CN114685631B

CN114685631B - 樟疫霉效应子蛋白scr93258及其应用

Info

Publication number: CN114685631B
Application number: CN202210450845.5A
Authority: CN
Inventors: 戴婷婷; 周紫薇; 焦彬彬; 何海彬; 夏宏明
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2022-04-27
Filing date: 2022-04-27
Publication date: 2023-04-14
Anticipated expiration: 2042-04-27
Also published as: CN114685631A

Abstract

本发明公开了一种来源于樟疫霉的SCR效应子蛋白SCR93258及其编码基因和应用。该蛋白的氨基酸序列为SEQIDNo.1，编码改氨基酸的核苷酸序列为SEQIDNo.2，实验证明，该基因控制表达的蛋白质能够参与疫霉侵染本氏烟草的过程，引起凋亡前体蛋白Bax诱导的植物植物细胞死亡。本发明对于充实植物樟疫霉与寄主互作的分子机制，以及建立植物樟疫霉病害的综合防治技术都有重要意义。

Description

樟疫霉效应子蛋白SCR93258及其应用

技术领域

本发明属于樟疫霉效应子技术领域，具体涉及樟疫霉效应子蛋白SCR93258及其应用。

背景技术

病原物可以分泌一种效应子(effector)蛋白，它是改变寄主植物细胞结构和代谢途径从而促进对寄主植物成功侵染或引发寄主防卫反应的一类外分泌蛋白分子。许多植物病原物都能分泌效应子蛋白，比如细菌、真菌、卵菌及线虫中都发现了此类蛋白。植物病原物中存在多类效应子，主要包括质外体效应子和胞质效应子。质外体效应子包括激发子、坏死和乙烯诱导蛋白家族(Necrosis and ethylene-inducing peptide 1-like proteins，NLPs)、PcF/SCR蛋白、纤维素结合激发子凝集素(Cellulose binding elicitor and lectin-like,CBEL)和酶抑制剂。胞质效应子包括RxLR和CRN(Crinkler)蛋白家族。

在长期的协同进化过程中，植物形成了两层防卫机制来抵抗病原菌的侵害。第一层是病原相关分子模式(Pathogen-associated molecularpattern,PAMPs)触发的免疫PTI(PAMP-triggered immunity,PTI)，即植物体细胞膜表面的受体激酶(PRRs)通过识别病原菌相关的分子模式(PAPMs)来激活植物体的基础防卫系统(PTI)。多数情况下，基础防卫反应可阻断病原菌对植物的侵害。有些病原菌可向植物细胞内分泌效应子蛋白来冲破PTI，这时，植物体通过抗病蛋白识别这些效应蛋白从而激活第二层防卫反应机制，即效应子蛋白激发的防卫机制(Effector-triggered immunity,ETI)，激活防卫基因的表达，通常表现为过敏反应(Hypersensitive reaction,HR)，侵染位点细胞死亡。

樟疫霉(Phytophthora cinnamomi)是已知的最具破坏性的植物病原卵菌之一，在世界范围内广泛分布，寄主范围接近5000种。该病原菌除了在农业、林业和园艺方面造成巨大的经济损失之外，无意中被引入对自然生态系统和生物多样性也造成了灾难性的后果。国内外主要采用喷洒农药来控制樟疫霉的流行与危害，都未能达到理想的防治效果，不仅加重了农户的负担，还造成了环境污染。尽管可以通过施用地膜、堆肥等环境友好方式使其他微生物在地膜中增殖分泌纤维素酶来抑制樟疫霉的生长，但樟疫霉的分布规模、在土壤或无症状植物中存活数年的能力，使樟疫霉病害的防治依然面临巨大挑战和困难。

疫霉菌能够产生一种效应子蛋白质——小半胱氨酸富集蛋白(Small cy steine-rich，SCR)，诱导植物致病基因的表达和程序性细胞死亡。疫霉菌通常包括3-19个SCR效应子蛋白。鉴于效应子在病原菌与寄主植物互作中的重要作用，樟疫霉效应子生物学的研究是认识樟疫霉致病机制的关键。

综上所述，根据植物病原卵菌与寄主互作的分子机制，从众多的植物病原樟疫霉菌效应子中可以挖掘出能有效诱导植物细胞凋亡的效应子蛋白，利用其诱导植物细胞死亡和毒性功能，对建立樟疫霉菌病害的综合防治技术策略具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的在于提供具有诱导植物细胞死亡的樟疫霉效应子蛋白SCR93258，其可有效诱导植物细胞死亡的功能。

本发明第一方面，提供了樟疫霉效应子蛋白SCR93258，所述蛋白的氨基酸序列如1)至2)任一所述，

如SEQ ID NO：1所示；

将1)所示的氨基酸序列经一个或几个氨基酸残基的取代/缺失/添加，并具有效应子功能。

本发明第二方面，提供了编码本发明第一方面所述氨基酸的核酸分子，所述核酸分子的序列如下a)至b)任一所示，

如SEQ ID NO：2所示；

在严格条件下可与a)所述的核苷酸序列杂交的核酸序列。

上述SCR93258蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述SCR93258编码基因可通过将序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列缺失一个或几个氨基酸的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上本领域常用的标签编码序列得到。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，SEQ ID NO：2由291个核苷酸组成，第1-291位为ORF，编码序列表中SEQ IDNo.1所示的蛋白质，SEQ ID NO：1由96个氨基酸组成，其中第1-24位氨基酸为信号肽序列。

第三方面，本发明提供了含有本发明第二方面所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

在某些实施例中，所述重组载体为重组过表达载体或重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或抑制型启动子，例如花椰菜花叶病毒35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子、胁迫抑制型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

在某些实施例中，所述重组表达载体中含有35S启动子。

更为具体的，所述重组表达载体为在pGR107载体的酶切位点中插入所述效应子SCR93258(序列表中SEQ ID No.2)得到的重组质粒。所述酶切位点具体为SmaⅠ。

所述表达盒由能够启动所述效应子SCR93258表达的启动子，包括所述效应子SCR93258以及转录终止序列。

第四方面，本发明提供了所述的蛋白或所述的核酸分子，或所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下1)或2)中的应用：

1)诱导植物细胞死亡；

2)制备用于诱导植物细胞死亡的产品。

第五方面，本发明提供了一种用于诱导植物细胞死亡的产品，其活性成分为所述的蛋白，或所述的核酸分子，或所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

在某些实施例中，所述植物细胞来源于双子叶植物或单子叶植物。

在某些实施例中，所述植物具体为双子叶植物烟草，更加具体的为本氏烟(Nicotiana Benthamiana)。

相比于现有技术，本发明的优点为：

本申请通过从樟疫霉众多的效应子中挖掘出能有效诱导植物细胞死亡的樟疫霉效应子蛋白SCR93258，利用其诱导植物细胞死亡的功能可使植物细胞在致死因素存在时失去生理活性，以此为依据，可在森林、林场等场所减少入侵植物得存活率，从而为植物提供更好的生境，为更加全面的了解樟疫霉的基因功能提供了实践应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1是樟疫霉接种寄主后24小时、48小时、96小时与IF(侵染菌丝阶段)的效应子SCR93258的表达水平结果图；

图2是重组表达载体pGR107/SCR93258的质粒图谱图；

图3是效应子SCR93258在烟草叶片中瞬时表达的注射结果观察图；图中，5天后，单独注射GFP后，叶片无任何症状；在对照组叶片中，注射GFP和Bax之后，出现明显小区域坏死；在注射目的效应子SCR93258和Bax之后，叶片坏死面积显著大于对照组和单独注射Bax的叶片，说明效应子SCR93258能够诱导由Bax引起的细胞坏死。

图4是叶片左边单独注射目的效应子SCR93258，右边为对照组单独注射GFP，分别接种樟疫霉三天后叶片的坏死症状，可以看出注射目的效应子SCR93258的叶片坏死面积显著大于对照组，从而发现目的效应子SCR93258能够促进樟疫霉侵染本氏烟草。

图5将图4的叶片进行台盼蓝染色、水合三氯乙醛脱色后，观察叶片的坏死面积发现实验组明显大于对照组，实验结果与图4结果吻合。

图6是利用系统发育树MEGA(v6)中邻接法(Neighbor-Joining,NJ)生成建立的SCR93258在种间和属间的系统发育树(PPTG 08672-t26 1(Phytophthora parasitica寄生疫霉)、PPTG 08671-t26 1(Phytophthora parasitica寄生疫霉)、PITG 19053-t26 1(Phytophthora infestans致病疫霉)、PHPALM 16921-t46 1(Phytophthora palmivora棕榈疫霉)、PHPALM 12555-t46 1(Phytophthora palmivora棕榈疫霉)、PHYCA 511621(Phytophthora capsici辣椒疫霉)、PHYCA 130237(Phytophthora capsici辣椒疫霉)、PHYSODRAFT 379323-t26 1(Phytophthora sojae大豆疫霉)、PPTG 19803-t26 1(Phytophthora parasitica寄生疫霉)、PHPALM 12554-t46 1(Phytophthora palmivora棕榈疫霉)、SCR93258(Phytophthora cinnamomi樟疫霉)、PHYSODRAFT 506943-t26 1(Phytophthora sojae大豆疫霉)、PHYSODRAFT 354716-t26 1(Phytophthora sojae大豆疫霉)、PHYCI 93260(Phytophthora cinnamomi樟疫霉)、PHYCI 92597(Phytophthoracinnamomi樟疫霉)、EPrPVT00000018213(Phytopythium vexans绿脓杆菌))。

图7是利用DNA MAN(v6.0)将效应子SCR93258与5个胞内效应子RxLR效应子(即Avh29、Avh87、Avh49、Avh57、Avh145)进行比对，结果显示基因同源性为22.57％。SCR93258和5个胞内效应子的比对结果差异大，原因主要是SCR93258是质外体效应子，另外5个均为胞内效应子。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

樟疫霉(Phytophthora cinnamomi)菌株：记载于“Sena,KL.variables influencePhytophthora cinnamomi distribution within a forested Kentuckywatershed.Forest Ecology and Management,2019(436):39-44”一文，公众可从运城学院获得。

马铃薯X病毒载(potato Virus X,PVX)pGR107：记载于“NasserBeiczadeh.Investigation on Potato Virus X in North of Khorasan[A].中国植物保护学会.Plant Protection Towards the 21st Century----Proceedings of theInternational Plant Protection Congress[C].中国植物保护学会:中国植物保护学会,2004:1.”一文，公众可从南京林业大学获得。

本氏烟(Nicotiana Benthamiana)：记载于“Louise Jones,Andrew J.Hamilton,Olivier Voinnet,et al.RNA-DNA Interactions and DNA Methylation in Post-Transcriptional Gene Silencing.The Plant Cell,1999(11):2291-2301.”一文，公众可从南京林业大学获得。

农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101：记载于“González-Mula Almudena,Lang Julien,Grandclément Catherine,Naquin Delphine,Ahmar Mohammed,Soulère Laurent,Queneau Yves,Dessaux Yves,Faure Denis.L ifestyle of the biotrophAgrobacterium tumefaciens in the ecological niche constructed on its hostplant.[J].The New phytologist,2018.”一文，公众可从南京林业大学获得。

实施例1樟疫霉的效应子蛋白SCR93258编码基因的获得

选取樟疫霉菌株为参试材料，根据已报道的效应子蛋白基因信息分析樟疫霉基因组序列，获得樟疫霉全基因组中效应子蛋白基因。然后再根据获得的基因片段设计引物p1和p2，扩增筛选获得的目的基因片段。

1.采用CTAB-SDS法提取高质量樟疫霉菌基因组DNA

樟疫霉菌株于固体V8培养基平板培养(配方：170ml V8蔬菜汁加1.6g碳酸钙，混匀，2000rpm离心5min取上清，加纯水定容至1L后，加入15g琼脂粉，高压灭菌锅20min备用)，25℃生化培养箱内培养3天后，取3块直径为4mm的菌块移植于盛有100mL液体V8培养基的三角瓶中(配方：70ml V8蔬菜汁加1.6g碳酸钙，混匀，2000rpm离心5分钟取上清，加纯水定容至1L后分装，高压灭菌锅灭菌20min备用)，于25℃生化培养箱培养5天，过滤菌丝，放研钵内加液氮研磨至粉末状。然后按照以下步骤提取参试菌株基因组DNA：

(1)将菌丝粉末转入1.5mL离心管，加入900μL的2％CTAB提取液和90μL 10％SDS，漩涡混匀，于55℃水浴1h，中间每10min上下颠倒几次。12000rpm离心10min。

(2)取上清加等体积酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，12000rpm离心10min。

(3)将上清转移至新管，加等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心5min。

(4)上清转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAc(pH 5.2)，-20℃沉淀(>1h)；12000rpm离心10min，倾去上清，沉淀用70％乙醇洗涤两次，室温晾干。

(5)加20μL灭菌超纯水或TE(pH 8.0)溶解沉淀(含20μg/mL RNase)，37℃处理1h。

取5μL DNA样品于1％琼脂糖凝胶电泳，检测DNA片断长度，然后将DNA置于-20℃冰柜中长期保存备用。

2.PCR扩增目的基因片段

引物为p1和p2，序列如下：

p1：5'-ATGAAGTTCTCGACCGTCTTC-3'(SEQ ID No.3)

p2：5'-TTAGGCGTAGACGCACTTGCC-3'(SEQ ID No.4)

反应体系为：ddH₂O(22μL)，5×CEⅡbuffer(2μL)，上下游引物(p1和p2)各1μL，DNA(5μL)，Pstar Max(25μL)。

PCR反应程序为：98℃5min；98℃30s，55℃30s，72℃1min，循环32次；72℃10min。

取10μL反应产物电泳，确定含目标基因单克隆、测序。借助NCBI中的BLAST程序对获得的基因片段进行同源序列比对，确定目的效应子SCR93258，其核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示，表达蛋白的氨基酸序列SEQ ID No.1所示。

实施例2效应子SCR93258在樟疫霉侵染苹果过程中的表达模式分析

1.樟疫霉菌株侵染苹果

将在4℃冰箱保存的菌丝块置于V8固体培养基上活化，25℃培养24-36h。灭菌培养皿(直径9cm)底部放置一张合适大小的灭菌滤纸，用灭菌水湿润。无菌操作台灭菌。用酒精棉擦拭苹果表面，灭菌。用酒精灯的外焰灭菌切刀的刀口，在苹果的四面切大约1cm2的小方块，去掉果肉。把菌落挑出来放在灭过菌的滤纸上塞到苹果表面的切口里，只塞三面，还有一面做空白固体培养基的对照。用脱脂棉塞住切口，撒点灭菌的自来水。用托盘装入放进恒温培养箱中培养。分别侵染24h，48h，72h，96h后，收集菌丝和果肉，用滤纸吸提取多余的水分，放入液氮中备用。

2.侵染苹果后的RNA提取及表达验证

采用试剂盒中的R6834-01(OMEGA)提取樟疫霉菌株侵染苹果的RNA，经DNaseI(Takara)37℃消化30min后，采用M-MLV(Takara)反转录合成cDNA，经10倍稀释后-20℃保存备用，用于荧光定量分析。采用SYBR荧光染料法，体系参照TaKaRa说明书，毎个样品没置3个重复。

反应体系：2μL反转录产物，引物0.4μL,10μL 2XSYBR Premix Ex Taq II,补水体积至20μL。所用仪器为ABI 7500。Real-Time PCR试剂是TaKaRa的SYBRPremix Ex Taq(Perfect Real Time)。

按照ABI PRISM 7500及TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)的试剂设定反应程序，采用两步法，具体步骤如下：

在延伸阶段检测荧光强度，收集信号，持续40个循环。扩增结束后，做熔解曲线分析以检测扩增产物的特异性，温度为60～95℃。熔解曲线为单峰时用于后续分析。所用引物序列如下：

引物序列

结果如图1，从图中可以看出，樟疫霉侵染寄主后效应子SCR93258在24小时侵染阶段表达量逐渐升高，从24小时侵染阶段到48小时侵染阶段内表达量逐渐降低、在48小时侵染阶段到96小时侵染阶段表达量再次上调。说明效应子SCR93258在侵染后期高量表达。

实施例3效应子SCR93258在烟草体内瞬时表达

1、PVX重组表达载体构建

(1)SmaⅠ酶切PCR扩增目的基因片段SCR93258，回收插入片断，大小约为291bp。

反应体系：ddH₂O(33μL)，SmaⅠ(2μL)，质粒(10μL)，10×cut Buf fer(5μL)。37℃，30min。

(2)与同样酶切的pGR107载体连接，转化大肠杆菌DH5α。

(3)转化后的DH5α经Kan抗性筛选，获得菌落经37℃摇床过夜后提取质粒。

(4)用限制性内切酶SmaⅠ对重组质粒进行酶切鉴定。将酶切初步鉴定正确的重组质粒(得到大小约为10098bp和291bp两个目的条带)送金斯瑞生物有限公司测序。将经测序表明在pGR107载体的酶切位点SmaⅠ之间插入SEQ ID No.2的DNA片段的重组质粒命名为pGR107/SCR93258(质粒图谱如图2所示)。在重组表达载体pGR107/SCR93258中，启动SEQ IDNo.2所示DNA片段转录的启动子为35S启动子。

2、农杆菌转化

2.1重组质粒pGR107/SCR93258提取

(1)将含有重组质粒pGR107/SCR93258的大肠杆菌接种于含适量抗生素的LB培养基中，37℃，220-250rpm震荡培养至对数生长期。

(2)取1～4mL菌液至1.5mL的离心管中，8000rpm离心1min。

(3)去上清，收集菌体。

(4)加入200μL预冷的溶液I(配方：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)，震荡悬浮菌体。

(5)加入400μL新鲜配制的溶液II(配方：0.2M NaCl，1％SDS)，颠倒离心管数次混匀，12000rpm离心5min。

(6)加入300μL预冷的溶液III(配方：3M K⁺，5MAc^-)，颠倒混匀液体，置冰层5min，12000rpm离心5min，上清转入另一只离心管中。

(7)加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇(体积比25:24:1)，震荡混匀，12000rpm离心5min。

(8)上层水相转入另一只离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置10min，12000rpm离心10min，去上清。

(9)沉淀用70％(体积分数)乙醇洗2次，倒置干燥。

(10)回溶于30μLTE(含20μg的RNA酶)中，取5μL电泳检测，其余-20℃下保存。

2.2农杆菌感受态制备

(1)挑农杆菌GV3101单菌落于4ml LB液体培养基2天，28℃下，200rpm震荡培养24h；

(2)取3ml培养液于200ml三角瓶中振荡培养8h至OD＝0.8左右，冰置10min；

(3)分装入50ml离心管中，天平平衡，5000rpm，4℃离心10min；

(4)弃上清，10ml 0℃灭菌超纯水重悬，天平平衡，5000rpm，4℃离心10min；

(5)重复上述过程3次；

(6)弃上清，加入2ml 5％的甘油，用移液器轻轻吸打使细胞重悬；

(7)冰上分装100μL细胞重悬于预冷的1.5ml EP管中；

(8)液氮速冻，于-70℃冰箱保存。

2.3农杆菌感受态细胞电击转化

(1)将电击杯及杯架放在冰上冷却。设置电转化仪参数，电容C＝25电容，电压V＝2.5kV(0.2的电击杯)，脉冲控制单位设定于

(2)在冷却的1.5ml EP管中加入100μL在冰中解冻或新制备的感受态细胞悬浮液和冰中的质粒，轻轻混匀后冰上放置约1min。

(3)将细胞与质粒的混合液转移到冷的电击杯中，轻轻拍打使混合液处于电击杯的底部。

(4)在以上设置的条件下施加一个脉冲，所产生的时间常数为4.8～5.1ms。

(5)立即加入1ml LB培养液至电击杯中(置于室温)。重新悬浮细胞并转移到17mm×100ml的EP管中，200rpm,30℃恢复培养3h。

(6)5000rpm离心3min收集细胞，以合适的稀释度涂布在含有卡那霉素的LB选择性平板上。30℃培养2d后长出的菌落即为阳性克隆。

3重组农杆菌阳性转化子注射本氏烟幼苗叶片

以本氏烟(Nicotiana Benthamiana)为供试植物。用牙签挑取步骤2筛选并鉴定阳性的重组农杆菌转化子单菌落GV3101/pGR107/SCR93258、pGR107/GFP(阴性对照)、pGR107/Bax分别接种于LB液体培养基(含kan和利福平各50mg/ml)，30℃培养48h。将阳性克隆于3ml添加kanamycin(50μg/ml)的LB培养液中，200rpm，30℃培养48h，5000rpm离心3min收集菌体，用10mM MgCl₂重悬，重复三次后，用10mM MgCl₂定容至OD600＝0.4。试验使用温室(22-25℃，高光强度)中生长4到6周的本氏烟，从上数第三至第六片叶被用于渗透接种农杆菌。用针头在烟草下表皮造成一小伤口，用1mL无针头的注射器将100μl携带有效应分子(pGR107::SCR93258)的农杆菌悬液渗透到本氏烟叶片中。图中分别为转化GFP(pGR107::GFP)的农杆菌作为阴性对照；GFP与含Bax(pGR107::Bax)基因的农杆菌菌悬液同时注射作为阳性对照；单独注射效应分子SCR93258(SCR93258)；将含候选基因的农杆菌菌悬液与含Bax基因的农杆菌菌悬液同时注射(SCR93258+Bax)；转化Bax农杆菌作为阳性对照。接种后的烟草叶片于空气湿度75％的22℃培养箱中黑暗培养2天后，转入人工气候室培养，接种后每天观察记录接种部分的症状变化，至第5天为止。图2效应子SCR93258在烟草叶片中瞬时表达的注射结果观察图；5天后，单独注射GFP的叶片部位无任何症状；在对照组叶片中，注射GFP和Bax区域出现明显坏死作为阳性对照结果；同时在注射目的效应子SCR93258和Bax之后，叶片坏死面积显著大于对照组和单独注射Bax的叶片。说明效应子SCR93258能够促进由Bax引起的细胞坏死。

实施例4效应子SCR93258毒力的测定

如图4所示，叶片左边单独注射目的效应子SCR93258，右边为对照组单独注射GFP，分别接种樟疫霉三天后叶片的坏死症状，可以看出注射目的效应子SCR93258的叶片坏死面积显著大于对照组，从而发现目的效应子SCR93258能够促进樟疫霉侵染本氏烟草。图5是将图4的叶片进行台盼蓝染色、水合三氯乙醛脱色后，观察叶片的坏死面积发现实验组明显大于对照组，实验结果与图4结果吻合。

实施例5效应子SCR93258在种间和属间的系统发育树

通过疫霉信息资源网站(https://fungidb.org/fungidb/app/)下载SCR93258基因及相关同源基因(Phytophthora cinnamomi(樟疫霉)、Phytophthora sojae(大豆疫霉)、Phytophthora infestans(致病疫霉)、Phytopythium vexans(绿脓杆菌)等)序列，利用MEGA(7.0.20)软件，采用邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建系统进化树，利用bootstrap法对进化树的可靠性进行评估，bootstrap值为1000，其余参数设置为默认，最终生成建立了SCR93258在种间和属间的系统发育树，如图6所示。

实施例6效应子SCR93258与5个胞内效应子RxLR效应子的同源性分析图

通过疫霉信息资源网站(https://fungidb.org/fungidb/app/)下载效应子SCR93258及5个胞内效应子RxLR效应子(即Avh29、Avh87、Avh49、Avh57、Avh145)，利用DNAMAN(v6.0)将SCR93258与5个胞内效应子RxLR效应子进行比对，结果显示基因同源性为22.57％。SCR93258和5个胞内效应子的比对结果差异大，原因主要是SCR93258是质外体效应子，另外5个均为胞内效应子。如图7所示。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 樟疫霉效应子蛋白SCR93258及其应用

<130> 202204

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 96

<212> PRT

<213> 樟疫霉(Phytophthora cinnamomi)

<400> 1

Met Lys Phe Ser Thr Val Phe Thr Ala Ala Val Val Ala Val Val Cys

1 5 10 15

Leu Leu Gln Pro Ser Ala Ala Glu Asp Gln Ala Ser Val His Leu Arg

20 25 30

Val His Thr Val Glu Gln Ser Pro Asn Gly Ala Ile Cys Tyr Lys Ala

35 40 45

Cys Pro Ser Gly Gln Tyr Cys Pro Arg Gly Glu Asn Ala Cys Arg Ala

50 55 60

Pro Thr Gly Lys Gln Cys Phe Asn Pro Ala Thr Ser Leu Phe Ile Asn

65 70 75 80

Gly Cys Asp Arg Gly Phe Lys Cys Ser Asn Gly Lys Cys Val Tyr Ala

85 90 95

<210> 2

<211> 291

<212> DNA

<213> 樟疫霉(Phytophthora cinnamomi)

<400> 2

atgaagttct cgaccgtctt caccgccgcc gtcgtcgccg tcgtgtgcct gctgcagccc 60

tcggccgccg aggaccaggc ctcggtgcac ctccgcgtgc acaccgtcga gcagagcccc 120

aacggcgcga tctgctacaa ggcctgccac tcgggccagt actgcccgcg tggcgagaac 180

gcctgccgtg cccccacggg caagcagtgc ttcaacccgg ccacgagcct cttcatcaac 240

ggctgcgacc gcggcttcaa gtgcagcaac ggcaagtgcg tctacgccta a 291

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

atgaagttct cgaccgtctt c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

ttaggcgtag acgcacttgc c 21

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

ctagcatcga ttcccgggga ccaggcctcg gtgcacctc 39

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

ctctagagga tccccggggg cgtagacgca cttgccgtt 39

Claims

1.樟疫霉效应子蛋白SCR93258在诱导烟草细胞死亡或制备用于诱导烟草细胞死亡的产品中的应用，其特征在于，所述樟疫霉效应子蛋白SCR93258的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述樟疫霉效应子蛋白SCR93258的核酸分子序列如SEQ ID NO：2所示。

3.含有权利要求2中所述的编码所述樟疫霉效应子蛋白SCR93258的核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在诱导烟草细胞死亡或制备用于诱导烟草细胞死亡的产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重组载体为重组过表达载体或重组克隆载体。