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 241000208202 Linaceae Species 0.000 title claims abstract 9
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 26
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 claims abstract description 23
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 claims abstract description 20
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 19
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 claims abstract description 16
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims abstract description 13
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 3
- 230000028604 virus induced gene silencing Effects 0.000 claims description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 27
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 claims description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 abstract description 10
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 abstract description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 25
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- YVLPJIGOMTXXLP-UHFFFAOYSA-N 15-cis-phytoene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CC=CC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YVLPJIGOMTXXLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000002087 whitening effect Effects 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 3
- 235000004426 flaxseed Nutrition 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- YVLPJIGOMTXXLP-UUKUAVTLSA-N 15,15'-cis-Phytoene Natural products C(=C\C=C/C=C(\CC/C=C(\CC/C=C(\CC/C=C(\C)/C)/C)/C)/C)(\CC/C=C(\CC/C=C(\CC/C=C(\C)/C)/C)/C)/C YVLPJIGOMTXXLP-UUKUAVTLSA-N 0.000 description 2
- YVLPJIGOMTXXLP-BAHRDPFUSA-N 15Z-phytoene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC(=CC=C/C=C(C)/CCC=C(/C)CCC=C(/C)CCC=C(C)C)C)C)C)C YVLPJIGOMTXXLP-BAHRDPFUSA-N 0.000 description 2
- 240000008564 Boehmeria nivea Species 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 244000166124 Eucalyptus globulus Species 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108010040093 cellulose synthase Proteins 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011765 phytoene Nutrition 0.000 description 2
- 230000006574 secondary cell wall biogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 2
- PUAQLLVFLMYYJJ-UHFFFAOYSA-N 2-aminopropiophenone Chemical compound CC(N)C(=O)C1=CC=CC=C1 PUAQLLVFLMYYJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100515455 Arabidopsis thaliana MYB20 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100025357 Arabidopsis thaliana MYB52 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100025359 Arabidopsis thaliana MYB54 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100132367 Arabidopsis thaliana MYB80 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100239715 Arabidopsis thaliana NAC010 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100239718 Arabidopsis thaliana NAC012 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100403800 Arabidopsis thaliana NAC030 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100132483 Arabidopsis thaliana NAC073 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100459814 Arabidopsis thaliana NAC101 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000662893 Arabidopsis thaliana Telomere repeat-binding factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000662890 Arabidopsis thaliana Telomere repeat-binding factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000662891 Arabidopsis thaliana Telomere repeat-binding factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000662896 Arabidopsis thaliana Telomere repeat-binding factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000662897 Arabidopsis thaliana Telomere repeat-binding factor 5 Proteins 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 102100040999 Catechol O-methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108020002739 Catechol O-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102100031497 Heparan sulfate N-sulfotransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100031496 Heparan sulfate N-sulfotransferase 2 Human genes 0.000 description 1
- 101000588589 Homo sapiens Heparan sulfate N-sulfotransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000588595 Homo sapiens Heparan sulfate N-sulfotransferase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000617805 Homo sapiens Staphylococcal nuclease domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 240000007472 Leucaena leucocephala Species 0.000 description 1
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 1
- -1 MYB85 Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241001493421 Robinia <trematode> Species 0.000 description 1
- 101100333566 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ENV10 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100190359 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PHO88 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000046101 Sophora japonica Species 0.000 description 1
- 235000010586 Sophora japonica Nutrition 0.000 description 1
- 102100021996 Staphylococcal nuclease domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101150088517 TCTA gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002522 Wood fibre Polymers 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000010413 gardening Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种调控亚麻次生壁合成的LuNAC基因及其应用。本发明采用病毒诱导的基因沉默技术，通过农杆菌介导法获得LuNAC基因沉默亚麻株系SE。LuNAC转录因子通过调控下游LuMyb42、LuMyb46、LuMyb69、LuMyb103、LuNST1、LuNST3、LuNAC12及LuNAC73纤维细胞次生壁合成的二级开关转录因子，及纤维素、半纤维素及木质素合成关键酶基因LuCesA4、LuCesA8B、LuCslA1、LuCslG3.2、LuCCoAOMT、LuCOMT的表达，进而实现对细胞壁组分纤维素、半纤维素及木质素合成的调控。本发明为改良亚麻纤维品质的分子育种提供了重要基因资源。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种调控亚麻次生壁合成的LuNAC基因及其应用。
背景技术
次生细胞壁含有丰富的纤维素、半纤维素及木质素，是植物生物量的主要来源之一。目前关于参与次生壁合成的关键酶基因已经研究的比较清楚，但是鉴于次生壁的生物合成是一个非常复杂的代谢调控网络，单一的改变一两个酶的活性并不能完全决定代谢途径中终产物的积累，因此，学者们逐渐将重点转向次生壁合成的转录调控研究。植物次生壁的合成是一个复杂的多级网络调控过程，研究表明，NAC类转录因子是次生细胞壁生物合成中关键的调控因子。目前已发现的与次生壁形成相关的NAC转录因子主要包括VND1-7(VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN), SND1-5 (SECONDARY WALL-ASSOCIATED NAC DOMAIN)，NST1-3(NAC SECONDARY WALL THICKENING PROMOTING FACTOR)。SND1(又称NST3)及其同源蛋白NST1、NST2、VND6、VND7是调控纤维细胞次生壁合成的一级主开关，它们直接调控参与次生壁加厚的下游转录因子，如SND2、SND3、MYB103、MYB85、MYB52、MYB54、MYB69、MYB42、MYB43、MYB20和KNAT7等。SND1在茎维管束间纤维细胞和木质纤维细胞中特异表达，能够双向调控次生壁形成。阐明次生壁生物合成的调控网络，对于纤维作物如亚麻(Linum usitatissimum L.)、苎麻(Boehmeria nivea)、棉花（Gossypium spp．）及经济树种如桉树（Eucalyptus spp.）和洋槐(Robinia pseudoacacia)的品质性状改良具有十分重要的意义。
前期通过差异表达谱分析在亚麻中发现一个LuNAC基因 (lus10033239)，该基因在亚麻根部组织中表达量最高，茎部组织中次之，叶片中几乎没有表达。该基因在纤维发育关键时期快速生长期的表达量最高，为苗期表达量的2.5倍，推测该基因可能在亚麻纤维发育中发挥重要调控作用。本研究进一步采用病毒诱导的基因沉默（virus-induced genesilencing，VIGS）技术，通过农杆菌介导法获得LuNAC基因沉默亚麻株系SE，以TRV1:TRV2为对照植株（CK）。与CK相比，SE中LuNAC基因的表达量显著降低（p<0.05），为对照中的66.1%。同时，在SE中参与次生细胞壁合成的关键转录因子LuMyb42、LuMyb46、LuMyb69、LuMyb103、LuNST1、LuNST3、LuNAC12及LuNAC73基因的表达均显著下调（p<0.05）。LuCesA4、LuCesA8、LuCslG3.2等参与细胞壁纤维素、半纤维素合成相关基因的表达也显著下调（p<0.05），而半纤维素合成相关基因LuCslA1及木质素合成相关基因LuCCoAOMT、LuCOMT的表达量显著上调（p<0.05）。在SE中，纤维素、半纤维素及木质素合成均受到抑制，与对照相比纤维素含量降低了4.1%（p<0.05)，半纤维素含量降低了4.2%（p<0.05)，木质素含量降低了5.8%（p<0.05)。研究结果表明LuNAC基因对次生壁合成中纤维素、半纤维素及木质素的合成都有调控作用，该基因的发现为改良亚麻纤维品质的分子育种提供了重要基因资源。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种调控亚麻次生壁合成的LuNAC基因及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种抑调控麻次生壁合成的LuNAC基因病毒诱导的基因沉默靶序列，所述靶序列为LuNAC基因CDS全长序列中如SEQ ID NO.1所示的序列，长度为435bp。
一种调控亚麻次生壁合成的LuNAC基因沉默体系，所述调控亚麻次生壁合成的LuNAC基因沉默体系的构建方法包括以下步骤：
（1）病毒诱导的基因沉默VIGS重组载体构建：以LuNAC基因CDS全长序列中如SEQID NO.1所示的435bp序列为VIGS靶序列构建VIGS重组载体；
（2）农杆菌注射接种；VIGS重组载体转化至农杆菌GV3101中，然后将携带有VIGS重组载体的农杆菌GV3101注射侵染亚麻幼苗子叶；
（3）LuNAC基因沉默株系的基因表达分析；
（4）LuNAC基因沉默株系的细胞壁化学组分分析。
上述调控亚麻次生壁合成的LuNAC基因沉默体系的构建方法中，所述步骤（1）病毒诱导的基因沉默VIGS重组载体构建，具体如下：在LuNAC基因CDS全长序列中选择如SEQ IDNO.1所示的435bp序列为病毒诱导的基因沉默VIGS靶序列，利用上下游引物LuVIGSF、LuVIGSR克隆靶序列；克隆的靶序列经纯化、酶切后连接到pTRV2载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；经PCR鉴定为阳性的克隆送去测序，测序成功的菌株提取质粒，即获得VIGS重组载体；所述上游引物LuVIGSF的序列为：5’-TCTAGACCGGATTCGAAATCTCGA-3’；下游引物LuVIGSR的序列为：5’-GGATCCACGGTCGAGGGCAATCCA-3’。
一种携带有上述SEQ ID NO.1所示靶序列的载体；所述载体包括遗传转化所形成的亚麻转基因株系。
上述SEQ ID NO.1所示靶序列在改良亚麻纤维品质分子育种中的应用。
上述调控亚麻次生壁合成的LuNAC基因沉默体系在抑制亚麻次生壁合成中纤维素、半纤维素及木质素合成中的应用。
上述调控亚麻次生壁合成的LuNAC基因沉默体系在亚麻分子育种中的应用。
本发明的有益之处在于：本发明提供了一种调控亚麻次生壁合成的LuNAC基因及其应用。本发明采用病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技术，通过农杆菌介导法获得LuNAC基因沉默亚麻株系SE，以TRV1:TRV2为对照植株（CK）。与CK相比，SE中LuNAC基因的表达量显著降低（p<0.05），为对照中的66.1%。同时，在SE中参与次生细胞壁合成的关键转录因子LuMyb42、LuMyb46、LuMyb69、LuMyb103、LuNST1、LuNST3、LuNAC12及LuNAC73基因的表达均显著下调（p<0.05）。LuCesA4、LuCesA8、LuCslG3.2等参与细胞壁纤维素、半纤维素合成相关基因的表达也显著下调（p<0.05），而半纤维素合成相关基因LuCslA1及木质素合成相关基因LuCCoAOMT、LuCOMT的表达量显著上调（p<0.05）。在SE中，纤维素、半纤维素及木质素合成均受到抑制，与对照相比纤维素含量降低了4.1%（p<0.05)，半纤维素含量降低了4.2%（p<0.05)，木质素含量降低了5.8%（p<0.05)。结果表明LuNAC基因对次生壁合成中纤维素、半纤维素及木质素的合成都有调控作用，该基因的发现为改良亚麻纤维品质的分子育种提供了重要基因资源。
附图说明：
图 1 LuNAC基因克隆电泳图。M-DNA DL2000；1-cDNA扩增产物。
图2 亚麻侵染后的表型图。A中1-3: TRV1:TRV2-PDS 、TRV1:TRV2、TRV1:TRV2-LuNAC的叶和茎；B：TRV1:TRV2-PDS漂白表型；C中1-4：野生型、TRV1:TRV2-PDS、TRV1:TRV2、TRV1:TRV2-LuNAC植株。
图3 基因表达分析图。*表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01）。A：LuNAC基因的表达量；B：参与次生壁合成的Myb类转录因子的表达量；C：参与次生壁合成的NAC类转录因子的表达量；D：参与次生壁纤维素合酶基因、半纤维素合酶、木质素合成基因的表达量。
图4 亚麻茎部化学组分分析。*表示差异显著（P<0.05）。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
实施例1
1. 材料与方法
1.1 试验材料
本研究选用亚麻品种“大紫花”，种植于黑龙江省农科院国家现代农业示范区，常规田间管理。在快速生长期取茎中部三分之一，样品采集后，立即在液氮中冷冻，并在-80℃保存，用于提取RNA。VIGS沉默体系所用病毒载体pTRV1和pTRV2均由东北农业大学园艺园林学院王傲雪老师惠赠，pTRV2-PDS为本实验室保存。
1.2 总RNA提取与全长cDNA扩增
CTAB法提取总RNA，去除DNA后，于20μL反应体系中反转录合成第一链cDNA。从Phytozome公共数据库中下载亚麻LuNAC（Lus10033239）基因序列。根据LuNAC基因CDS全长序列使用软件Primer Premier 5.0设计特异引物LuNACF、LuNACR（见表1）采用RT-PCR的方法克隆全长cDNA序列。扩增体系25μL，PCR反应程序：98℃预变性5min；然后进行30个循环，每个循环为98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸2min 30s；最后68℃延伸5min。将PCR产物切胶回收，连接到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，送去上海生工生物工程技术服务有限公司测序分析。
以亚麻品种“大紫花”的cDNA为模板扩增LuNAC基因CDS全长序列，扩增产物经1wt%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，可见一特异性条带。将PCR扩增产物纯化后克隆到pMD18-T 载体，测序分析，经测序该基因CDS全长为1263bp，共编码420个氨基酸。
1.3 VIGS重组载体构建
在LuNAC基因CDS全长序列中选择435bp序列为VIGS靶片段（见SEQ ID NO.1），利用Primer Premier 5.0设计上下游引物LuVIGSF、LuVIGSR（见表1）克隆靶序列，上下游引物中分别加入XbaI和BamHI酶切位点。将双酶切PCR纯化产物连接到pTRV2载体上，构建pTRV2-LuNAC载体。以八氢番茄红素脱氢酶LuPDS (Lus10021967) 为报告基因，设计上下游引物LuPDSF、LuPDSR（见表1）克隆靶序列（见SEQ ID NO.2）437bp，构建pTRV2-LuPDS载体。将构建的载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。经PCR鉴定为阳性的克隆送去测序，测序成功的菌株提取质粒，利用电击法将质粒转化农杆菌GV3101中，加入30vol%灭菌甘油储存于-80℃冰箱备用。
1.4 农杆菌注射接种
将“大紫花”亚麻种子均匀种于营养土中，放置于光照培养箱中，23℃，16h光照，18℃，8h黑暗培养。正常培养10天左右，幼苗长出2片子叶，且子叶展开时进行VIGS试验。VIGS试验方法参照 Chantreau M, Chabbert B, Billiard S, Hawkins S, Neutelings G.Functional analyses of cellulose synthase genes in flax (Linum usitatissimum)by virus-induced gene silencing[J]. Plant Biotechnol J, 2015,13(9):1312-1324所述方法。侵染前提前2天准备菌液。将保存在-80℃农杆菌菌株pTRV1(检测引物pTRV1F/pTRV1R)、pTRV2(检测引物pTRV2F/pTRV2R)、pTRV2-PDS、pTRV2-LuNAC菌液PCR检测（引物见表1），检测载体序列正确的菌株在YEB固定培养基（10mg·L-1 Kan+ 50mg·L-1 Rif）28℃划线培养2d，然后挑单菌落加1ml YEB液体培养基28℃ 200rpm过夜培养，将菌液加入25ml无抗生素YEB液体培养基中28℃ 200rpm扩大培养16h，将菌液收集于50ml离心管中，7000rpm离心5min，弃上清液，用新鲜YEB液体培养基（10mM MgCl2+10mM MES+150uM AS）重悬菌体使OD值达到0.6~1.2之间。菌液室温静置3h或者28℃ 200rpm振荡培养1h；然后将TRV1分别与TRV2、TRV2-PDS、TRV2-LuNAC等体积混合；选择子叶背面用1ml注射器针头扎三个针眼，注意不要扎透子叶，然后用去掉针头的注射器向叶片背面的针眼里推菌液，注意不要过于用力，菌液不易过多，否则苗后期会死亡。侵染后暗培养24h，然后进行正常光照培养（光照16h，黑暗8h）。
表1 引物序列
1.5 LuNAC基因沉默株系的基因表达分析
选择长势一致的植株取材，TRV1:TRV2、TRV1:TRV2-LuNAC沉默的植株分别取3株，做为3次生物学重复。取材部位为第2片与第4片真叶之间的茎段。将植物样本放入研钵中，加入液氮，迅速研磨成粉末。采用CTAB法提取植物总RNA，使用DNase I去除基因组DNA污染。通过1.0wt%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。转录组测序分析由华大基因科技有限公司完成。
与野生型相比，注射农杆菌的植株均表现出子叶叶片卷曲，真叶叶片数增多的表型。八氢番茄红素脱氢酶 (phytoene desaturae，PDS) 是类胡萝卜素合成途径中的一个关键酶，通常在VIGS 实验中作为报告基因。以TRV1:TRV2-PDS侵染植株作为指示植株，植株子叶以上的真叶由下至上逐渐出现白化现象，白化最先出现在叶脉处，随着植株的生长，当侵染14天后，白化现象逐步扩展到整个叶片，白化叶片对应茎部也出现白化现象（见图2A、2B所示），结果表明病毒载体成功侵入植株体内。TRV1:TRV2与TRV1:TRV2-LuNAC沉默植株表型无明显差异（见图3C所示）。
利用高通量测序技术检测TRV1:TRV2对照植株（CK）与TRV1:TRV2- LuNAC沉默植株（SE）的基因表达。与CK相比，在SE植株中成功实现了LuNAC基因的表达抑制。SE中LuNAC基因的表达为对照的66.1%（见图3A），差异达到显著水平（p<0.05）。同时，参与次生壁合成的Myb、NAC类转录因子的表达也受到不同程度的抑制。在SE中，参与次生壁合成的Myb类转录因子LuMyb42（Lus10032226、Lus10038913）、LuMyb46（Lus10029520）、LuMyb69（Lus10031326、Lus10031900）、LuMyb103（Lus10032298）（见图3B）及NAC类转录因子LuNST1（Lus10002687、Lus10017340）、LuNST3（Lus10008271）、LuNAC12（Lus10001664）、LuNAC73（Lus10039873）（见图3C）的表达量都显著下调（p<0.05）。同时，次生壁纤维素合酶LuCesA4（Lus10008225）、LuCesA8（Lus10029245），半纤维素合成基因LuCslG3.2（Lus10023057）显著下调表达（p<0.05），半纤维素合成基因LuCslA1（Lus10009387）、木质素合成基因CCoAOMT（Lus10016630）、COMT（Lus10005133）基因显著上调表达（p<0.05）（见图3D）。
1.6 LuNAC基因沉默株系的细胞壁化学组分分析
选择长势一致的植株取材。TRV1:TRV2、TRV1:TRV2-PDS、TRV1:TRV2-LuNAC沉默的植株分别取30株，每10株混合做为1次生物学重复，每个样品3次生物学重复。取材部位为第2片与第4片真叶之间的茎段。采用ELISA含量检测试剂盒(齐一，上海)检测样品中的纤维素、半纤维素及木质素含量。
采用ELISA法检测样品中的纤维素、半纤维素及木质素含量。在SE植株中，纤维素、半纤维素及木质素的合成均受到抑制（见图4），在SE中纤维素含量为286.84 mg·g-1（DW），与对照相比降低了4.1%（p<0.05)；半纤维素含量为213.3 mg·g-1（DW），与对照相比降低了4.2%（p<0.05)，木质素含量为139.4 mg·g-1（DW），与对照相比降低了5.8%（p<0.05)。结果表明LuNAC基因对纤维素、半纤维素及木质素的合成都有调控作用。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 黑龙江省农业科学院经济作物研究所
黑龙江省科学院自然与生态研究所
<120> 一种调控亚麻次生壁合成的LuNAC基因及其应用
<130> 12
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 435
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.1
<400> 1
ccggattcga aatctcgaat catcggtaat agcgacgact gggtaatgga ccaaatactt 60
atgtacatgg acacaaagag cagcaacggc ggccgcatag agatccagga gagtttcatg 120
catcttccta agctggtaac tgatcatcag caacaacaag gtggtactag tacgatgaat 180
acgagtagta aggggatggt gacagctgct gcgacgacag agagtaacaa cattaataat 240
aaggatgaat ttaatattaa tattagtaat gataataatg ggagttatta ttacaataat 300
gaagcttcct ccaacaaccg ggcaagtgga tttgacgtga cagctgctgc tgctgcgtcg 360
ggtgacaacc gtagtatgat gatgacgacg tcgacggagg accatgtgat taatgactgg 420
attgccctcg accgt 435
<210> 2
<211> 437
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.2
<400> 2
tcgagtgact actgaggtgt tcattgccat gtctaaagca ctaaacttca ttaatccgga 60
agaactatca atgcagtgta tactgatagc cttgaacaga tttcttcagg agaagcatgg 120
ttctaagatg gcatttttag acggtaaccc cccagaaaga ctatgcaagc ctatggctga 180
tcatattgag tcattgagtg gtgaagtccg tcttaattca cgaataaaga aaattgatct 240
caacaatgat ggaacagtaa agagcttttc acttaccaat ggaaatgtta ttgaagcaga 300
tgcgtatgtg tttgccactc cagttgatat cctgaagctt cttatgcctg aaaactggaa 360
ggagattcca tacttcaaga aactggagaa attagttggt gttcctgtca ttaacgttca 420
catatggttt gaccgga 437
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> LuNACF
<400> 3
atggcagggg atcatgtgaa tcta 24
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> LuNACR
<400> 4
tcaaaccgac aagtggcata gtg 23
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> LuVIGSF
<400> 5
tctagaccgg attcgaaatc tcga 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> LuVIGSR
<400> 6
ggatccacgg tcgagggcaa tcca 24
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> pTRV1F
<400> 7
ttacaggtta tttgggctag 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> pTRV1R
<400> 8
ccgggttcaa ttccttatc 19
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> pTRV2F
<400> 9
atttgttttt atgttcaggc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> pTRV2R
<400> 10
atgtcaatct cgtaggttta 20
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> LuPDSF
<400> 11
tcgagtgact actgaggtgt tc 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> LuPDSR
<400> 12
tccggtcaaa ccatatgtga ac 22
Claims (8)
1.一种调控麻次生壁合成的LuNAC基因病毒诱导的基因沉默靶序列，其特征在于：所述靶序列为LuNAC基因CDS全长序列中如SEQ ID NO.1所示的序列，长度为435bp。
2.一种调控亚麻次生壁合成的LuNAC基因沉默体系，其特征在于：所述调控亚麻次生壁合成的LuNAC基因沉默体系的构建方法包括以下步骤：
（1）病毒诱导的基因沉默VIGS重组载体构建：以LuNAC基因CDS全长序列中如SEQ IDNO.1所示的435bp序列为VIGS靶序列构建VIGS重组载体；
（2）农杆菌注射接种；VIGS重组载体转化至农杆菌GV3101中，然后将携带有VIGS重组载体的农杆菌GV3101注射侵染亚麻幼苗子叶；
（3）LuNAC基因沉默株系的基因表达分析；
（4）LuNAC基因沉默株系的细胞壁化学组分分析。
3.根据权利要求2所述一种调控亚麻次生壁合成的LuNAC基因沉默体系，其特征在于：所述步骤（1）病毒诱导的基因沉默VIGS重组载体构建，具体如下：
在LuNAC基因CDS全长序列中选择如SEQ ID NO.1所示的435bp序列为病毒诱导的基因沉默VIGS靶序列，利用上下游引物LuVIGSF、LuVIGSR克隆靶序列；克隆的靶序列经纯化、酶切后连接到pTRV2载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；经PCR鉴定为阳性的克隆送去测序，测序成功的菌株提取质粒，即获得VIGS重组载体；
所述上游引物LuVIGSF的序列为：5’-TCTAGACCGGATTCGAAATCTCGA-3’；下游引物LuVIGSR的序列为：5’-GGATCCACGGTCGAGGGCAATCCA-3’。
4.一种携带权利要求1所述靶序列的载体。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于：所述载体包括遗传转化所形成的亚麻转基因株系。
6.权利要求1所述靶序列在改良亚麻纤维品质分子育种中的应用。
7.权利要求2所述调控亚麻次生壁合成的LuNAC基因沉默体系在抑制亚麻次生壁合成中纤维素、半纤维素及木质素合成中的应用。
8.权利要求2所述调控亚麻次生壁合成的LuNAC基因沉默体系在亚麻分子育种中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210024000.XA CN114350675B (zh) | 2022-01-11 | 2022-01-11 | 一种调控亚麻次生壁合成的LuNAC基因及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210024000.XA CN114350675B (zh) | 2022-01-11 | 2022-01-11 | 一种调控亚麻次生壁合成的LuNAC基因及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114350675A true CN114350675A (zh) | 2022-04-15 |
| CN114350675B CN114350675B (zh) | 2024-01-26 |
Family
ID=81109827
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210024000.XA Active CN114350675B (zh) | 2022-01-11 | 2022-01-11 | 一种调控亚麻次生壁合成的LuNAC基因及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114350675B (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1761751A (zh) * | 2003-01-23 | 2006-04-19 | 得克萨斯科技大学 | 在次生壁沉积期间优先在次生有壁细胞中表达的来自棉花的编码几丁质酶的dna分子和相应的启动子 |
| CN102399792A (zh) * | 2011-11-23 | 2012-04-04 | 华中师范大学 | 棉纤维细胞次生壁发育相关的GhNAC1基因克隆鉴定 |
| CN102492029A (zh) * | 2011-12-02 | 2012-06-13 | 北京师范大学 | 棉花nac类转录因子nst亚家族及其应用 |
| CN110029185A (zh) * | 2019-04-11 | 2019-07-19 | 广西壮族自治区亚热带作物研究所（广西亚热带农产品加工研究所） | 一种在转录组测序水平上进行剑麻叶纤维发育的研究方法 |
| WO2019157173A1 (en) * | 2018-02-09 | 2019-08-15 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Improved plant fiber quality |
| CN111088237A (zh) * | 2020-01-22 | 2020-05-01 | 福建农林大学 | 一种红麻HcPDS基因VIGS沉默体系 |
| CN115838739A (zh) * | 2022-12-27 | 2023-03-24 | 沈阳农业大学 | Nac17基因在改良山新杨性状中的应用 |
-
2022
- 2022-01-11 CN CN202210024000.XA patent/CN114350675B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1761751A (zh) * | 2003-01-23 | 2006-04-19 | 得克萨斯科技大学 | 在次生壁沉积期间优先在次生有壁细胞中表达的来自棉花的编码几丁质酶的dna分子和相应的启动子 |
| CN102399792A (zh) * | 2011-11-23 | 2012-04-04 | 华中师范大学 | 棉纤维细胞次生壁发育相关的GhNAC1基因克隆鉴定 |
| CN102492029A (zh) * | 2011-12-02 | 2012-06-13 | 北京师范大学 | 棉花nac类转录因子nst亚家族及其应用 |
| WO2019157173A1 (en) * | 2018-02-09 | 2019-08-15 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Improved plant fiber quality |
| CN110029185A (zh) * | 2019-04-11 | 2019-07-19 | 广西壮族自治区亚热带作物研究所（广西亚热带农产品加工研究所） | 一种在转录组测序水平上进行剑麻叶纤维发育的研究方法 |
| CN111088237A (zh) * | 2020-01-22 | 2020-05-01 | 福建农林大学 | 一种红麻HcPDS基因VIGS沉默体系 |
| CN115838739A (zh) * | 2022-12-27 | 2023-03-24 | 沈阳农业大学 | Nac17基因在改良山新杨性状中的应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| "Lus10033239 [FLAX]", 《FIBEXDB》, pages 1 - 4 * |
| "Lus10033239.g", 《CIS-BIP》, pages 1 - 3 * |
| PING HU等: "BpNAC012 Positively Regulates Abiotic Stress Responses and Secondary Wall Biosynthesis", 《PLANT PHYSIOLOGY》, vol. 179, pages 701 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114350675B (zh) | 2024-01-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110923251B (zh) | 烟草多酚氧化酶NtPPO4及其应用 | |
| CN113604490B (zh) | 猕猴桃溃疡病感病基因AcBXL1及其应用 | |
| CN102002101B (zh) | 与植物根系发育相关的蛋白ZmNR1及其编码基因 | |
| CN110358776B (zh) | 一种水稻纹枯病菌致病相关基因及其应用 | |
| CN114606245B (zh) | 茶树CsVAAT3基因及其应用 | |
| CN104357456A (zh) | 葡萄特异抗白粉病基因VpR8H-1cDNA序列及其应用 | |
| CN110229818A (zh) | 蜡梅CpSNAC1基因启动子及其应用 | |
| WO2021232551A1 (zh) | 一种高效人工根际联合固氮体系 | |
| CN108795944B (zh) | 棉花长链非编码RNA-lnc973及其在植物耐盐性中的应用 | |
| CN114634941B (zh) | 陆地棉GhPP2Cs基因及其在植物矮化中的应用 | |
| CN115772212A (zh) | 紫花苜蓿叶绿体MsSAP22基因及在提高植物抗旱性中的应用 | |
| CN113652447B (zh) | 基于vigs的高效桃叶片基因沉默方法 | |
| CN114480447A (zh) | 红麻硫氧还蛋白类似蛋白基因HcTrx及其重组载体在VIGS沉默体系中的应用 | |
| CN114350675B (zh) | 一种调控亚麻次生壁合成的LuNAC基因及其应用 | |
| CN114350676B (zh) | 一种调控亚麻纤维素合成的LuMyb基因及其应用 | |
| CN117431256B (zh) | 一个小麦黄花叶病抗病基因TaRx-2D及其编码的蛋白和应用 | |
| CN114591971B (zh) | 一种葡萄抗旱VvCCD7基因及其氨基酸序列和应用 | |
| CN113025621B (zh) | Cipk14基因在提高木豆抗旱中的应用 | |
| CN111875687B (zh) | 芝麻蛋白SiBRB在调控植物根系发育中的应用 | |
| CN110819640B (zh) | 烟草NtNRP1基因其应用 | |
| CN110129338B (zh) | 玉米转录因子ZmEREB160基因及其应用 | |
| CN110760522B (zh) | Ak209基因及编码蛋白与抗逆增产的应用 | |
| CN116479037A (zh) | 一种芒草vigs沉默体系及其应用 | |
| CN116218903A (zh) | 棉花光信号调控因子GhSPA1及其编码基因在棉花中的应用 | |
| CN117025627A (zh) | 烟草氯离子通道蛋白NtCLC13及其编码基因和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |