CN113105533B - 樟疫霉效应子蛋白Avh49及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来源于樟疫霉的效应子蛋白Avh49及其编码基因和应用。该蛋白是具有序列表中的SEQIDNO：1的氨基酸序列。实验证明，该基因控制表达的蛋白质能够参与樟疫霉侵染本氏烟草的过程，具有诱导植物细胞死亡的功能。本发明对于充实植物病原卵菌与寄主互作的分子机制资料信息，以及建立植物病原卵菌病害的综合防治技术策略均有重要意义。

Description

樟疫霉效应子蛋白Avh49及其应用

技术领域

本发明属于樟疫霉效应子技术领域，具体涉及一种樟疫霉效应子蛋白Avh49及其应用。

背景技术

樟疫霉(Phytophthora cinnamomi)是已知的最具破坏性的植物病原卵菌之一，在世界范围内广泛分布，寄主范围接近5000种。作为一类半活体营养的病原卵菌，樟疫霉在侵染寄主的初期营活体营养，待成功侵入之后转入死体营养阶段。这就意味着在和寄主互作中樟疫霉可能通过复杂的过程来操纵植物的细胞死亡；在活体营养阶段，抑制寄主细胞死亡被认为是重要的侵染策略；而在向死体营养阶段的转换过程中，植物程序性细胞死亡则可能被其利用以适应致病过程和完成生活史。疫霉菌在形态上类似丝状真菌，但在进化和遗传背景上差距较大，因此传统的杀真菌剂对其作用不明显。目前我国生产上主要依靠抗病品种和国外专利农药进行防治，成本较高。疫霉菌在林间变异迅速、复杂，一般抗病品种推广8～15年后就会丧失抗性。目前为止所有的已知抗病基因均被疫霉菌攻克，迫切需要拓宽新的抗病基因资源。

在与植物的互作过程中，疫霉菌分泌大量的效应子(Effector) 来调控植物的生长发育及免疫反应以利于自身的侵染，是疫霉菌分泌到细胞外攻击寄主的关键武器。绝大多数动植物病原物通过各种机制输送分泌效应蛋白到寄主植物细胞内，从而对于寄主细胞的生化、生理过程及细胞代谢等产生显著影响，促进自身的侵染或者激活寄主的防卫反应。效应子基因在植物互作过程中具有重要意义。现有技术中报道，樟疫霉效应子蛋白Avh87基因能够诱导凋亡前体蛋白Bax诱导的植物细胞死亡，但是仅一个效应子蛋白对于樟疫霉致病过程仅侵染机理的研究是远远不够的，且不同效应子蛋白的结构也完全不同。

综上所述，深入了解樟疫霉的致病过程和侵染机理，针对性的开发新的农药靶标和防治策略，是亟待研究的课题。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的在于提供具有诱导植物细胞凋亡的樟疫霉效应子蛋白Avh49，其可有效诱导植物细胞凋亡。本发明还有一目的是提供该蛋白的编码基因及其重组载体，可以用于转基因植物或诱导植物细胞死亡的产品。

第一方面，本发明提供了樟疫霉效应子蛋白Avh49，所述蛋白如 1)至3)任一所示，

1)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

MRRNLARLLIAAALLTVASEALSTVTDEEQAQISELGEEVIIRP KRLLRAVSKIDEDEERAILGEQVLLKWSKLAEKHNLQTLSKKLAD KAWLTGKKADHKAWLKAGKNPQDKFKEYGWKGKAWEELKKDP RYARYDGFDDAWMKKQRKKGTIHTVDNWIKLWNEQQKKAAG(S EQ ID NO：1)

2)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

3)将1)或2)所示的氨基酸序列经一个或几个氨基酸残基的取代/缺失/添加，并具有效应子功能的蛋白质。

上述Avh49蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述Avh49编码基因可通过将序列表中SEQ ID NO： 2所示的核苷酸序列缺失一个或几个氨基酸的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上本领域常用标签的编码序列得到。

第二方面，本发明提供了编码上述第一方面所述蛋白的核酸分子，所述核酸分子如下a)至b)任一所示，

a)核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

ATGCGACGGAACTTGGCTCGGCTGCTGATCGCGGCTGCCC TCCTCACAGTCGCGAGCGAGGCACTCTCAACGGTCACCGATGA GGAGCAAGCCCAGATTTCCGAGCTCGGTGAGGAAGTAATCATC AGACCCAAGAGGCTCTTAAGAGCAGTCAGCAAGATTGATGAGG ACGAAGAGCGGGCCATTTTAGGAGAGCAGGTGCTGCTGAAGTG GAGCAAGCTCGCCGAAAAGCATAATTTGCAAACCCTTTCGAAG AAACTGGCGGACAAGGCCTGGCTGACTGGAAAGAAGGCGGAC CACAAGGCATGGCTGAAAGCAGGGAAAAATCCACAGGACAAA TTCAAGGAATACGGCTGGAAGGGGAAGGCCTGGGAAGAGCTG AAGAAAGATCCGAGGTACGCGCGCTACGACGGGTTCGACGACG CGTGGATGAAAAAACAACGCAAGAAGGGCACCATCCATACTGT TGATAATTGGATAAAATTGTGGAACGAGCAGCAGAAGAAAGCCGCTGGGTAA(SEQ ID NO：2)

b)在严格条件下可与a)所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，SEQ ID NO：2由519个核苷酸组成，第1-516位为OR F，编码序列表中SEQ IDNO:1所示的蛋白质，SEQ ID NO:1共由 172个氨基酸组成，其中第1-23位氨基酸为信号肽序列。

第三方面，本发明提供了含有上述第二方面所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

在某些实施例中，所述重组载体为重组过表达载体或重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒35S启动子、泛素基因U biquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以确保整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

在某些实施例中，所述重组表达载体中含有35S启动子。

在某些实施例中，所述重组表达载体是在pGR107载体的酶切位点中插入所述Avh49基因(序列表中SEQ ID NO：2)得到的重组质粒。所述具体的酶切位点为SmaⅠ。

在某些实施例中，所述表达盒由能够启动所述Avh49基因表达的启动子，包括所述Avh49基因以及转录终止序列。

所述表达盒由能够启动所述Avh49基因表达的启动子，所述Av h49基因，以及转录终止序列组成。

第四方面，上述第一方面提供的蛋白或上述第二方面提供的核酸分子，或上述第三方面提供的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下1)或2)中的应用：

1)诱导植物细胞死亡；

2)制备用于诱导植物细胞死亡的产品。

第五方面，本发明提供了一种用于诱导植物细胞死亡的产品，其活性成分为第一方面所述的蛋白，或第二方面所述的核酸分子，或第三方面所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

在某些实施中，所述植物细胞来源于双子叶植物或单子叶植物。

在某些实施中，所述双子叶植物为烟草，更加具体的为本氏烟(N icotianaBenthamiana)。

所述Avh49蛋白具体为将序列表中序列表中SEQ ID NO：2所示的全部DNA片段插入到pGR107载体的酶切位点SmaⅠ之间后表达得到的蛋白。

同时以农杆菌GV3101为宿主、利用PVX病毒表达载体对该基因进行瞬时表达，采用注射接种法接种本氏烟草(Nicotiana.Bentham iana)，证明了效应子蛋白Avh49具有诱导植物组织细胞死亡乃至使受害部位产生明显坏死症状的功能。

相比于现有技术，本发明的优点为：

本申请通过从樟疫霉众多的效应子中挖掘出能有效诱导植物细胞死亡的效应子蛋白Avh49，对建立樟疫霉菌病害的综合防治技术策略具有重要意义，通过在樟疫霉疫情发生时降低植物死亡率，对减少或消除疫情的影响具有重大应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1是RXLR效应子的结构域示意图。

图2是基于樟疫霉RXLR效应分子的变种之间系统进化树。

图3是Avh49在菌丝和侵染24小时、48小时、96小时基因的表达量比较。

图4是重组表达载体pGR107/Avh49的质粒图谱图。

图5是Avh49重组载体测序结果比对图。

图6是Avh49基因于烟草叶片中诱导Bax引起的细胞死亡结果图。无论效应基因Avh49与Bax同时注射，还是先注射Avh49，延时 12h注射Bax的处理中，Avh49都能够诱导Bax的植物细胞死亡。试验重复两次，试验结果相同。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

樟疫霉(Phytophthora cinnamomi)菌株：记载于“Sena,KL.va riablesinfluence Phytophthora cinnamomi distribution within a forest ed Kentuckywatershed.Forest Ecology and Management,2019(436): 39-44”一文，公众可从南京林业大学获得。

马铃薯X病毒载体(potato Virus X,PVX)pGR107：记载于“N asserBeiczadeh.Investigation on Potato Virus X in North of Khora san[A].中国植物保护学会.Plant Protection Towards the 21st Centu ry----Proceedings of theInternational Plant Protection Congress[C]. 中国植物保护学会:中国植物保护学会,2004:1.”一文，公众可从南京林业大学获得。

本氏烟(Nicotiana Benthamiana)：记载于“Louise Jones,Andre w J.Hamilton,Olivier Voinnet,et al.RNA-DNA Interactions and DNA Methylation in Post-Transcriptional Gene Silencing.The Plant Cell,1999(11):2291-2301.”一文，公众可从南京林业大学获得。

农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101：记载于“González- MulaAlmudena,Lang Julien,Grandclément Catherine,Naquin Delp hine,Ahmar Mohammed,Soulère Laurent,Queneau Yves,Dessaux Yves,Faure Denis.Lifestyle of thebiotroph Agrobacterium tumefa ciens in the ecological niche constructed onits host plant.[J].The New phytologist,2018.”一文，公众可从南京林业大学获得。

实施例1樟疫霉的效应子蛋白Avh49编码基因的获得

选取樟疫霉菌株为试验材料，根据樟疫霉全基因组序列获得效应基因Avh49基因序列。然后再根据获得的基因片段设计引物p1和p2，扩增筛选获得的目的基因片段。

1.采用CTAB-SDS法提取高质量樟疫霉菌基因组DNA

樟疫霉菌株于固体V8培养基平板培养(配方：340ml V8果汁加3.4g碳酸钙，玻璃棒搅拌混匀，两层滤布过滤收集液体，添加九倍体积的纯水稀释，取200ml于250ml的锥形瓶中，加入3g的琼脂粉，121℃灭菌20min备用。)25℃恒温培养箱内培养3天后，取8-1 2块1mm的方形小菌块移植于盛有100mL液体V8培养基的锥形瓶中(配方：一瓶340ml的V8果汁，加入3.4g的CaCO₃，玻璃棒搅拌混匀，两层滤布过滤收集液体，添加九倍体积的纯水稀释，取200ml 于250ml的锥形瓶中，121℃灭菌20min备用。)于25℃恒温培养箱培养3天，过滤菌丝，放研钵内加液氮研磨至粉末状。然后按照以下步骤提取参试菌株基因组DNA：

(1)在1.5ml EP管中加入适量菌丝粉(或菌丝加石英砂在液氮中研磨成的粉末)，加900μL的2％CTAB和90μL 10％的SDS，震荡使混匀，60℃水浴1小时，期间不停颠倒EP管，12000rpm离心10 分钟；

(2)取上清700μL移至新的1.5ml EP管加等体积氯仿，颠倒使充分混匀，12000rpm离心10min；

(3)取上清500μL转移至新的1.5ml EP管，加等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心10min；

(4)取上清450μL转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇和0.1 倍体积的氯仿，混匀后，-20℃沉淀(>1h)；12000rpm离心10mi n，倾去上清，沉淀用800μL75％乙醇洗涤两次，12000rpm离心5分钟；

(5)弃上清，将管倒置于吸水纸上使液体流尽，37℃放置10分钟；

(6)加20μL灭菌超纯水或TE(pH 8.0)溶解沉淀(含20μg/ mL RNase)，再加入1μL的RNase液，37℃处理1h。

(7)取5μL DNA样品于1％琼脂糖凝胶电泳，检测DNA片段长度，然后将DNA置于-20℃冰柜中长期保存备用。

2.PCR扩增目的基因片段

反应体系为：ddH₂O(22μL)，5×CEⅡbuffer(2μL)，上下游引物各1μL，DNA(5μL)，Pstar Max(25μL)。

PCR反应程序为：98℃5min；98℃30s，55℃30s，72℃1m in，循环32次；72℃延伸10min。

取10μL反应产物电泳，确定含目标基因单克隆、测序。借助N CBI中的BLAST程序对获得的基因片段进行同源序列比对，确定目的基因Avh49。基因Avh49(SEQ ID NO：2)由519个核苷酸组成，第1-516位为ORF，编码SEQ ID NO：1所示的蛋白质，如图 1所示，SEQ ID NO：1共由172个氨基酸组成，其中第1-23位氨基酸为信号肽序列。

实施例2不同效应子蛋白之间同源性分析

根据针对樟疫霉基因组信息的分析发现，将本研究中克隆的Av h49所编码的氨基酸序列和樟疫霉(P.cinnamomi)、樟疫霉刺槐变种 (P.cinnamomi var.robiniae)以及樟疫霉变种(P.cinnamomi var. parvispora)的其它效应分子进行比对，结果显示，PcinnAvh49与其余效应子蛋白的同源性并不高，如图2所示，可见，效应子蛋白彼此之间并不存在研究的可参照性，需要采用生物信息学分析以及基因蛋白的功能性实验验证，才能确定每一个效应子蛋白的功能。

实施例3Avh49基因在樟疫霉侵染苹果过程中的表达模式分析

1.樟疫霉菌株侵染苹果

将在4℃冰箱保存的菌丝块置于V8固体培养基上活化，25℃培养3d。灭菌培养皿底部放置一张合适大小的灭菌滤纸，用灭菌水湿润。用酒精棉擦拭苹果表面。使用手术刀在苹果的三面切大约1cm2、厚度1cm的小方块，去除果肉。把菌饼挑出，塞到苹果表面的切口里，只塞两面，还有一面做固体培养基的空白对照。用脱脂棉塞住切口，滴撒灭菌的自来水。用托盘装入放进恒温培养箱中培养。分别侵染24h，48h，72h，96h后，收集菌丝和果肉，用滤纸吸提取多余的水分，放入液氮中备用。

2.侵染苹果后的RNA提取及表达验证

用樟疫霉菌丝侵染苹果，设置侵染时间0h、24h、48h、96h，分别提取各阶段菌丝RNA进行转录表达分析。

采用试剂盒中的R6834-01(OMEGA)提取樟疫霉菌株侵染苹果的RNA，经DNaseI(Takara)37℃消化30min后，采用M-MLV(Tak ara)反转录合成cDNA，经10倍稀释后-20℃保存备用，用于荧光定量分析。

采用SYBR荧光染料法，体系参照TaKaRa说明书，毎个样品设置3个重复。

反应体系：2μL反转录产物，引物0.4μL,10μL 2XSYBR Pr emix Ex Taq II,补水体积至20μL。

所用仪器为ABI 7500。

Real-Time PCR试剂是TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq(Perfec t Real Time)。其体系为：

按照ABI PRISM 7500及TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq(Pe rfect Real Time)的试剂设定反应程序，采用两步法，具体步骤如下：

Stage 1：预变性，Reps：1，95℃30秒；

Stage 2：PCR反应，Reps：40，95℃5秒，60℃34秒；

Stage 3：解离阶段，95℃15秒，60℃1分钟，95℃15秒。

在延伸阶段检测荧光强度并收集信号，持续40个循环。扩增结束后，做熔解曲线分析以检测扩增产物的特异性，温度为60～95℃。熔解曲线为单峰时用于后续分析。所用引物序列如下：

引物序列

结果如图3，从图中可以看出，樟疫霉侵染寄主后Avh49基因在最初侵染阶段高度表达，在24h时降至最低点，在48h时升至最高点，在96h时表达量快速降低，但表达量大于24h。说明Avh49基因在侵染前期高量表达，在侵染中期表达量下降，在侵染后期表达量降低。

实施例4Avh49基因在烟草体内瞬时表达

1.PVX重组表达载体构建

(1)SmaⅠ酶切PCR扩增目的基因片段Avh49，回收插入片段。

1)设计引物

在JGI网站获取CDS编码区(https://mycocosm.jgi.doe.gov/pages /search-for-genes.jsf？organism＝Phyci1)，去除信号肽和终止子，设计引物(Avh49-F、Avh49-R)。

2)效应子基因的克隆(50μL体系)

之后在PCR仪中，按如下设定：

第二至第四步：32cys

跑胶，根据效应子基因长度选择合适的Marker，试剂盒直接回收。

3)酶切PVX载体

4)连接

注：最适克隆载体使用量为100ng，最适插入片段使用量为16～ 24ng。然后37℃，30min；冰置5min。反应产物直接进行转化；也可以储存于-20℃，待需要时解冻转化。

5)大肠杆菌的转化

1.在50μL的大肠杆菌感受态中加入5μL的反应产物，轻弹使混匀，冰置30min；

2.水浴锅中42℃热激90s，冰水浴2min；

3.加入900μL无抗LB液体，37℃，10min，然后37℃，220rpm， 45min；

4.离心机中5000rpm，5min，之后吸取100μL上清液，然后弃去离心管中全部上清，将吸取的100μL上清与底部沉淀混匀，涂板于含 K的固体LB培养板，37℃过夜培养。

6)菌落PCR验证(20μL体系)

以生长出的单一菌落作为模板，使用PVX载体

上游引物LBA：5’-CAATCACAGTGTTGGCTTGC-3’(SEQ ID NO:5)

下游引物LBB：5’-GACCCTATGGGCTGTGTTG-3’(SEQ ID N O:6)

用PCR扩增目的片段的方法挑选阳性克隆。同时将菌落分别划到含有K的固体LB平板上，37℃倒置过夜培养。

之后在PCR仪中，按如下设定：

第二至第四步：33cys

电泳检测PCR产物片段大小，当片段大小与预测值近似时，将产物送金斯瑞生物有限公司进行测序。将经测序表明在pGR107载体的酶切位点SmaⅠ之间插入SEQ ID NO：2的DNA片段的重组质粒命名为pGR107/Avh49(质粒图谱如图4所示)。在重组表达载体pG R107/Avh49中，启动SEQ ID NO：2所示DNA片段转录的启动子为35S启动子。PVX:Avh49送去测序的两个质粒中PVX:Avh49-1 的序列结果与理论序列完全相同，则认为PVX:Avh49的这个质粒载体是构建成功的，可以进行后续的实验步骤(如图5所示)。

2.农杆菌转化

2.1重组质粒pGR107/Avh49提取

(1)将含有重组质粒pGR107/Avh49的大肠杆菌接种于含适量抗生素的LB培养基中，37℃，220-250rpm震荡培养至对数生长期。

(2)取1～4mL菌液至1.5mL的离心管中，8000rpm离心 1min。

(3)去上清，收集菌体。

(4)加入200μL预冷的溶液I(配方：50mM葡萄糖，25m M Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)，震荡悬浮菌体。

(5)加入400μL新鲜配制的溶液II(配方：0.2M NaCl，1％ SDS)，颠倒离心管数次混匀，12000rpm离心5min。

(6)加入300μL预冷的溶液III(配方：3M K⁺，5M Ac^-)，颠倒混匀液体，置冰层5min，12000rpm离心5min，上清转入另一只离心管中。

(7)加入等体积氯仿，震荡混匀，12000rpm离心5min。

(8)上层水相转入另一只离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置10min，12000rpm离心10min，去上清。

(9)沉淀用70％(体积分数)乙醇洗2次，倒置干燥。

(10)回溶于30μL TE(含20μg的RNA酶)中，取5μL电泳检测，其余-20℃下保存。

2.2农杆菌GV3101感受态细胞的制备

(1)活化：取农杆菌GV3101甘油菌(保存时用50％甘油，和菌液1：1保存)，在无抗固体LB培养基上划板，30℃黑暗培养2d；

(2)摇菌：挑取单菌落于3ml的LB液体培养基中，200rpm，3 0℃，过夜摇培(36-48h)；

(3)扩培：按照1：100的比例，吸取2ml摇培的菌液，加至含 10％利福平的100ml液体LB培养基中，200rpm，30℃培养，约5h 后测定OD值(3h时测定一次OD值)；待菌液OD＝0.6，冰置10mi n，4℃预冷离心机；

(4)集菌：将菌液分装至50ml离心管中，3000g，4℃离心10 min，弃上清；

(5)洗菌：用10ml的10％甘油重悬菌体，3000g，4℃离心10 min，弃上清；加入30ml的10％的甘油，3000g，4℃离心10min，弃上清，重复三次；

(6)溶菌：加入10ml的10％甘油，洗涤所有管中菌体，收集于一管，立即在冰上分装至1.5ml离心管中，每管50μL；

(7)分装：-80℃保存或立即用于转化。

2.3农杆菌感受态细胞电击转化

取感受态细胞液，冰上解冻10min；无水乙醇清洗电击杯三次，风机吹干，(紫外杀菌)置于冰上冷却；在感受态细胞液中加入3μL 质粒，将全部液体转移至电击杯中；电击仪参数：U：2000V；R：8 00Ω；C：25μF；电击后添加含有800μL的无抗LB液体，抽打混匀，转移至1.5ml离心管中，30℃，220rpm，3h；高速离心机中12000rp m，1min，弃上清，将剩余液体与沉淀抽打，涂板于含K和利福平的 LB板上，30℃培养2d观察生长情况，4℃保存；通过PCR菌落验证，观察质粒是否成功转入，将阳性转化子保存备用。

实施例5重组农杆菌阳性转化子注射本氏烟幼苗叶片

以本氏烟(Nicotiana Benthamiana)为供试植物。

(1)将含有目的质粒的农杆菌接种到含K和利福平的4ml液体 LB培养基中，200rpm，28℃，16-20h；

(2)取2ml培养液于2ml EP管中，5000rpm，3min，弃上清，用1ml 10mM MgCl₂震荡悬浮菌液，重复三次；

(3)将重悬菌液稀释20倍测定OD600值，将OD600值调至0. 6；

(4)在生长6-8周的本氏烟草从上到下第3-6片叶片背面注射农杆菌；

注射方法：将重悬农杆菌菌悬液用1mL注射器渗透到本氏烟叶片中。先注射含候选基因Avh49的农杆菌菌悬液，12h后注射含Ba x的农杆菌菌悬液。注射含GFP的农杆菌作为阴性对照，含Bax的农杆菌作为阳性对照。注射后5天观察本氏烟叶片坏死情况。

结果如图6所示，在烟草叶片上接种pGR107/Avh495d后，叶片产生明显黄斑；接种pGR107/Avh49+pGR107/Bax 5d后，叶片产生大面积黄斑，随时间增长叶片呈现坏死症状，叶片坏死面积略大于单独注射pGR107/Avh49的试验组；对照组接种pGR107/GFP 5天后，叶片无症状。试验重复两次，试验结果相同。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 樟疫霉效应子蛋白Avh49及其应用

<130> 2021

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 172

<212> PRT

<213> Phytophthora cinnamomi

<400> 1

Met Arg Arg Asn Leu Ala Arg Leu Leu Ile Ala Ala Ala Leu Leu Thr

1 5 10 15

Val Ala Ser Glu Ala Leu Ser Thr Val Thr Asp Glu Glu Gln Ala Gln

20 25 30

Ile Ser Glu Leu Gly Glu Glu Val Ile Ile Arg Pro Lys Arg Leu Leu

35 40 45

Arg Ala Val Ser Lys Ile Asp Glu Asp Glu Glu Arg Ala Ile Leu Gly

50 55 60

Glu Gln Val Leu Leu Lys Trp Ser Lys Leu Ala Glu Lys His Asn Leu

65 70 75 80

Gln Thr Leu Ser Lys Lys Leu Ala Asp Lys Ala Trp Leu Thr Gly Lys

85 90 95

Lys Ala Asp His Lys Ala Trp Leu Lys Ala Gly Lys Asn Pro Gln Asp

100 105 110

Lys Phe Lys Glu Tyr Gly Trp Lys Gly Lys Ala Trp Glu Glu Leu Lys

115 120 125

Lys Asp Pro Arg Tyr Ala Arg Tyr Asp Gly Phe Asp Asp Ala Trp Met

130 135 140

Lys Lys Gln Arg Lys Lys Gly Thr Ile His Thr Val Asp Asn Trp Ile

145 150 155 160

Lys Leu Trp Asn Glu Gln Gln Lys Lys Ala Ala Gly

165 170

<210> 2

<211> 519

<212> DNA

<213> Phytophthora cinnamomi

<400> 2

atgcgacgga acttggctcg gctgctgatc gcggctgccc tcctcacagt cgcgagcgag 60

gcactctcaa cggtcaccga tgaggagcaa gcccagattt ccgagctcgg tgaggaagta 120

atcatcagac ccaagaggct cttaagagca gtcagcaaga ttgatgagga cgaagagcgg 180

gccattttag gagagcaggt gctgctgaag tggagcaagc tcgccgaaaa gcataatttg 240

caaacccttt cgaagaaact ggcggacaag gcctggctga ctggaaagaa ggcggaccac 300

aaggcatggc tgaaagcagg gaaaaatcca caggacaaat tcaaggaata cggctggaag 360

gggaaggcct gggaagagct gaagaaagat ccgaggtacg cgcgctacga cgggttcgac 420

gacgcgtgga tgaaaaaaca acgcaagaag ggcaccatcc atactgttga taattggata 480

aaattgtgga acgagcagca gaagaaagcc gctgggtaa 519

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

ctagcatcga ttcccgggat gacggtcacc gatgaggagc 40

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

ctctagagga tccccgggcc cagcggcttt cttctgc 37

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

caatcacagt gttggcttgc 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

gaccctatgg gctgtgttg 19

Claims (7)

1.樟疫霉效应子蛋白Avh49，其特征在于，所述蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.编码权利要求1所述蛋白的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子核苷酸序列如SEQID NO：2所示。

3.含有权利要求2所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为重组过表达载体或重组克隆载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组过表达载体中含有35S启动子。

6.权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的核酸分子，或权利要求3、4或5中任一所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下1）或2）中的应用：

1）诱导烟草细胞死亡；

2）制备用于诱导烟草细胞死亡的产品。

7.一种用于诱导烟草细胞死亡的产品，其活性成分为权利要求1所述的蛋白，或权利要求2所述的核酸分子，或权利要求3-5中任一所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

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