CN115838739A

CN115838739A - Nac17基因在改良山新杨性状中的应用

Info

Publication number: CN115838739A
Application number: CN202211683905.4A
Authority: CN
Inventors: 国会艳; 温盛瑄; 姜莹; 及晓宇; 王玉成
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2022-12-27
Filing date: 2022-12-27
Publication date: 2023-03-24

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及NAC17基因在改良山新杨性状中的应用。所述NAC17基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述性状包括耐盐性状和木材品质，所述木材品质包括木质化程度，本发明研究结果证实，所述NAC17基因正向调控山新杨耐盐性状和木材品质，这一结果对利用关键基因进行林木材质改良和抗逆新品种创制及改善生态环境均具有重要意义。

Description

NAC17基因在改良山新杨性状中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及NAC17基因在改良山新杨性状中的应用。

背景技术

当前，土壤盐渍化已经成为一个全球性的问题。据估计，全球的盐渍土每年以100万～150万hm²的速度增长。世界上的盐渍土广泛分布于100多个国家，其面积约为9.55亿hm²，占全球陆地面积的10％。盐渍化土壤因含有较高的盐分，不仅影响植物体内的水分含量，而且细胞中过量积累的Na⁺、Cl^-会对植物形成离子胁迫，导致细胞质膜脂质和蛋白组分改变，造成离子不平衡和高渗胁迫，影响植物的正常生长和发育，从而制约林业的产出和发展。因此，培育耐盐且材质优良的林木新品种是林业生产中亟待解决的关键问题，其对生态环境的修复、森林功能的提升以及生态安全建设都起着重要的支撑作用。

植物为了适应各种环境，体内会产生一系列的生理应答反应，由多基因参与，形成一个复杂的基因调控网络，以减轻或消除不良环境对它造成的伤害，转录因子在其中起着重要的调控作用。转录因子通过与特异顺式作用元件结合实现对下游基因的转录调控，能够直接激活或抑制下游基因的表达以及表达的时间和丰度等，进而产生各种生理生化变化，从而实现植物对逆境的响应。因此，在植物抵御逆境的基因调控网络中，转录因子是调控胁迫响应基因表达的分子开关，相比功能基因，转录因子可以调控逆境中多个相关基因的表达，被认为是利用基因工程改良植物抗逆性的优良候选基因。

近年来，有很多学者对植物逆境胁迫响应相关的转录因子进行了研究，发现它们能调控植物的抗逆能力，比如Dof、bHLH、MYB、NAC、AP2/ERF以及WRKY等转录因子。其中，NAC转录因子在植物抗逆调控中起到重要的作用。例如，大豆GmNAC085基因的过表达可以显著提高转基因植株的耐盐能力，并且转基因植物具有更好的抵御盐分诱导的氧化应激的防御系统、更高的抗氧化酶活性和更有效的离子调节能力。Hong等获得了3个ONAC022过表达的转基因水稻株系，盐胁迫后，ONAC022过表达水稻的根和芽中的Na⁺积累量较少，水稻的耐盐性增强，表明ONAC022可以通过调控Na⁺含量提高水稻的耐盐性。另外，一些研究表明，NAC转录因子能够影响植物的次生生长，从而影响植物的材质材性，例如，棉花的次生壁相关NAC结构域蛋白1(SND1s)和NAC次生细胞壁增厚因子1(NST1)，将二者进行基因沉默，导致棉花茎的木质部和韧皮部发育缺陷，表明这两个NAC基因能够促进棉花次生细胞壁的发育。白杨的NST基因被编辑后，发生突变，导致植物的木纤维和韧皮部纤维以及木质部射线薄壁组织细胞的发育受到严重抑制，说明该基因是次生细胞壁形成的关键调节因子。这些研究显示，NAC转录因子在植物抗逆和次生细胞壁形成中起到重要的调控作用。

山新杨(Populus davidiana×P.bolleana)为杨柳科、杨属的木本植物，该品种以采自嫩江县高峰林场山杨为母本与来源于乌鲁木齐新疆杨为父本进行杂交组合形成的杂交种。山新杨树干通直，树姿秀丽整洁美观，生长速度快，不飞絮，作为绿化或防护林树种进行广泛应用。但由于近年来，逆境胁迫成为限制树木人工造林和树木生长的重要因素，亟需培育抗逆能力强且材质优良的林木良种，提高本地区的造林成活率。因此，发掘具有调控山新杨抗逆性的优良基因，研究其生物学功能、解析其与抗逆性状及次生细胞壁形成相关的分子机制，从而找到提高植物抗逆优良性状及材质材性的方法，是迫切需要解决的问题。

发明内容

基于以上技术问题，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了NAC17基因在改良山新杨性状中的应用，所述NAC17基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述性状包括耐盐性状和木材品质，所述木材品质包括木质化程度。

进一步的，所述NAC17基因正向调控山新杨耐盐性状和木材品质。

更进一步的，通过过表达NAC17基因，提高山新杨耐盐性和木材品质。

更进一步的，所述过表达NAC17基因是通过将NAC17基因转入山新杨，从而提高山新杨的耐盐能力和木材品质。

更进一步的，构建含有所述NAC17基因的过表达载体并制备工程菌，利用农杆菌介导法稳定遗传转化至山新杨。

基于同一个发明构思，本发明还提供了所述NAC17基因或其表达产物在定向选择或鉴定优良性状山新杨中的应用，所述优良性状表现为高耐盐性和高木质化程度。

进一步的，所述应用包括：鉴定测试山新杨中NAC17基因或其表达产物的水平，若是该测试山新杨的NAC17基因或其表达产物水平显著高于该类山新杨的平均值，并且NAC17基因过表达转基因山新杨的耐盐能力及木材品质提高，则为优良性状山新杨。

进一步的，所述NAC17基因表达产物为NAC17蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

我们首次发现NAC17基因能够提高山新杨的耐盐能力并能改良木材品质。本发明的实施将加强研究林木育种目标性状的分子基础，并对利用关键基因进行林木材质改良和抗逆新品种创制及改善生态环境均具有重要意义。

以往研究是利用功能基因来提高植物的抗逆性或材性，对植物的遗传品质改良效果并不明显。在发明中，获得了山新杨的NAC转录因子，转录因子是调控基因表达的分子开关，相比功能基因，转录因子可以调控多个相关基因的表达，起到一个将调控信号级联放大的作用，因此被认为是利用基因工程改良植物遗传品质的优良候选基因。我们通过实时荧光定量PCR技术，表明NAC17转录因子能够受盐胁迫和赤霉素诱导表达，并且遗传转化研究表明该基因不仅可以提高山新杨的耐盐能力，还能改良木材品质，本发明通过基因工程手段，仅利用1个基因就显著提高了杨树的耐盐性能及材质材性，起到了事半功倍的作用。

附图说明

图1为过表达载体构建示意图。

图2为NAC17基因过表达载体大肠杆菌菌液PCR检测，M：DL2000 DNA Marker(从上到下依次为2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp)；1-3：pROKⅡ-NAC17；4：空白对照。

图3为NAC17基因过表达载体农杆菌菌液PCR检测，M：DL2000 DNA Marker(从上到下依次为2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp)；1：空白对照；2-4：pROKⅡ-NAC17

图4为NAC17基因过表达山新杨抗性苗的获得，a：愈伤诱导；b：芽的分化；c，d：生根培养。

图5为NAC17基因过表达转基因植株的鉴定，M：DL2000 DNAMarker(从上到下依次为2kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp)；1：空白对照；2-4：抗性苗的DNA；5：pROKⅡ-NAC17大肠杆菌质粒DNA；6：野生型山新杨DNA。

图6为NAC17转基因山新杨在盐胁迫下Evans blue染色结果。

图7为NAC17转基因山新杨在盐胁迫下DAB染色结果。

图8为NAC17转基因山新杨在盐胁迫下NBT染色结果。

图9为NAC17转基因山新杨在盐胁迫下超氧化物歧化酶(SOD)活性测定。

图10为NAC17转基因山新杨在盐胁迫下过氧化物酶(POD)活性测定。

图11为NAC17转基因山新杨在盐胁迫下总蛋白浓度的测定。

图12为NAC17转基因山新杨在盐胁迫下H₂O₂含量的测定。

图13为NAC17转基因山新杨在盐胁迫下相对电导率的测定。

图14为间苯三酚染色下山新杨茎部切片观察，Co：皮层；xy：木质部；pi：髓；箭头为植物木质部的厚度；物镜：×10；比例尺：10μm

图15为荧光增白剂染色下山新杨茎部切片观察，Co：皮层；xy：木质部；pi：髓；箭头为植物木质部的厚度；物镜：×10；比例尺：10μm。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：构建过表达NAC17基因山新杨株系

1.山新杨NAC17基因的克隆

提取野生型山新杨的总RNA，设计引物进行PCR扩增，胶回收获得目的片段，将其连入T载体后进行测序，然后获得完整的编码区(CDS)的NAC17基因序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.山新杨NAC17基因的过表达载体构建

(1)山新杨NAC17基因的扩增

根据NAC17基因的CDS序列，设计基因特异性引物，将SmaⅠ酶切位点引入NAC17基因的两端，PCR扩增所需引物为pROKⅡ-NAC17-F和pROKⅡ-NAC17-R。以山新杨的cDNA为模板，利用PCR技术扩增NAC17基因的全长，反应体系，引物序列，反应程序如下：

表1反应程序

表2引物序列

表3反应体系

试剂	使用量/μL
		dNTP Mix(2.5mM each)	1.6
10×Ex Taq Buffer(20mM)	2
		pROKII-NAC17-F(10μM)	0.5
pROKIl-NAC17-R(10μM)	0.5
		Ex Taq酶(5U/uL)	0.3
模板(<0.5ug/uL)	1
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 20

(2)山新杨NAC17基因的切胶回收

PCR反应结束后，利用琼脂糖凝胶电泳检测目的条带的位置，然后通过纯化回收试剂盒进行目的基因产物的回收(具体实验步骤见说明书)。将回收后的基因产物进行琼脂糖凝胶电泳检测及浓度的测量，保存于-20℃冰箱备用。

(3)pROKII质粒的提取

利用质粒提取试剂盒提取pROKII质粒(具体实验步骤见说明书)。将提取的质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测及浓度的测量，保存于-20℃冰箱。

(4)pROKII质粒的酶切

利用SmaⅠ限制性核酸内切酶酶切pROKII质粒，反应体系如表4所示，反应程序为：25℃，4h。

表4酶切体系

酶切结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测(点样时切前与切后的体积比1：2)，酶切成功后，使用纯化回收试剂盒将切后的载体进行纯化回收，保存于-20℃冰箱备用。

(5)基因产物与切后pROKII载体的连接

利用同源融合的方法，将基因产物与酶切后的pROKII载体进行连接，反应体系如表5所示，反应程序为：37℃，15min；50℃，15min。

表5连接体系

(6)大肠杆菌热激转化

通过热激转化的方法，将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞Top10中，步骤如下：

①取5μL连接液于50μL大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min，每10min轻轻拍打混匀2-3次；

②于42℃水浴锅中水浴1min30s，后立即冰浴2min；

③加400μL LB液体培养基(不含抗生素)，37℃，220rpm震荡培养1h；

④取200μL菌液涂布于LB固体培养基平板(含50mg/L Kan)，37℃过夜培养。

(7)菌液PCR检测

挑取平板上的单菌落于LB液体培养基(含50mg/L Kan)中，37℃，220rpm震荡培养3～4h。然后以菌液为模板，使用载体引物pROKⅡ-F及pROKⅡ-R进行PCR检测(载体引物分别位于SmaⅠ酶切位点前后共447bp；载体构建示意图如图1所示，反应体系和程序如下：

表6菌液PCR检测程序

表7菌液PCR检测体系

试剂	使用量/μL
		2×Taq Master Mix	10
pROKIL-F(10μM)	1
		pROKIl-R(10μM)	1
模板	1
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 20

将回收后的目的基因与酶切后的pROKⅡ载体进行同源融合及热激转化，挑取平板上的单菌落，用载体引物进行菌液PCR检测，结果如图2所示：从图中可以看出，目的条带在1000bp和1500bp之间，其中基因长度为588bp，空载长度为447bp，将条带位置正确的菌液送于生物公司测序，测序结果正确，表明NAC17基因过表达载体构建成功。

3.山新杨NAC17基因工程菌的制备

利用质粒提取试剂盒，提取构建好的NAC17过表达的质粒。通过电击转化法将3个质粒分别转入EHA105农杆菌感受态细胞中，实验步骤如下：

1)用无水乙醇将电击杯洗净，于超净工作台的紫外下冰浴30min；

2)取2μL质粒加入50μL农杆菌感受态细胞中，混匀后移至电击杯中；

3)用1700V电压电击；

4)在电击杯中加入400μL的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后移至新的1.5mL离心管中，28℃，220rpm震荡培养1h；

5)取200μL菌液涂布于LB固体培养基(含50mg/L Kan)，28℃培养2d。

挑取平板上的单菌落于LB液体培养基(含50mg/L Kan)中，28℃，220rpm震荡培养直至浑浊。然后以菌液为模板，使用载体引物进行PCR检测，结果如图3所示，发现目的条带位置在1000bp和1500bp之间，其中基因长度为588bp，空载长度为447bp，表明pROKⅡ-NAC17工程菌制备成功。电泳检测条带位置正确后，将菌种保存于-80℃冰箱。

4.山新杨的稳定遗传转化

(1)农杆菌介导法转化山新杨

①工程菌的活化：通过三区划线的方法，将NAC17基因过表达和编辑载体的工程菌于LB固体培养基(含50mg/L Kan)中活化，28℃培养2d；

②挑取单菌落于50mL LB液体培养基(含50mg/L Kan)中，28℃，220rpm震荡培养，直至OD600＝0.7；

③将菌液移至50mL离心管中，5000rpm离心10min；

④弃上清后加入等体积的1/2MS液体培养基(含150μM AS)重悬菌体，28℃，180rpm震荡培养40min；

⑤将侵染液倒入无菌培养皿中，将山新杨的叶片在侵染液中剪出伤口，然后在侵染液中浸泡5min；

⑥将切好的叶片放于无菌滤纸上吸干菌液，放于分化培养基(含150μM AS)中，25℃暗培养2～3d。

(2)山新杨抗性苗的筛选

①除菌：暗培养结束后，将山新杨叶片移至分化培养基(含30mg/L Kan，300mg/LCef)，培养于人工气候室；

②继代培养：每隔1个星期更换一次培养基(分化培养基+30mg/L Kan，300mg/LCef)，直至长出不定芽；移至抽茎培养基(含40mg/L Kan，500mg/LCef)中培养2个星期；然后将单棵苗切下，移入生根培养基(含50mg/L Kan)中培养1个月，进行后期转基因株系的鉴定，获得的NAC17基因过表达山新杨抗性苗如图4所示。

(3)转基因山新杨株系的鉴定

①DNA的提取：通过植物DNA提取试剂盒的方法提取过表达转基因植株的DNA(具体实验步骤见说明书)，DNA提取完成进行琼脂糖凝胶电泳检测及浓度的测量，保存于-20℃冰箱。

②PCR鉴定：以提取的转基因植株DNA为模板，利用pROKⅡ-F和pROKⅡ-R为引物。PCR结束后，进行PCR鉴定，结果如图5所示，从图中可以看出，有3个目的条带的位置接近于1000bp，与阳性对照的位置一致，说明获得了3个过表达转基因株系。

实施例2：山新杨NAC17基因的耐盐能力分析

首先对20日苗龄的实施例1获得的过表达转基因株系NAC17-OE1、OE2、野生型组培苗进行12小时的150mM的Nacl胁迫(以水处理作为对照)，然后取植株叶片用于Evans blue、DAB、NBT的组织化学染色，其余材料用液氮速冻研磨，进行生理指标的检测。

(1)组织化学染色

①Evans blue染色：

分别取未胁迫处理和胁迫处理12h的实验组及对照组山新杨叶片，置于离心管中，加入Evans blue染色液，抽真空半小时，保持真空状态染色过夜。染色结束后，用75％乙醇与5％甘油煮沸脱色。图6为Evans blue染色，Evans blue染色液可以进入死细胞，并将其染成蓝色，根据染色的深浅，能判断细胞中死细胞的多少，细胞受损伤越严重，死细胞越多。在非胁迫生长条件下(control)，NAC17过表达转基因植株以及对照组植株叶片颜色均较浅，且相互之间无明显差异；在NaCl胁迫条件下，与对照相比，NAC17过表达转基因的植株叶片颜色较浅，表明转基因植株叶片内的死细胞数量少，说明NAC17过表达转基因株系受胁迫后的损伤程度低。

②DAB染色：

分别取未胁迫处理和胁迫处理12h的实验组及对照组山新杨叶片，置于离心管中，加入DAB染色液，室温染色过夜。染色结束后，用75％乙醇与5％甘油煮沸脱色。细胞中H₂O₂释放出的氧离子能够氧化DAB，形成棕色沉淀，根据染色的深浅，能判断细胞中H₂O₂释放量的多少，细胞受损伤越严重，H₂O₂释放的越多。图7为DAB染色，在非胁迫生长条件下(control)，NAC17过表达转基因植株以及对照组植株叶片颜色均较浅，且相互之间无明显差异；在NaCl胁迫条件下，与对照相比，，NAC17过表达转基因的植株叶片颜色较浅，说明NAC17过表达转基因株系受胁迫之后的损伤程度低。

③NBT染色：

分别取未胁迫处理和胁迫处理12h的实验组及对照组山新杨叶片，置于离心管中，加入NBT染色液，室温染色过夜。染色结束后，用75％乙醇与5％甘油煮沸脱色。NBT染色结果可以用来检测植物中超氧阴离子(O^2-)的含量，根据染色的深浅，能判断细胞中超氧阴离子(O^2-)的多少，细胞受损伤越严重，超氧阴离子(含量O^2-)越多。图8为NBT染色，在非胁迫生长条件下(control)，NAC17过表达转基因以及对照组植株叶片颜色均较浅，且相互之间无明显差异；在NaCl胁迫条件下，与对照相比，NAC17过表达转基因的植株叶片颜色较浅，表明实验组植株叶片内的超氧阴离子(O^2-)的含量较对照组山新杨植株叶片内的超氧阴离子(O^2-)含量少，说明转NAC17基因株系受胁迫之后的损伤程度低。

以上的染色结果表明，NAC17基因能够正向调控山新杨的耐盐性能。

(2)生理指标的测定

①超氧化物歧化酶(SOD)活性测定(试剂盒法)：

准确称取植物组织(0.2～0.5g)，按重量(g)：体积(ml)＝1：4的比例，加入四倍体积的匀浆介质，剪碎，冰水浴条件下进行匀浆，制备成20％的匀浆液，3500rpm，离心10分钟，取上清液待测，具体操作步骤如下表所示：

表8超氧化物歧化酶(SOD)活性测定操作步骤

结果计算：

×样品前处理稀释倍数(3倍)÷匀浆液浓度*(克组织湿重ml)

*即为反应体系中的稀释倍数

SOD可以催化超氧阴离子自由基的歧化反应，抵抗活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的损伤，从而提高植物的抗逆能力，测定结果如图9。在NaCl的非生物胁迫条件下，过表达NAC17基因植株的SOD活性高于对照，说明稳定转化后过表达植株的抗逆境胁迫能力比对照植株强。实验结果表明NAC17基因能够正向调控SOD活性。

②过氧化物酶(POD)活性测定(试剂盒法)：

前处理：含水量高的嫩叶植物组织匀浆液的制备：取植物组织擦净水分及杂质，准确称取植物组织重量，按照重量(g)：体积(ml)＝1：9的比例加入9倍体积的匀浆介质(推荐使用生理盐水或磷酸盐缓冲液：0.1mol/L pH7～7.4)，冰水浴条件下制备成10％的组织匀浆液，3500rpm离心10分钟后，取上清液进行测定。含水量较低的干燥植物组织匀浆液的制备：取植物组织擦净水分及杂质，剪碎后放入研钵，加入液氮，研磨成粉状后转移出来，然后准确称取重量，按照重量(g)：体积(ml)＝1：9的比例加入9倍体积的匀浆介质(推荐使用生理盐水或磷酸盐缓冲液：0.1mol/L pH＝7～7.4)，漩涡混匀抽提3-5分钟后，3500rpm离心10分钟，取上清液进行测定。

具体操作步骤如下表所示：

表9过氧化物酶(POD)活性测定操作步骤

混匀，11000rpm离心10分钟，取上清于420nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测定。

结果计算：

定义：在37℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化1μg底物的酶量定义为一个酶活力单位。

计算公式：

在过氧化物酶(POD)催化下，H₂O₂将愈创木酚氧化成茶褐色产物，过氧化物酶是植物体内降低氧自由基伤害的重要保护酶，和植物的抵御逆境胁迫能力紧密相关，实验结果如图10。

在非胁迫条件下(control)，实验组和对照组山新杨株系的POD活性大致相同；在NaCl的非生物胁迫条件下，实验组及对照组山新杨株系的POD活性发生了变化。过表达NAC17基因株系的POD活性高于对照，说明实验组植株的抵御逆境胁迫能力比对照强。结果说明NAC17基因的表达量与POD的酶活正相关，说明其能够通过调控植物体内的抗氧化酶活性来提高植物的抗逆能力。

③蛋白浓度的测定(试剂盒法)：

前处理：称取为0.1g的山新杨植物组织，液氮条件下研磨成粉，按照重量(g)：体积(mL)＝1：9的比例加入生理盐水，10000rpm离心10分钟后，取上清液。然后用生理盐水按1：9的比例稀释成1％的组织匀浆，作为待测液。

具体操作步骤如下表所示：

表10蛋白浓度测定操作步骤

结果计算：

植物体内的可溶性蛋白质大多是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标，植物体内蛋白的含量多少可以反映出植物抗逆境胁迫的能力，在逆境胁迫下，植物抵抗逆境的能力越强，其总蛋白含量就越高，实验结果如图11所示。

如图所示，在NaCl的非生物胁迫条件下，实验组及对照组山新杨株系的蛋白浓度发生了变化。过表达NAC17基因株系的蛋白浓度高于对照，说明实验组植株的抵御逆境胁迫能力比对照强。结果说明过表达NAC17基因与植物的抗逆能力正相关。

④H₂O₂含量的测定(试剂盒法)

准确称取组织重量，按照重量(g)：体积(ml)＝1：9的比例，加入9倍体积的0.9％的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，1000rpm离心10分钟，取上清10％匀浆待测。具体操作步骤如下表所示：

表11H₂O₂含量测定操作步骤

结果计算：

H₂O₂作为活性氧，在生物体内普遍存在，更是活性氧之间转化的重要枢纽。在众多氧化代谢产物中，H₂O₂会使细胞衰老和解体这一过程加速，其原理是其能够对细胞膜产生损害，并直接或者间接使生物大分子氧化，在逆境胁迫下，植物抵抗逆境的能力越强，体内积累的H₂O₂含量就越低，实验结果如图12所示。

如图所示，在NaCl的非生物胁迫条件下，实验组及对照组山新杨株系的H₂O₂浓度发生了变化。过表达NAC17基因株系的H₂O₂浓度低于于对照，说明实验组植株的抵御逆境胁迫能力比对照强。结果说明过表达NAC17基因能够提高植物抗逆能力。

⑤相对电导率的测定：

取胁迫处理后3-5片、大小一致的新鲜叶片，依次用双蒸水和超纯水冲洗3次，滤纸吸干表面水分，放于50mL的离心管中。加入超纯水30mL，真空泵抽15min，用电导仪测其电导值，记为S1；然后将离心管于90℃恒温水浴锅中水浴20min，然后冷却至室温，测其电导值，记为：S2。植物叶肉相对电导率是反应植物细胞膜透性的一项基本指标，当植物受到逆境影响时，细胞膜遭到破坏，膜透性增大，从而使细胞内的电解质外渗。植物的相对电导率越高反映了其抗逆能力的越高，实验结果如图13所示。

在非胁迫条件下(control)，实验组和对照组山新杨株系的相对电导率大致相同；在NaCl的非生物胁迫条件下，实验组及对照组山新杨株系的相对电导率发生了变化。过表达NAC17基因株系的相对电导率低于于对照，说明实验组植株的抵御逆境胁迫能力比对照强，过表达NAC17基因能够提高植物的抗逆能力。

结果计算：相对电导率＝S1/S2*100％

通过对NAC17过表达转基因株系进行盐胁迫后的组织化学染色和生理指标分析，表明NAC17过表达转基因山新杨的耐盐性能和材质材性均得到显著的改善。

实施例3：山新杨NAC17基因在木质部发育的功能分析

利用冷冻切片机，将过表达和野生型植株的茎部组织进行冷冻切片，并进行盐酸间苯三酚和荧光增白剂染色，于镜下观察木质部的发育情况。图14为盐酸间苯三酚染色，从图中可以看到，与野生型相比，过表达转基因无菌苗的茎横截面的木质部发育程度更高。

图15为荧光增白剂染色，从图中可以看到，与野生型相比，过表达转基因无菌苗的茎横截面的木质化程度更高，说明NAC17基因能够正向调节山新杨的木质部发育过程。

通过对NAC17过表达转基因山新杨和野生型山新杨进行茎的横向组织切片分析，表明NAC17基因的过表达能够促进山新杨的材性发育。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.NAC17基因在改良山新杨性状中的应用，其特征在于，所述NAC17基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述性状包括耐盐性状和木材品质，所述木材品质包括木质化程度。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述NAC17基因正向调控山新杨耐盐性状和木材品质。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过过表达NAC17基因，提高山新杨耐盐性和木材品质。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述过表达NAC17基因是通过将NAC17基因转入山新杨，从而提高山新杨的耐盐能力和木材品质。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，构建含有所述NAC17基因的过表达载体并制备工程菌，并利用农杆菌介导法稳定遗传转化至山新杨。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述NAC17基因或其表达产物用于定向选择或鉴定优良性状山新杨，所述优良性状表现为高耐盐性和高木质化程度。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述鉴定优良性状山新杨包括：鉴定测试山新杨中NAC17基因或其表达产物的水平，若是该测试山新杨的NAC17基因或其表达产物水平显著高于该类山新杨的平均值，并且NAC17基因过表达转基因山新杨的耐盐能力及木材品质提高，则为优良性状山新杨。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述NAC17基因表达产物为NAC17蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。