CN116590304B - 一种洋葱AcCNGC2基因及其应用 - Google Patents

一种洋葱AcCNGC2基因及其应用 Download PDF

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Abstract

一种洋葱AcCNGC2基因及其应用，属于基因工程技术领域。为了在洋葱的基因组中挖掘能够提高洋葱抗烟草疫霉能力且能够提高洋葱耐低温能力的基因，本发明成功克隆了洋葱AcCNGC2基因，对洋葱AcCNGC2基因进行了亚细胞定位，构建了由35S启动子驱动的AcCNGC2植物过表达载体，采用叶盘法对本氏烟进行遗传转化，通过对转基因株系接种烟草疫霉菌以及进行低温胁迫处理分析洋葱AcCNGC2基因功能，并利用双分子荧光互补技术研究洋葱AcCNGC2基因的Ca2+通道形成机制。本发明不仅为基因组巨大、缺乏完善参考基因组及高效遗传转化体系的洋葱的基因功能解析提供途径，也对洋葱遗传育种改良具有重要意义。

Description

一种洋葱AcCNGC2基因及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种洋葱AcCNGC2基因及其应用，具体涉及一种洋葱AcCNGC2基因在培育抗烟草疫霉或/和耐低温洋葱品种中的应用。
背景技术
洋葱(Allium cepa L.)是重要的蔬菜作物，因其极高的营养价值和药用价值被誉为“菜中皇后”，在世界范围内广泛种植。
随着全球气候环境改变，洋葱病害凸显，严重影响洋葱的经济效益。挖掘洋葱疫病抗性基因，研究其疫病抗性机制具有重要的理论意义和应用价值。目前，东北地区种植的洋葱品种主要来源于国外，选育优质、抗病且具有自主知识产权的品种也是洋葱育种家一直努力的方向。疫霉菌在世界范围内威胁多种作物生长，造成广泛的作物损失和森林生态环境的退化。洋葱疫病致病病原菌为卵菌门疫霉属烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)。由于卵菌独特的生理生化特性，大部分有效的杀菌剂防治卵菌病害效果较差，因此育成抗病洋葱品种成为了解决病害问题最有效的途径。
Ca2+作为第二信使，参与调控植物的生长发育和逆境胁迫响应。环核苷酸门控通道是一类最早在动物中发现的非选择性阳离子通道，它们可被环核苷酸结合而激活，可以将细胞外Ca2+导入细胞内(Haynes L andYau KW.Cyclic GMP-sensitive conductance inouter segmentmembrane ofcatfish cones.Nature,1985,317(6032),61.)。近年来，人们发现植物CNGCs家族成员参与拟南芥生长发育、响应生物和非生物胁迫(ZelmanAK,DaweA,Gehring C,Berkowitz GA.Evolutionary and structural perspectives ofplantcyclicnucleotide-gated cation channels.Frontiers in Plant Science,2012,3:95；Jha SK,Sharma M,Pandey GK.Role ofcyclic nucleotide gated channels in stressmanagement inplants.Current Genomics,2016,17
(4):315–329.)。拟南芥CNCG2和CNGC4能够共同形成有活性的Ca2+通道，在正常情况下，此通道被CAM阻断，当植物受到病原物侵害时，此复合物被BOTRYTIS-INDUCEDKINASE1(BIK1)激活，使细胞内Ca2+浓度增加，激发植物抗病防御反应(TianW,Hou CC,RenZJ,Wang C,Zhao FG,DahlbeckD,Hu SP,Zhang LY,Niu Q,Li LG,Staskawicz BF,LuanS.Acalmodulin-gated calcium channel links pathogen patterns toplantimmunity.Nature,2019,572(7767).)。AtCNGC20的突变体cngc20-4同时影响病原物相关分子模式触发的免疫和效应子触发的免疫，AtCNGC20参与形成的Ca2+通道在植物免疫反应中起重要作用(Zhao CH,TangYH,Wang JL,ZengYH,Sun HQ,Zheng ZC,Su R,Schneeberger K,ParkerJE,Cui HT.Amis-regulated cyclic nucleotide-gated channelmediates cytosolic calcium elevation and activates immunity inArabidopsis.NewPhytologist,2021.230(3):1078-1094.)。也有研究发现NO参与拟南芥AtCNGC2基因调控的植物抗病防御反应，且AtCNGC2基因在细菌MAMP触发的Ca2+活化及HR反应中起正向调控作用(Ali R,MaW,Lemtiri-Chlieh F,Tsaltas D,Leng Q von Bodman S,Berkowitz GA.Deathdon'thave no mercy andneither does calcium:Arabidopsis CYCLIC NUCLEOTIDEGATED CHANNEL2 and innate immunity.Plant cell,2007,19(3):1081-1095；MaW,Yoshioka K,Berkowitz GA.Cyclic Nucleotide Gated Channels and Ca2+-Mediatedsignal transduction duringplant innate immune response to pathogens.PlantSignaling andBehavior,2007,2(6):548-550.)。植物CNCGs家族成员众多，番茄CNGCs家族各成员在番茄不同病害中功能不同，SlCNGC8，SlCNGC11及SlCNGC14在番茄与黄单胞菌属病原菌互作中起负调控作用，而SlCNGC1和SlCNGC6与核盘菌互作中起正调控作用(SaandMA,XuYP,Munyampundu JP,Li W,Zhang XR,Cai XZ.Phylogeny and evolution ofplantcyclic nucleotide-gated ion channel(CNGC)gene family and functional analysesoftomato CNGCs,DNAResearch,2015,22(6):471-483.)。烟草CNCGs家族有35个成员，分属4个亚组，其中NtCNCG2、NtCNCG4、NtCNCG31-35在烟草受P.nicotianae侵染后表达显著上调(Nawaz Z,Kakar KU,Ullah R,Yu S,Zhang J,Shu QY,RenXL.Genome-wideidentification,evolution and expression analysis ofcyclic nucleotide-gatedchannels in tobacco(Nicotiana tabacum).Genomics,2018,S0888754318300247.)。当病原物入侵时，CNGCs通过调节植物体内Ca2+内流参与植物抗病防御反应，但其家族成员众多，各成员间功能有差异。
洋葱是生长发育严格受光周期调控的二年生蔬菜作物，具有庞大的基因组和更长的育种周期。在组学研究和测序技术飞速发展的今天，洋葱重要基因的定位和克隆依旧十分困难。与大宗蔬菜相比，洋葱分子生物学研究常受到忽视，功能基因研究进展缓慢，抗病相关基因鲜有报道。因此，在CNGCs家族中筛选出参与洋葱响应生物和非生物胁迫的基因对于洋葱遗传育种改良具有重要意义。
发明内容
为了在洋葱的基因组中挖掘能够提高洋葱抗烟草疫霉能力且能够提高洋葱耐低温能力的基因，本发明提供了一种洋葱AcCNGC2基因，所述洋葱AcCNGC2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述洋葱AcCNGC2基因在提高植物抗烟草疫霉能力中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述提高植物抗烟草疫霉能力是指洋葱AcCNGC2基因促进烟草疫霉入侵早期植物细胞的Ca2+内流，促进烟草疫霉入侵植物后细胞中活性氧积累。
本发明还提供了含有上述洋葱AcCNGC2基因的重组载体在提高植物抗烟草疫霉能力中的应用。
本发明还提供了含有上述洋葱AcCNGC2基因的重组菌在提高植物抗烟草疫霉能力中的应用。
本发明还提供了上述洋葱AcCNGC2基因在提高植物耐低温能力中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述提高植物耐低温能力是指降低植物低温胁迫下的膜脂过氧化程度，降低低温胁迫对植物细胞膜的损伤，减少低温胁迫对植物叶绿素合成的影响，提高低温胁迫下植物细胞中叶绿素含量。
本发明还提供了含有上述洋葱AcCNGC2基因的重组载体在提高植物耐低温能力中的应用。
本发明还提供了含有上述洋葱AcCNGC2基因的重组菌在提高植物耐低温能力中的应用。
本发明还提供了上述洋葱AcCNGC2基因在培育具有烟草疫霉抗性或/和耐低温能力的洋葱品种中的应用。
本发明的有益效果：
本发明成功克隆了洋葱AcCNGC2基因，发现洋葱AcCNGC2基因的cDNA为2022bp，编码673个氨基酸，具有七个跨膜区结构域和cNMP结合结构域。通过对洋葱AcCNGC2基因进行亚细胞定位，发现其定位于细胞膜。
本发明通过构建由35S启动子驱动的AcCNGC2植物过表达载体，采用叶盘法对本式烟进行遗传转化，通过对转基因株系接种烟草疫霉菌以及对转基因株系进行低温胁迫处理观察转基因株系的生理生化变化，进而分析洋葱AcCNGC2基因功能，发现AcCNGC2转基因本氏烟的烟草疫霉抗性显著提高，证明洋葱AcCNGC2基因作为正调控因子参与烟草疫霉抗性的调控，可用于洋葱抗疫病品种选育；此外本发明还发现AcCNGC2基因过表达能够显著增强本氏烟对低温的抗性，证明了AcCNGC2基因作为正调控因子在植物抵御冷胁迫中起作用，可用于耐低温洋葱品种选育。
此外，本发明利用双分子荧光互补技术研究洋葱AcCNGC2的Ca2+通道形成机制，发现洋葱AcCNGC2基因可能由自身形成复合体，形成钙离子通道，在植物受到生物和非生物胁迫时介导Ca2+内流，激发下游信号，提高植物抗性。
本发明不仅为基因组巨大、缺乏完善参考基因组及高效遗传转化体系的洋葱的基因功能解析提供途径，也对洋葱遗传育种改良具有重要意义。
附图说明
图1为洋葱AcCNGC2基因的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果图；其中，M为MarkerDL5000；
图2为实施例2中转化获得的大肠杆菌菌液PCR鉴定结果图；其中，M为MarkerDL5000，PC为阳性对照，NC为阴性对照；
图3为实施例2中AcCNGC2过表达载体pBI121-AcCNGC2载体双酶切鉴定结果图；其中，M为Marker DL5000；
图4为pBI121-AcCNGC2载体转入农杆菌后获得的菌液PCR结果图；其中，图中M为Marker DL5000，PC为阳性对照，NC为阴性对照；
图5为重组载体pSuper1300-eGFP-AcCNGC2的图谱；
图6为AcCNGC2亚细胞定位分析结果图；
图7为PCR检测含有pBI121-AcCNGC2的阳性本式烟植株结果图；其中，图中的M为Marker DL5000，PC为阳性对照，NC为阴性对照，1，2，3，4，5，6，7和8分别为获得的再生株系AcCNGC2-OE-1，AcCNGC2-OE-2，AcCNGC2-OE-3，AcCNGC2-OE-4，AcCNGC2-OE-5，AcCNGC2-OE-6，AcCNGC2-OE-7和AcCNGC2-OE-8；
图8为qRT-PCR检测三个阳性本式烟植株AcCNGC2相对表达量的结果图；其中，OE-3为本式烟植株AcCNGC2-OE-3，OE-4为本式烟植株AcCNGC2-OE-4，OE-8为本式烟植株AcCNGC2-OE-8，WT为野生型本氏烟植株；
图9为AcCNGC2转基因株系和野生型本式烟离体叶片接种烟草疫霉菌后表型结果图；其中，AcCNGC2-OE为AcCNGC2转基因株系，WT为野生型本氏烟；
图10为AcCNGC2转基因株系和野生型本式烟植株叶片接种烟草疫霉菌后植株表型结果图；其中，OE-3为转基因株系AcCNGC2-OE-3，OE-4为转基因株系AcCNGC2-OE-4，OE-8为转基因株系AcCNGC2-OE-8，WT为野生型本氏烟；
图11为AcCNGC2转基因株系和野生型本式烟植株茎基部接种烟草疫霉菌后植株表型结果图；其中，OE-3为转基因株系AcCNGC2-OE-3，OE-4为转基因株系AcCNGC2-OE-4，OE-8为转基因株系AcCNGC2-OE-8，WT为野生型本氏烟；
图12为接种烟草疫霉菌后AcCNGC2转基因株系和野生型本式烟细胞内Ca2+浓度测定结果图；其中，OE为AcCNGC2转基因株系，WT为野生型本氏烟；
图13为组织化学染色法检测接种烟草疫霉菌后AcCNGC2转基因株系和野生型烟草叶片中活性氧含量结果图；其中，OE为AcCNGC2转基因株系，WT为野生型本氏烟；
图14为AcCNGC2转基因株系和野生型本式烟在冷胁迫处理下的表型结果图；其中，OE为AcCNGC2转基因株系，WT为野生型本氏烟；
图15为AcCNGC2转基因株系和野生型本式烟在冷胁迫处理后叶片中丙二醛含量测定结果图；其中，OE-3为转基因株系AcCNGC2-OE-3，OE-4为转基因株系AcCNGC2-OE-4，OE-8为转基因株系AcCNGC2-OE-8，WT为野生型本氏烟植株；
图16为AcCNGC2转基因株系和野生型本式烟在冷胁迫处理后叶片电导率测定结果图；其中，OE-3为转基因株系AcCNGC2-OE-3，OE-4为转基因株系AcCNGC2-OE-4，OE-8为转基因株系AcCNGC2-OE-8，WT为野生型本氏烟植株；
图17为AcCNGC2转基因本氏烟株系和野生型本式烟在不同时间冷胁迫后叶片叶绿素荧光成像结果图；其中，OE-3为转基因株系AcCNGC2-OE-3，OE-4为转基因株系AcCNGC2-OE-4，OE-8为转基因株系AcCNGC2-OE-8，WT为野生型本氏烟植株；
图18为SPYNE-AcCNGC2(AcCNGC2-YFPN)载体的图谱；
图19为SPYCE-AcCNGC2(AcCNGC2-YFPC)载体的图谱；
图20为AcCNGC2-YFPC和AcCNGC2-YFPN双酶切鉴定结果图；其中，M为MarkerDL5000，a为AcCNGC2-YFPC双酶切鉴定结果图，b为AcCNGC2-YFPN双酶切鉴定结果图；
图21为AcCNGC2和AcCNGC2在植物中互作分析结果图；其中，AcCNGC2-YFPN+AcCNGC2-YFPC为试验组，YFPN+YFPC、YFPN+AcCNGC2-YFPC和AcCNGC2-YFPN+YFPC为对照，YFP为黄色荧光信号，DIC为明场，Overlay为叠加图像。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不用于限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药品试剂，如无特殊说明，均可通过商业渠道购买获得。
实施例1：洋葱AcCNGC2基因的克隆
东北农业大学葱蒜课题组选育的洋葱多代自交系SA2(Yuan QL,Song C,Gao LY,Zhang HH,Yang CC,Sheng J,Ren J,Cheng D,WangY.(2018).Transcriptome de novoassembly and analysis ofdifferentially expressed genes related to cytoplasmicmale sterility in onion.Plant Physiology and Biochemistry,125:35-44.)用于洋葱AcCNGC2基因克隆。
(1)洋葱总RNA提取
利用Trizol法提取洋葱SA2叶片总RNA(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。取-80℃保存的100mg洋葱叶片于液氮预冷的研钵中研磨成粉末，研磨过程中向研钵中加入液氮，保持样品处于冷冻状态，将充分研磨的样品装入1.5ml RNase-free离心管中，同时加入1mlTrizol裂解液，室温放置5min，向离心管中加入200μl氯仿，剧烈震荡15s后室温放置3-5min直至液体分层，4℃低温下，12000rpm离心15min，吸取上清于新的RNase-free离心管中，向其中加入等体积氯仿，剧烈震荡15s后静置分层，4℃低温下，12000rpm离心10min，取上清液于新的RNase-free离心管中，向其中加入等体积预冷的异丙醇，-20℃放置30min后，4℃低温下，12000rpm离心10min，此时RNA沉淀于离心管底部，用1ml 75％酒精(用RNase-free水配制)洗涤RNA沉淀，洗涤2-3次之后，7500rpm离心1-2min，再用枪头吸掉多余的酒精，离心管敞口放置2-3min将RNA晾干，50μl RNase-free水溶解RNA。1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，检测合格的RNA样品用于后续试验，于-80℃中保存。
(2)cDNA合成
根据东洋纺生物科技有限公司(TOYOBO)的First StrandcDNASynthesis KitReverTraAce-α-试剂盒进行反转录，获得cDNA。具体反转录反应体系和程序如下：
RNA热变性：根据表1反应体系配置反应液，于65℃，反应5min后，立即置于冰上。
表1反转录反应体系(RNA热变性)
反转录：根据表2配置反应体系，总体系为20μl。将反应液轻轻地搅拌均匀后，按42℃，30min；99℃，5min的程序进行反应。获得的cDNA样品用于后续试验，于-80℃中保存。
表2反转录反应体系
(3)洋葱AcCNGC2基因克隆
以洋葱SA2的cDNA为模板克隆洋葱AcCNGC2，在转录组数据库中筛选AcCNGC2基因的cDNA序列，利用Primer 5.0设计用于克隆AcCNGC2基因的引物，其中，上游引物AcCNGC2-F的核苷酸序列见SEQ ID NO.3，下游引物AcCNGC2-R的核苷酸序列见SEQ ID NO.4，引物前分别加酶切位点和保护碱基，东洋纺生物科技有限公司(TOYOBO)KOD OneTM PCR Master Mix用于基因克隆。PCR反应体系如表3，反应条件为98℃，20s；98℃，10s，50℃，10s，68℃，30s，35个循环；72℃，10min；4℃保存。获得PCR产物后利用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，目的片段的电泳结果图见图1。
SEQ ID NO.3：GCTCTAGAATGTATAAGTTGCTTCCATCAC(XbaⅠ)；
SEQ ID NO.4：TCCCCCGGGTCACTCAAGATGATCATGAGG(SmaⅠ)。
表3基因克隆反应体系
(4)测序
PCR产物利用东洋纺生物科技有限公司(TOYOBO)试剂盒Convenient TA Cloningsystem for PCR Products TArget CloneTM-Plus-连接克隆载体，获得pTA2 Vector-AcCNGC2。热激法将重组质粒转入DH5α大肠杆菌感受态细胞中，Omega Plasmid Mini Kit I质粒提取试剂盒用于质粒提取，酶切验证后送华大基因测序，获得AcCNGC2 cDNA和氨基酸序列，测序结果表明洋葱AcCNGC2 cDNA为2022bp(SEQ ID NO.1)，编码673个氨基酸(SEQ IDNO.2)，具有七个跨膜区结构域和cNMP结合结构域。
SEQ ID NO.1：
ATGTATAAGTTGCTTCCATCACCGCCTGTAGAATGTTACGCCTGCACACAAGCAGGCGTGCCTGCTTTCCACTCTACAACATGCGACAGAGCAAATGCGCCGCAGTGGGAGGCTAATGCAGGGTCCTCCCTAATACCTGTCAGCAACATCCCTCCCAGAGACACCCACCGCTACCCAACTAATAAATGGATATTTGGGGATGTTCTTGACCCTCGAAGCAAACGGGTCCAAAGATGGAATCGGCTTATACTGCTAGCCCGTGCAGTTGCATTGGCAGTTGATCCTTTGTTCTTCTACTCTCTTTCCATTGAGAGGAACGGCGCTCCTTGCTTGTACATGGATGTGGGTTTGGTCATCGTTGTGACTGTGCTGCACACCTGTGCTGATGTTGTACATATCATGCATGTGTGGCTGCAGTTTAAGGTTGCCTTTGTTTCTAGGGAGTCGCTTGTTGTCGGGTGTGGGAAGCTTGTTTGGGATGCCAGGTTGATCGCAGCACATTATCTGAGATCTTTGAAAGGGTTCTGGTTTGATGTTTTTGTCATCTTGCCCGTTCCTCAGGTGGTATTTTGGTCGGTGGTGCCAAAACTGATAAAAGAAGAAGAAATAAAGTTGATAATATCAATACTTCTGATGATGTTTCTGTTCCAGTTCCTACCTAAGGTTTATCATAGCATTTGTGTAATGAAAAAAATGCAGAAGGTCACCGGTTACATATTCGGAACCATTTGGTGGGGTTTTGCCCTTAATCTCATTGCATATTTCATCGCTTCTCATGTAGCTGGTGGGTGTTGGTATGTTCTTTCAATTCAACGTGTCGCCTCATGTCTACAACAGCAATGCGAGAAAAATAACAACTGCGGCCTCGTTTCATTAGCCTGCTCTCAAGAACTCTGCTACGCCAGCATTCCTTTGCCATCAGCCTTCGATGGATTGCAGTGTGCTAACAGTTCGGCTAAAAAAAGTTATTCAGTATGCTTAGATGTTGATGGTTCTTTTCCTTATGGAATATACAAGTGGGCGCTTCCTGTTGTGTCTAGTAACTCTCTTGCTGTCAAGATCCTTTATCCAATTTTTTGGGGGCTTATGACTCTAAGCACATTTGGAAACGATCTGGATCCTACTAGTAACTGGTTAGAAGTGATATTCAGCATCATTATAACACTGAGTGGTCTGATGCTGTTTACTTTATTAATTGGCAACATTCAGGTGTTTTTGCATGCGGTGATGGCCAGGAAGAGGAAAATGCAAGTGAGATGTAGAGATATGGAGTGGTGGATGAAGAGGCGACAACTTCCATCACGTTTGAGGCAGAGAGTGCGACAGTATGAACGTCATAGATGGACCGCAATGAGAGGGGAAGATGAAATGGATATGACCAAAGATTTACCCGAAGGTATCCGAAGAGATATCAAGCGATATCTTTGCGTTGATCTGGTCAAAAAGGTGCCATTGTTTCATAACCTTGATGAACTCATTCTTGACAATATCTGTGACAGAGTCAGACCTCTTGTCTTCTCTAAAAATGAAAAGGTGATAAGAGAAGGCGATCCAGTGCACCGCATGATATTCATAGTAAAAGGCCACCTAAAAAGCAGCCAGCACCTAACCAAGGGCAAGACCGCCACATGCATGCTTGGCCCTGGAAACTTCTTCGGAGACGAGCTCCTCTCATGGTGCCTACGCCGCCCCTTCTTGGACCGACTCCCTGCCTCATCCTCTACGTTCGAGTGCGTCGAACCGACCGAGGCGTTCGCTCTTAACGCTCCTCACCTGAGGTACATCACCGACCACTTCAGGTACCAGTTCGCCAACGAGAAACTGAAGAGGACTGCCAGGTACTATTCCACTACTTGGAGGACATGGGGAGCCGTGAATATACAACTGGCATGGAGGAAGTATAAGAGGAGGAAGGGAGAAGAAAGAGAGGAGGTGGTTATGGAGGATGGTGGCGATGAGCGGAGGTTGAGGAAGTATGCTGCTTTGTTCTTGTCTTTGAGGCCTCATGATCATCTTGAGTGA
SEQ ID NO.2：
MYKLLPSPPVECYACTQAGVPAFHSTTCDRANAPQWEANAGSSLIPVSNIPPRDTHRYPTNKWIFGDVLDPRSKRVQRWNRLILLARAVALAVDPLFFYSLSIERNGAPCLYMDVGLVIVVTVLHTCADVVHIMHVWLQFKVAFVSRESLVVGCGKLVWDARLIAAHYLRSLKGFWFDVFVILPVPQVVFWSVVPKLIKEEEIKLIISILLMMFLFQFLPKVYHSICVMKKMQKVTGYIFGTIWWGFALNLIAYFIASHVAGGCWYVLSIQRVASCLQQQCEKNNNCGLVSLACSQELCYASIPLPSAFDGLQCANSSAKKSYSVCLDVDGSFPYGIYKWALPVVSSNSLAVKILYPIFWGLMTLSTFGNDLDPTSNWLEVIFSIIITLSGLMLFTLLIGNIQVFLHAVMARKRKMQVRCRDMEWWMKRRQLPSRLRQRVRQYERHRWTAMRGEDEMDMTKDLPEGIRRDIKRYLCVDLVKKVPLFHNLDELILDNICDRVRPLVFSKNEKVIREGDPVHRMIFIVKGHLKSSQHLTKGKTATCMLGPGNFFGDELLSWCLRRPFLDRLPASSSTFECVEPTEAFALNAPHLRYITDHFRYQFANEKLKRTARYYSTTWRTWGAVNIQLAWRKYKRRKGEEREEVVMEDGGDERRLRKYAALFLSLRPHDHLE-
实施例2：含有洋葱AcCNGC2基因的重组载体及重组菌的构建
(1)分别利用XbaI和SmaI双酶切pBI121载体质粒和pTA2Vector-AcCNGC2载体质粒，酶切反应体系如表4，反应条件为37℃，20min。
表4酶切反应体系
分别胶回收基因的目的片段和pBI121载体片段，将目的片段和载体片段用T4 DNA连接酶连接，反应体系见表5，反应条件为4℃，16h。
表5 T4连接反应体系
(2)转化大肠杆菌
将T4连接产物热激发转化DH5α大肠杆菌感受态中。挑取LB固体培养单菌落，置于LB液体培养基中(含有50mg·L-1Kan)，摇床37℃、200rpm摇菌12h，利用基因克隆引物进行菌液PCR验证，获得大小约2022bp的条带(见图2)。
将验证有约2022bp条带的菌液5μl，加入至5ml LB液体培养基(含有50mg·L-1Kan)，37℃、200rpm培养12h后Omega Plasmid Mini Kit I提取质粒，然后进行双酶切验证，反应体系见表6，反应条件为37℃，20min。双酶切结果显示目的基因条带约为2022bp(见图3)，pBI121-AcCNGC2基因过表达载体构建成功，菌液加入50％甘油于-80℃保存。
表6酶切反应体系
(3)转化农杆菌
利用Omega Plasmid Mini Kit I对连接载体成功的菌液提取质粒，转入GV3101农杆菌感受态细胞中，采用冻融法转化。感受态购于上海昂羽生物技术有限公司。
挑取LB固体培养基中平滑的、周围没有杂菌的白色单菌落，置入LB液体培养基中(含有50μg·L-1Kan和25μg·L-1Rif)，摇床28℃、200rpm摇菌15h，通过菌液PCR验证是否转化成功(见图4)。将与目的基因片段相符的菌液加入50％甘油，-80℃保存，用于遗传转化。
实施例3：AcCNGC2的亚细胞定位
(1)亚细胞定位载体构建
利用pSuper1300-eGFP载体的Xbal、SalI两个限制性酶切位点设计上游引物AcCNGC2-GFP-F(SEQ ID NO.5)和下游引物AcCNGC2-GFP-R(SEQ ID NO.6)，扩增AcCNGC2，方法同实例1，分别双酶切载体片段以及PCR产物，通过T4连接酶将回收片段相连接，构建AcCNGC2亚细胞定位载体pSuper1300-eGFP-AcCNGC2，转化大肠杆菌感受态，酶切验证，获得含有重组载体pSuper1300-eGFP-AcCNGC2的大肠杆菌(重组载体pSuper1300-eGFP-AcCNGC2的图谱见图5)，具体操作步骤参见实施例2。
SEQ ID NO.5：GCTCTAGAATGTATAAGTTGCTTCCATCACC；
SEQ ID NO.6：ACGCGTCGACCTCAAGATGATCATGAGGCC。
(2)pSuper1300-eGFP-AcCNGC2农杆菌转化烟草
A.将检测成功的pSuper1300-eGFP-AcCNGC2和pSuper1300-eGFP空载转化农杆菌GV3101，具体操作步骤同实施例2。
B.将步骤A获得的重组农杆菌GV3101接种到50mL的含有50mg·L-1Kan和25mg·L- 1Rif的LB培养基中过夜培养后，OD600为1.0左右，将农杆菌菌液5000rpm离心10min，去上清，利用侵染液(含0.5M MES，10mM MgCl2、120μMAS)重悬菌液，调OD600至0.8左右，室温静置4h，即得侵染液。
(3)将制备好的侵染液注射到4-6周苗龄的烟草叶片的背面，用记号笔标记烟草叶片水渍状的背面，21℃黑暗处理72h后撕取烟草叶片表皮的标记区域，利用激光共聚焦进行荧光成像(见图6)，由成像结果可知AcCNGC2定位于细胞膜上。
实施例4：AcCNGC2载体转化本式烟
取保存于-80℃的含有AcCNGC2基因过表达载体pBI121-AcCNGC2质粒的农杆菌菌液接种至液体LB培养基中(含有50ml·L-1Kan和25mg·L-1Rif)，28℃，200rpm震荡培养至菌液OD600＝0.6-0.9，于5000rpm离心10min，弃上清，用等体积的MS培养基(含200μM乙酰丁香酮)重悬，静置2-3h后用作侵染液。
采用叶盘法对本式烟进行遗传转化：
(1)在超净台内对本式烟种子进行消毒处理(70％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3-4次，15％的NaClO消毒6-7min，无菌水冲洗5-6次)，将消毒后的种子播种于固体1/2MS培养基，25℃/22℃，16h/8h(光照/黑暗)培养；
(2)待本式烟叶片长至6周龄左右时，将叶片切成1cm×1cm叶盘，放置于预培养培养基中预培养48h；
(3)将预培养后的本式烟外植体浸入上述获得的含有pBI121-AcCNGC2过表达载体的农杆菌GV3101侵染液中，浸泡10min后，放入共培养培养基中共培养36h；
(4)将共培养后的烟草外植体放入筛选培养基中，组培室内25℃/22℃，16h/8h(光照/黑暗)培养，每两周继代一次；
(5)待筛选出的抗性芽长至3-4cm左右时，切下并转接到生根培养基上诱导生根，根系发达后将植株移出，移入基质中驯化。
预培养培养基：MS+0.1mg·L-1IAA+2.0mg·L-16-BA；
共培养培养基：MS+0.1mg·L-1IAA+2.0mg·L-16-BA；
筛选培养基：MS+0.1mg·L-1IAA+2.0mg·L-16-BA+500mg·L-1Timentin+100mg·L- 1Kan；
生根培养基：MS+0.02mg·L-1IAA+500mg·L-1Timentin+100mg·L-1Kan。
转基因烟草的鉴定：
T0代植株生长至5-6叶期，取叶片约0.2g，CTAB法提取各株基因组DNA，利用实施例1中的AcCNGC2-F/R引物对各T0代单株进行PCR扩增(扩增体系同基因克隆)，筛选阳性植株(见图7)。由图7可知，转基因株系AcCNGC2-OE-3，AcCNGC2-OE-4和AcCNGC2-OE-8为阳性植株，将上述三个阳性株系用于后续研究。
检测AcCNGC2在不同阳性株系中的相对表达量：
T0代PCR阳性株，取叶片约0.1g，提取总RNA，利用东洋纺生物科技有限公司ReverTraAce qPCR RT Master Mix试剂盒和Green Realtime PCR Master Mixq试剂盒用于反转录和qPCR检测，qRT-PCR检测AcCNGC2表达量(见图8)。其中qRT-PCR检测所用上游引物为Q-AcCNGC2-F(SEQ ID NO.7)，下游引物为Q-AcCNGC2-R(SEQ ID NO.8)。由qRT-PCR检测结果可知，相比于野生型本式烟植株，AcCNGC2-OE-3，AcCNGC2-OE-4和AcCNGC2-OE-8三个阳性植株的AcCNGC2表达量均有显著升高。
SEQ ID NO.7：TCAGCCTTCGATGGATTGC；
SEQ ID NO.8：TCGTTTCCAAATGTGCTTAGAGT。
实施例5：洋葱AcCNGC2基因在提高植物抗烟草疫霉菌能力中的应用
(1)利用烟草疫霉菌侵染转基因烟草观察洋葱AcCNGC2基因对于本氏烟抗烟草疫霉能力的影响
将在固体培养基(PDA)上培养后的烟草疫霉菌切成1cm×1cm的菌丝块，分别对烟草叶片进行离体接种、植株叶片接种以及对烟草植株茎基部进行接种处理。
A.烟草疫霉菌接种烟草叶片
用无菌水对烟草叶片表面进行喷施处理，然后将1cm×1cm的烟草疫霉菌菌丝块接种于转基因和WT植株叶片，接种部位用湿润的脱脂棉包裹。
B.烟草疫霉菌接种烟草茎基部
利用注射器在烟草茎基部轻划出伤口，将培养1周的烟草疫霉菌菌丝块(0.5cm×0.5cm)接种于转基因和WT植株茎基部，接种部位用湿润的脱脂棉包裹。
AcCNGC2转基因株系和野生型本式烟离体叶片接种烟草疫霉菌后表型结果见图9。
在接种后0h、24h、48h、72h和96h观察转基因植株和WT植株发病情况。结果表明，烟草疫霉菌接种烟草叶片，转基因株系和WT在接种后24h和48h时没有明显差异，而在72h时，WT烟草植株叶片接种部位及附近区域出现褐色病斑，而转基因株系没有明显变化(图10)；在对转基因烟草植株和WT进行茎基部接种时，在接种后24h、48h和72h，转基因烟草植株和WT没有明显差异，而在接种后96h时，WT烟草植株接近茎基部位的烟草叶片出现褐色病斑，转基因烟草株系没有明显变化(见图11)。上述结果表明AcCNGC2基因能够提高本氏烟对烟草疫霉的抗性，在植物对烟草疫霉的防御反应中起正向调控作用。
(2)Ca2+浓度测定检测AcCNGC2对于病原体入侵植物细胞早期的Ca2+内流的影响
使用Fluo-3 AM(钙离子荧光探针)检测烟草疫霉接种后植株叶片钙离子浓度变化。分别取接种烟草疫霉菌后0h、3h、6h、9h、12h的转基因烟草株系和WT的叶片，在接种部位剪下0.5cm×0.5cm的叶片组织，置于含有2.5μM的Fluo-3 AM的1/2MS培养基中，25℃孵育30min进行荧光探针装载，随后用无菌水洗涤3-5次，洗涤后再孵育20-30min以确保Fluo-3AM在细胞内完全转变成Fluo-3。孵育结束后使用共聚焦激光扫描显微镜(Olympus,Japan)检测Fluo-3 AM负载细胞的荧光，激发波长为488nm，发射波长为530nm。检测结果如图12所示，在接种烟草疫霉菌3h-9h时，转基因株系烟草叶片细胞的Ca2+浓度显著高于WT中的Ca2+浓度，且在接种烟草疫霉菌3h时，转基因株系中的Ca2+浓度最高。该现象说明AcCNGC2介导了病原体入侵植物细胞早期的Ca2+内流。
(3)AcCNGC2通过调控ROS合成提高植物烟草疫霉抗性
分别取接种烟草疫霉菌后0h、3h、6h、12h的转基因烟草株系和WT的叶片，对其接种部位进行二氨基联苯胺(DAB)化学染色。将取下的叶片放入100ml锥形瓶中，加入含有0.1％DAB的50mM Tris-HCl溶液(pH＝3.8)，25℃过夜培养使其充分吸收，将叶片放入95％的乙醇溶液，置于90℃水浴中煮沸，每10min更换一次乙醇溶液，待叶绿素完全脱去进行拍照记录染色结果。染色结果如图13所示，使用DAB检测过氧化氢时，转基因株系在接种烟草疫霉菌3h和6h后，接种部位表面出现ROS积累。与转基因株系相比，WT在接种烟草疫霉菌3h和6h后无明显ROS积累。ROS爆发是植物应对病原菌侵染的早期防御信号，由此可见AcCNGC2的过量表达促进了ROS爆发，正向调控烟草疫霉抗性。
实施例6：洋葱AcCNGC2基因在提高植物耐低温能力中的应用
(1)过表达洋葱AcCNGC2基因对植物低温条件下植物表型及生理生化指标的影响
AcCNGC2转基因和野生型本氏烟植株长至4周左右，将烟草置于4℃条件下对其进行冷胁迫处理，分别在0h、6h、12h、24h对烟草表型进行观察。表型观察结果见图14，由该图可以看出转基因株系在处理后的24h之内表型未发生明显变化，而WT在处理后的12h开始出现叶片萎蔫现象，在处理后的24h时叶片萎蔫现象加剧。结果表明，AcCNGC2可提高植物的耐低温能力。
(2)过表达洋葱AcCNGC2基因对冷胁迫处理后植株叶片丙二醛含量的影响
对AcCNGC2转基因和野生型本氏烟进行冷胁迫处理(同上)，分别在冷胁迫处理后0h、6h、12h、24h取0.1g烟草叶片，加入5％三氯乙酸(TCA)，研磨后得到匀浆在3000rpm下离心10min。离心后用移液枪缓慢吸取上清2ml，加入0.67％硫代酸巴比妥(TBA)2ml，混合后100℃煮沸15min，待冷却后再离心10min。离心后分别测定上清液在OD450、OD532和OD600处的光吸收值，以2ml蒸馏水加2ml 0.67％硫代酸巴比妥(TBA)为对照，每个株系三次重复。按如下公式计算丙二醛含量：
丙二醇浓度：C(μmol·L-1)＝6.45(A532-A600)-0.56×A450；
丙二醇在植物组织中的含量：W＝CV/m；
W：丙二醛含量(μmol·g-1)V：提取液总体积(L)m：植物组织鲜重(g)。
丙二醛含量检测结果见图15，转基因株系和WT在冷胁迫处理后均会出现不同程度的膜脂过氧化，转基因株系在冷胁迫处理的6-24h内，其丙二醛显著低于野生型植株，说明AcCNGC2会在一定程度降低植物冷胁迫下的膜脂过氧化程度，AcCNGC2可以提高植物对冷胁迫的抗性。
(3)过表达洋葱AcCNGC2基因对冷胁迫处理后植物叶片电导率的影响
对AcCNGC2转基因和野生型本氏烟进行冷胁迫处理(同上)，分别在冷胁迫处理后0h、6h、12h、24h取烟草叶片对其进行电导率测定。首先检测纯水的离子值记为I0；将叶片放入100ml的锥形瓶内，加入20ml的去离子水，在30℃200rpm摇床摇15min，然后检测此时的离子值记为I1；将管子密封好放到100℃沸水中煮沸15min；将煮好的管子放到30℃200rpm的摇床上摇1h左右，再次检测溶液中的离子泄漏率，记为I2，每个株系三次重复。电导率计算公式如下：
电导率＝[(I1-I0)/(I2-I1)]×100％
电导率检测结果见图16，转基因株系在冷胁迫处理的6-24h内，其电导率显著低于WT，这说明在冷胁迫下，AcCNGC2转基因植株细胞膜受的伤害更小，AcCNGC2在植物耐冷中起正向调控作用。
(4)过表达洋葱AcCNGC2基因对冷胁迫处理后植物叶片叶绿素含量的影响
对AcCNGC2转基因本氏烟植株和野生型本氏烟进行冷胁迫处理(同上)，分别在冷胁迫处理后0h、6h、12h和24h使用叶绿素荧光成像系统*Fluor Cam检测叶片叶绿素荧光，检测前对烟草叶片进行黑暗适应15min，然后在黑暗条件下使用叶绿素荧光成像系统*FluorCam监测烟草叶片叶绿素的最大荧光，每个株系三次重复。
叶绿素检测结果见图17，冷胁迫处理24h后，转基因植株叶片叶绿素含量显著高于野生型，说明冷胁迫对于野生型植株的伤害远高于转基因植株，洋葱AcCNGC2在提高植物冷胁迫抗性中起作用。
实施例7：双分子荧光互补实验(BiFC)研究AcCNGC2互作
(1)构建双分子荧光互补载体：
利用同源重组技术，以洋葱SA2的cDNA为模板，用带有BamHI和Xhol的两对同源重组引物对AcCNGC2进行PCR扩增，利用Omega试剂盒进行基因片段回收。同源重组引物包括C-AcCNGC2-F(SEQ ID NO.9)，C-AcCNGC2-R(SEQ ID NO.10)，N-AcCNGC2-F(SEQ ID NO.11)和N-AcCNGC2-R(SEQ ID NO.12)。同时用BamHI和Xhol分别对SPYCE-YFP和SPYNE-YFP两个空载质粒进行双酶切，酶切后分别进行胶回收，对PCR扩增产物以及胶回收空载质粒产物进行同源重组反应(体系见表7)。根据诺唯赞II One Step Cloning Kit重组克隆试剂盒说明构建BiFC载体，获得SPYNE-AcCNGC2(AcCNGC2-YFPN)载体(图谱见图18)和SPYCE-AcCNGC2(AcCNGC2-YFPC)载体(图谱见图19)。
SEQ ID NO.9：tggcgcgccactagtggatccATGTATAAGTTGCTTCCATCACCG；
SEQ ID NO.10：cccgggagcggtaccctcgagCTCAAGATGATCATGAGGCCTCA；
SEQ ID NO.11：tggcgcgccactagtggatccATGTATAAGTTGCTTCCATCACCG；
SEQ ID NO.12：cccgggagcggtaccctcgagCTCAAGATGATCATGAGGCCTCA。
表7同源重组反应体系
注：X/Y根据公式计算得到载体用量和插入片段用量。
同源重组反应体系添加完成后使用移液器轻轻吸打混匀(请勿振荡混匀)，短暂离心将反应液收集至管底。37℃反应30min；降至4℃或立即置于冰上冷却。
将同源重组反应结束的AcCNGC2-YFPN和AcCNGC2-YFPC转化DH5α大肠杆菌，37℃下倒置培养12h，挑单菌落摇菌。分别进行菌液PCR验证以及双酶切鉴定(图20)，鉴定结果与目的条带一致，故载体构建成功。
利用Omega Plasmid Mini Kit I提取AcCNGC2-YFPN和AcCNGC2-YFPC重组质粒并转化农杆菌。菌液于50ml LB(含50mg/L Kan和25mg/L Rif)过夜培养至OD600为1.0左右，将农杆菌菌液5000rpm离心10min，用侵染液(含0.5M MES，10mM MgCl2和120μMAS)重悬菌液，调OD600至0.8左右，室温静置4h。将AcCNGC2-YFPN和AcCNGC2-YFPC；YFPN和YFPC、AcCNGC2-YFPN和YFPC、YFPN和AcCNGC2-YFPC分别两两等体积混合后注射到烟草叶片中，经过暗处理后于激光共聚焦显微镜下观察融合载体表达情况。如图21所示，AcCNGC2-YFPN和AcCNGC2-YFPC能观察到较强的荧光，其他对照组均无明显荧光。结果表明，AcCNGC2和其自身存在互作。洋葱AcCNGC2基因可能由自身形成复合体，形成Ca2+通道，在植物受到生物和非生物胁迫时介导Ca2+内流，激发下游信号，提高植物抗性。
应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非用于限制本发明，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种洋葱AcCNGC2基因，其特征在于，所述洋葱AcCNGC2基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述洋葱AcCNGC2基因的应用，其特征在于，所述应用是通过在烟草中过表达洋葱AcCNGC2基因提高烟草抗烟草疫霉能力。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述提高烟草抗烟草疫霉能力是指促进烟草疫霉入侵早期烟草细胞的Ca2+内流，促进烟草疫霉入侵烟草后细胞中活性氧积累。
4.一种含有权利要求1所述洋葱AcCNGC2基因的重组载体的应用，其特征在于，所述应用是提高烟草抗烟草疫霉能力。
5.一种含有权利要求1所述洋葱AcCNGC2基因的重组菌的应用，其特征在于，所述应用是提高烟草抗烟草疫霉能力。
6.权利要求1所述洋葱AcCNGC2基因的应用，其特征在于，所述应用是通过在烟草中过表达洋葱AcCNGC2基因提高烟草耐低温能力。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述提高烟草耐低温能力是指降低烟草低温胁迫下的膜脂过氧化程度，降低低温胁迫对烟草细胞膜的损伤，提高低温胁迫下烟草细胞中叶绿素含量。
8.一种含有权利要求1所述洋葱AcCNGC2基因的重组载体的应用，其特征在于，所述应用是提高烟草耐低温能力。
9.一种含有权利要求1所述洋葱AcCNGC2基因的重组菌的应用，其特征在于，所述应用是提高烟草耐低温能力。
10.权利要求1所述洋葱AcCNGC2基因的应用，其特征在于，所述应用是培育具有烟草疫霉抗性或/和耐低温能力的洋葱品种。
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