CN113121659B

CN113121659B - 樟疫霉效应子蛋白Avh57及其应用

Info

Publication number: CN113121659B
Application number: CN202110441062.6A
Authority: CN
Inventors: 戴婷婷; 李亚星; 陈贞鹏; 焦彬彬
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2021-04-23
Filing date: 2021-04-23
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2041-04-23
Also published as: CN113121659A

Abstract

本发明公开了一种来源于樟疫霉的效应子蛋白Avh57及其编码基因和应用。该蛋白是具有序列表中的SEQ ID NO：1的氨基酸序列。实验证明，该基因控制表达的蛋白质能够参与樟疫霉侵染本氏烟草的过程，该基因能够抑制凋亡前体蛋白Bax诱导的植物细胞死亡的功能。本发明对于充实植物病原卵菌与寄主互作的分子机制资料信息，以及建立植物病原卵菌病害的综合防治技术策略均有重要意义。

Description

樟疫霉效应子蛋白Avh57及其应用

技术领域

本发明属于樟疫霉效应子技术领域，具体涉及一种樟疫霉效应子蛋白Avh57及其应用。

背景技术

樟疫霉(Phytophthora cinnamomi)是一种全球分布的、具有高度侵袭性的土传病原菌，它可以以不同形态腐生、寄生或专性寄生于土壤及植物组织，通过地表和地下水流动、植物根系相互接触、动物移动及人类活动(修路、伐木、采矿等)传播，因此具有极其广泛的宿主范围。

效应子蛋白(effector)是病原物分泌的可改变寄主植物细胞结构和代谢途径从而促进对寄主植物成功侵染或引发寄主防卫反应的一类外分泌蛋白分子。许多植物病原物都能分泌效应子蛋白，比如细菌、真菌、卵菌及线虫中都发现了此类蛋白。根据效应子在植物体内作用位置的不同，可将其分为两类：一类是在植物细胞质内发挥作用的胞内效应蛋白(Cytoplasmic effectors)，主要包括RxLRs和CRNs；另一类是在植物质外体空间发挥作用的质外体效应蛋白(Apoplastic effectors)，主要包括PcF/SCR,NLP等。

与其他类型病原菌类似，植物病原卵菌在与寄主互作的过程中能够分泌效应子干扰植物的免疫反应，以成功侵染寄主。在植物病原卵菌侵染寄主植物过程中，依据植物的状态划分为活体和死体两个营养阶段，其生活方式多属于半活体营养寄生。在植物病原卵菌侵染的不同时期，植物防卫反应的方式有所不同。植物产生HR反应用于限制病原菌侵染、扩展。此时，病原菌为了进一步生长发育，采用抑制植物HR反应策略，保证植物处于活体状态；然而，当病原菌生长发育到一定阶段，也会促进植物的死亡。在植物病原卵菌的侵染过程中，不同效应子表达受到精细调控，具有不同的功能，其中部分可以调控病原菌在侵染过程中保持结构完整，部分导致寄主产生营养缺陷，部分能够促进病原菌迅速扩张，还有些能够抑制寄主的PTI，协同调控植物的免疫反应，促进病程发展。

综上所述，根据植物病原卵菌与寄主互作的分子机制，从众多的植物病原卵菌效应子中可以挖掘出能有效抑制植物细胞凋亡的效应子蛋白，利用其抑制植物细胞死亡，使植物维持存活状态，对建立樟疫霉菌的综合防治技术策略具有重要意义，对在植物病原卵菌疫情爆发时降低植物死亡率，消除或减少疫情的影响具有重大应用价值。现有技术中记载，樟疫霉效应子蛋白Avh87基因能够诱导凋亡前体蛋白Bax诱导的植物细胞死亡，但是仅一个效应子蛋白对于樟疫霉致病过程仅侵染机理的研究是远远不够的，且不同效应子蛋白的结构也完全不同。因此，深入了解樟疫霉的致病过程和侵染机理，针对性的开发新的农药靶标和防治策略，是亟待研究的课题。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的在于提供具有抑制植物细胞凋亡的樟疫霉效应子蛋白Avh57，其可有效抑制植物细胞凋亡。本发明还有一目的是提供该蛋白的编码基因及其重组载体，可以用于转基因植物或抑制植物细胞死亡的产品。

第一方面，本发明提供了樟疫霉效应子蛋白Avh57，所述蛋白如1)至3)任一所示，

1)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

2)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

3)将1)或2)所示的氨基酸序列经一个或几个氨基酸残基的取代/缺失/添加，并具有效应子功能的蛋白质。

上述Avh57蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述Avh57编码基因可通过将序列表中SEQ ID No：2所示的核苷酸序列缺失一个或几个氨基酸的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上本领域常用标签的编码序列得到。

第二方面，本发明提供了编码上述第一方面所述蛋白的核酸分子，所述核酸分子如下a)至b)任一所示，

a)核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

b)在严格条件下可与a)所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，SEQ ID NO:2由567个核苷酸组成，第1-567位为ORF，编码序列表中SEQ IDNO:1所示的蛋白质，SEQ ID NO:1共由188个氨基酸组成。

MRSTTILLIAVAVLFLGVTNALATVKNANPATMLEAHSPEVNNAFNGKTSLRSLKEVATAEFQGKEDEERAISFSFLERLNKYIPGTKAFTQASAARKAIAQAKKLEKAARKEELAKLFKLDGIQDHQLTSKFETWNNAEISSADVTEGVFKTMKTSKTMKISKAEAVTIGNKYQAWINTMHRKALLP(SEQ ID NO:1)。

atgcgctccaccaccatcctactgattgctgttgcagtcctcttcctcggagttaccaacgcgctcgcgaccgtgaagaatgccaaccctgcaacaatgttggaggctcactcgcctgaagtcaacaacgcgttcaacggcaagacgtccctcaggtctctcaaggaggttgctacggccgagtttcaaggcaaagaagacgaggagagagcgataagtttctcgtttttggaaaggctgaataagtacattccgggaaccaaggctttcactcaggcgtccgctgcacggaaagccatcgcacaagcaaagaagttggagaaggcggccaggaaggaggagctcgcgaagttgttcaaattggatggaattcaagaccaccagcttacttcgaagtttgagacgtggaataacgcggagatatcgtcggctgatgttactgaaggtgtgttcaagacaatgaaaacgagcaagacaatgaaaataagcaaagccgaagctgtcaccattggcaataagtaccaagcgtggatcaacacgatgcatcgaaaagctcttttgccatga(SEQ ID NO:2)。

第三方面，本发明提供了含有上述第二方面所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

在某些实施例中，所述重组载体为重组过表达载体或重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以确保整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

在某些实施例中，所述重组表达载体中含有35S启动子。

在某些实施例中，所述重组表达载体是在pGR107载体的酶切位点中插入所述Avh57基因(序列表中SEQ ID NO：2)得到的重组质粒。所述具体的酶切位点为SmaⅠ。

在某些实施例中，所述表达盒由能够启动所述Avh57基因表达的启动子，包括所述Avh57基因以及转录终止序列。

所述表达盒由能够启动所述Avh57基因表达的启动子，所述Avh57基因，以及转录终止序列组成。

第四方面，上述第一方面提供的蛋白或上述第二方面提供的核酸分子，或上述第三方面提供的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下1)或2)中的应用：

1)抑制植物细胞死亡；

2)制备用于抑制植物细胞死亡的产品。

第五方面，本发明提供了一种用于抑制植物细胞死亡的产品，其活性成分为第一方面所述的蛋白，或第二方面所述的核酸分子，或第三方面所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

在某些实施中，所述植物细胞来源于双子叶植物或单子叶植物。

在某些实施中，所述双子叶植物为烟草，更加具体的为本氏烟(Nicoti anaBenthamiana)。

所述Avh57蛋白具体为将序列表中序列表中SEQ ID NO：2所示的全部DNA片段插入到pGR107载体的酶切位点SmaⅠ之间后表达得到的蛋白。

同时以农杆菌GV3101为宿主、利用PVX病毒表达载体对该基因进行瞬时表达，采用注射接种法接种本氏烟草(Nicotiana.Benthamiana)，证明了效应子蛋白Avh57具有诱导植物组织细胞死亡乃至使受害部位产生明显坏死症状的功能。

相比于现有技术，本发明的优点为：

本申请通过从樟疫霉众多的效应子中挖掘出能有效抑制植物细胞死亡的樟疫霉效应子蛋白Avh57，利用其抑制植物细胞死亡的功能可使植物细胞在致死因素存在时维持存活状态，对建立樟疫霉菌的综合防治技术策略具有重要意义，对在植物病原卵菌疫情爆发时降低植物死亡率，消除或减少疫情的影响具有重大应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1是Avh57在不同物种的同源物的系统发育树。

图2是樟疫霉接种寄主后0小时、12小时、24小时、48小时和96小时的Avh57基因的表达水平结果图。

图3是重组表达载体pGR107/Avh57的质粒图谱图。

图4是Avh57基因于烟草叶片中抑制Bax引起的细胞死亡结果图，空载体pGR107/GFP接种烟草叶片5天后无任何症状，无论是同时将含候选效应基因Avh57的农杆菌与含Bax的农杆菌同时注射，还是延后12h、24h再注射Bax都能够明显的抑制Bax引起PCD。对照处理，无论是同时注射空载体pGR107/GFP与含Bax的农杆菌，还是12小时、24小时再注射Ba x都会引起PCD。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

樟疫霉(Phytophthora cinnamomi)菌株：记载于“Sena,KL.variables influencePhytophthora cinnamomi distribution within a forested Kentuckywatershed.Forest Ecology and Management,2019(436):39-44”一文，公众可从南京林业大学获得。

马铃薯X病毒载体(potato Virus X,PVX)pGR107：记载于“NasserBeiczadeh.Investigation on Potato Virus X in North of Khorasan[A].中国植物保护学会.Plant Protection Towards the 21st Century----Proceedings of theInternational Plant Protection Congress[C].中国植物保护学会:中国植物保护学会,2004:1.”一文，公众可从南京林业大学获得。

本氏烟(Nicotiana Benthamiana)：记载于“Louise Jones,Andrew J.Hamilton,Olivier Voinnet,et al.RNA-DNA Interactions and DNA Methylation in Post-Transcriptional Gene Silencing.The Plant Cell,1999(11):2291-2301.”一文，公众可从南京林业大学获得。

农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101：记载于“González-MulaAlmudena,Lang Julien,Grandclément Catherine,Naquin Delphine,Ahmar Mohammed,Soulère Laurent,Queneau Yves,Dessaux Yves,Faure Denis.Lifestyle of thebiotroph Agrobacterium tumefaciens in the ecological nicheconstructed on itshost plant.[J].The New phytologist,2018.”一文，公众可从南京林业大学获得。

实施例1樟疫霉的效应子蛋白Avh57编码基因的获得

在软件MEGA7中进行系统分析，采用Neighbor-Joining的方法。如图1所示，此图提供了P.cin_Avh57与图中疫霉属的进化关系与关联程度，为P.cin_Avh57基因的研究提供参考。

然后，选取樟疫霉菌株为参试材料，根据已报道的效应子蛋白基因信息分析樟疫霉基因组序列，获得樟疫霉全基因组中效应子蛋白基因。然后再根据获得的基因片段设计引物Avh57-F、Avh57-R，扩增筛选获得的目的基因片段。

1.采用CTAB-SDS法提取高质量樟疫霉菌基因组DNA

樟疫霉菌株于固体V8培养基平板培养(配方：170ml V8蔬菜汁加1.6g碳酸钙，混匀，2000rpm离心5min取上清，加纯水定容至1L后，加入15g琼脂粉，高压灭菌锅20min备用)，25℃生化培养箱内培养3天后，取3块直径为4mm的菌块移植于盛有100mL液体V8培养基的三角瓶中(配方：70ml V8蔬菜汁加1.6g碳酸钙，混匀，2000rpm离心5分钟取上清，加纯水定容至1L后分装，高压灭菌锅灭菌20min备用)，于25℃生化培养箱培养5天，过滤菌丝，放研钵内加液氮研磨至粉末状。然后按照以下步骤提取参试菌株基因组DNA：

(1)将菌丝粉末转入1.5mL离心管，加入900μL的2％CTAB提取液和90μL 10％SDS，漩涡混匀，于55℃水浴1h，中间每10min上下颠倒几次。12000rpm离心10min。

(2)取上清加等体积酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，12000rpm离心10min。

(3)将上清转移至新管，加等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心5min。

(4)上清转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAc(pH 5.2)，-20℃沉淀(>1h)；12000rpm离心10min，倾去上清，沉淀用70％乙醇洗涤两次，室温晾干。

(5)加20μL灭菌超纯水或TE(pH 8.0)溶解沉淀(含20μg/mL RNase)，37℃处理1h。

取5μL DNA样品于1％琼脂糖凝胶电泳，检测DNA片断长度，然后将DNA置于-20℃冰柜中长期保存备用。

2.PCR扩增目的基因片段

引物为Avh57-F和Avh57-R，序列如下：

Avh57-F：5'-ctagcatcgattcccgggatgaccgtgaagaatgccaaccc-3'(SEQ ID NO:3)

Avh57-R：5'-ctctagaggatccccgggtggcaaaagagcttttcgatg-3'(SEQ ID NO:4)

反应体系为：ddH₂O(22μL)，5×CEⅡbuffer(2μL)，上下游引物各1μL，DNA(5μL)，Pstar Max(25μL)。

PCR反应程序为：98℃ 5min；98℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，循环32次；72℃延伸10min。

取10μL反应产物电泳，确定含目标基因单克隆、测序。借助NCBI中的BLAST程序对获得的基因片段进行同源序列比对，确定目的基因Avh57，其核苷酸序列如SEQ ID No：2所示，表达蛋白的氨基酸序列SEQ ID No：1所示。

实施例2Avh57基因在樟疫霉侵染苹果过程中的表达模式分析

1.樟疫霉菌株侵染苹果

将在4℃冰箱保存的菌丝块置于V8固体培养基上活化，25℃培养24-36h。灭菌培养皿(直径9cm)底部放置一张合适大小的灭菌滤纸，用灭菌水湿润。无菌操作台灭菌。用酒精棉擦拭苹果表面，灭菌。用酒精灯的外焰灭菌切刀的刀口，在苹果的四面切大约1cm²的小方块，去掉果肉。把菌落挑出来放在灭过菌的滤纸上塞到苹果表面的切口里，只塞三面，还有一面做空白固体培养基的对照。用脱脂棉塞住切口，撒点灭菌的自来水。用托盘装入放进恒温培养箱中培养。分别侵染24h，48h，72h，96h后，收集菌丝和果肉，用滤纸吸提取多余的水分，放入液氮中备用。

2.侵染苹果后的RNA提取及表达验证

采用试剂盒中的R6834-01(OMEGA)提取樟疫霉菌株侵染苹果的RNA，经DNaseI(Takara)37℃消化30min后，采用M-MLV(Takara)反转录合成cDNA，经10倍稀释后-20℃保存备用，用于荧光定量分析。采用SYBR荧光染料法，体系参照TaKaRa说明书，毎个样品没置3个重复。

反应体系：2μL反转录产物，引物0.4μL,10μL 2XSYBR Premix Ex Taq II，补水体积至20μL。所用仪器为ABI 7500。

Real-Time PCR试剂是TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)。其体系为：

按照ABI PRISM 7500及TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)的试剂设定反应程序，采用两步法，具体步骤如下：

Stage 1：预变性，Reps：1，95℃ 30秒；

Stage 2：PCR反应，Reps：40，95℃ 5秒，60℃ 34秒；

Stage 3：解离阶段，95℃ 15秒，60℃ 1分钟，95℃ 15秒。

在延伸阶段检测荧光强度并收集信号，持续40个循环。扩增结束后，做熔解曲线分析以检测扩增产物的特异性，温度为60～95℃。熔解曲线为单峰时用于后续分析。所用引物序列如下：

引物序列

结果如图2，从图中可以看出，樟疫霉侵染寄主后Avh57基因在0-48h表达量逐渐升高，在48h达到最高，96h时与48h表达量相同。说明Avh57基因在侵染中后期期高量表达。

实施例3Avh57基因在烟草体内瞬时表达

1.PVX重组表达载体构建

(1)SmaⅠ酶切PCR扩增目的基因片段Avh57，回收插入片断，大小约为567bp。

反应体系：ddH₂O(33μL)，SmaⅠ(2μL)，质粒(10μL)，10×cut Buffer(5μL)。37℃，30min。

(2)与同样酶切的pGR107载体连接，转化大肠杆菌DH5α。

(3)转化后的DH5α经Kan抗性筛选，获得菌落经37℃摇床过夜后提取质粒。

(4)用限制性内切酶SmaⅠ对重组质粒进行酶切鉴定。将酶切初步鉴定正确的重组质粒送金斯瑞生物有限公司测序。将经测序表明在pGR107载体的酶切位点SmaⅠ之间插入SEQ ID No：2的DNA片段的重组质粒命名为pGR107/Avh57(质粒图谱如图3所示)。在重组表达载体pGR107/Avh57中，启动SEQ ID No：2所示DNA片段转录的启动子为35S启动子。

2.农杆菌转化

2.1.重组质粒pGR107/Avh57提取

(1)将含有重组质粒pGR107/Avh57的大肠杆菌接种于含适量抗生素的LB培养基中，37℃，220-250rpm震荡培养至对数生长期。

(2)取1～4mL菌液至1.5mL的离心管中，8000rpm离心1min。

(3)去上清，收集菌体。

(4)加入200μL预冷的溶液I(配方：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)，震荡悬浮菌体。

(5)加入400μL新鲜配制的溶液II(配方：0.2M NaCl，1％SDS)，颠倒离心管数次混匀，12000rpm离心5min。

(6)加入300μL预冷的溶液III(配方：3M K⁺，5M Ac^-)，颠倒混匀液体，置冰层5min，12000rpm离心5min，上清转入另一只离心管中。

(7)加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇(体积比25:24:1)，震荡混匀，12000rpm离心5min。

(8)上层水相转入另一只离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置10min，12000rpm离心10min，去上清。

(9)沉淀用70％(体积分数)乙醇洗2次，倒置干燥。

(10)回溶于30μL TE(含20μg的RNA酶)中，取5μL电泳检测，其余-20℃下保存。

2.2.农杆菌感受态制备

(1)挑农杆菌GV3101单菌落于4ml LB液体培养基2天，28℃下，200rpm震荡培养24h；

(2)取3ml培养液于200ml三角瓶中振荡培养8h至OD＝0.6左右，冰置10min；

(3)分装入50ml离心管中，天平平衡，5000rpm，4℃离心10min；

(4)弃上清，10ml 0℃灭菌超纯水重悬，天平平衡，5000rpm，4℃离心10min；

(5)重复上述过程3次；

(6)弃上清，加入2ml 5％的甘油，用移液器轻轻吸打使细胞重悬；

(7)冰上分装100μL细胞重悬于预冷的1.5ml EP管中；

(8)液氮速冻，于-70℃冰箱保存。

2.3.农杆菌感受态细胞电击转化

(1)将电击杯及杯架放在冰上冷却。设置电转化仪参数，电容C＝25电容，电压V＝2.5kV(0.2的电击杯)，脉冲控制单位设定于

。

(2)在冷却的1.5ml EP管中加入100μL在冰中解冻或新制备的感受态细胞悬浮液和冰中的质粒，轻轻混匀后冰上放置约1min。

(3)将细胞与质粒的混合液转移到冷的电击杯中，轻轻拍打使混合液处于电击杯的底部。

(4)在以上设置的条件下施加一个脉冲，所产生的时间常数为4.8～5.1ms。

(5)立即加入1ml LB培养液至电击杯中(置于室温)。重新悬浮细胞并转移到17mm×100ml的EP管中，200rpm,30℃恢复培养3h。

(6)5000rpm离心3min收集细胞，以合适的稀释度涂布在含有卡那霉素的LB选择性平板上。30℃培养2d后长出的菌落即为阳性克隆。

3.抑制Bax诱导HR的效应分子筛选

试验所用烟草为生长4到6周的本氏烟，在整个生长及实验过程中，烟草置于温室中(22～25℃，高光强度)。将携带有效应分子基因(pGR107/Avh57)的农杆菌菌悬液用l mL去掉针头的注射器渗透到本氏烟叶片中。用针头在烟草下表皮造成一小伤口,然后将100μL的细胞悬浮液注射到伤口周围叶片细胞间。每个基因设三个处理，分别是：

一、将含候选基因GV3101/pGR107/Avh57的农杆菌菌悬液与含Bax(PGR107/Bax)基因的农杆菌菌悬液同时注射；

二、先注射候选基因GV3101/pGR107/Avh57，12h后注射Bax；

三、先注射候选基因GV3101/pGR107/Avh57，24h后注射Bax，含空载体和GFP(pGR107/GFP)的农杆菌作为阴性对照。

结果如图4所示，从图中可以看出，Avh57的抑制作用明显，在0h、12h和24h处理中均抑制Bax引起的细胞死亡。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 樟疫霉效应子蛋白Avh57及其应用

<130> 2021

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 188

<212> PRT

<213> Phytophthora cinnamomi

<400> 1

Met Arg Ser Thr Thr Ile Leu Leu Ile Ala Val Ala Val Leu Phe Leu

1 5 10 15

Gly Val Thr Asn Ala Leu Ala Thr Val Lys Asn Ala Asn Pro Ala Thr

20 25 30

Met Leu Glu Ala His Ser Pro Glu Val Asn Asn Ala Phe Asn Gly Lys

35 40 45

Thr Ser Leu Arg Ser Leu Lys Glu Val Ala Thr Ala Glu Phe Gln Gly

50 55 60

Lys Glu Asp Glu Glu Arg Ala Ile Ser Phe Ser Phe Leu Glu Arg Leu

65 70 75 80

Asn Lys Tyr Ile Pro Gly Thr Lys Ala Phe Thr Gln Ala Ser Ala Ala

85 90 95

Arg Lys Ala Ile Ala Gln Ala Lys Lys Leu Glu Lys Ala Ala Arg Lys

100 105 110

Glu Glu Leu Ala Lys Leu Phe Lys Leu Asp Gly Ile Gln Asp His Gln

115 120 125

Leu Thr Ser Lys Phe Glu Thr Trp Asn Asn Ala Glu Ile Ser Ser Ala

130 135 140

Asp Val Thr Glu Gly Val Phe Lys Thr Met Lys Thr Ser Lys Thr Met

145 150 155 160

Lys Ile Ser Lys Ala Glu Ala Val Thr Ile Gly Asn Lys Tyr Gln Ala

165 170 175

Trp Ile Asn Thr Met His Arg Lys Ala Leu Leu Pro

180 185

<210> 2

<211> 567

<212> DNA

<213> Phytophthora cinnamomi

<400> 2

atgcgctcca ccaccatcct actgattgct gttgcagtcc tcttcctcgg agttaccaac 60

gcgctcgcga ccgtgaagaa tgccaaccct gcaacaatgt tggaggctca ctcgcctgaa 120

gtcaacaacg cgttcaacgg caagacgtcc ctcaggtctc tcaaggaggt tgctacggcc 180

gagtttcaag gcaaagaaga cgaggagaga gcgataagtt tctcgttttt ggaaaggctg 240

aataagtaca ttccgggaac caaggctttc actcaggcgt ccgctgcacg gaaagccatc 300

gcacaagcaa agaagttgga gaaggcggcc aggaaggagg agctcgcgaa gttgttcaaa 360

ttggatggaa ttcaagacca ccagcttact tcgaagtttg agacgtggaa taacgcggag 420

atatcgtcgg ctgatgttac tgaaggtgtg ttcaagacaa tgaaaacgag caagacaatg 480

aaaataagca aagccgaagc tgtcaccatt ggcaataagt accaagcgtg gatcaacacg 540

atgcatcgaa aagctctttt gccatga 567

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

ctagcatcga ttcccgggat gaccgtgaag aatgccaacc c 41

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

ctctagagga tccccgggtg gcaaaagagc ttttcgatg 39

Claims

1.樟疫霉效应子蛋白Avh57，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.编码权利要求1所述蛋白的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.含有权利要求2所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为重组过表达载体或重组克隆载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组过表达载体中含有35S启动子。

6.权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的核酸分子，或权利要求3、4或5中任一所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下1）或2）中的应用：

1）抑制烟草细胞死亡；

2）制备用于抑制烟草细胞死亡的产品。

7.一种用于抑制烟草细胞死亡的产品，其特征在于，所述产品的活性成分为权利要求1所述的蛋白，或权利要求2所述的核酸分子，或权利要求3-5中任一所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。