CN109837297B - 与黄萎病抗性相关的GhAGD13基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与黄萎病抗性相关的GhAGD13基因及其应用。本发明提供了如下1)～3)中任一所述的DNA分子在增强或降低植物对黄萎病抗性中的应用：1)其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA分子；2)其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的DNA分子；3)其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子。研究棉花GhAGD13基因在抗黄萎病中的作用，为利用分子育种方法培育抗病品种提供目标基因奠定基础。

Description

与黄萎病抗性相关的GhAGD13基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物领域，特别涉及与黄萎病抗性相关的GhAGD13基因及其应用。

背景技术

棉花是世界范围内重要的经济作物，是天然纤维的主要来源，在生产中受到多种因素的影响，其中由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的棉花黄萎病是制约棉花生产的首要病害，被称为棉花的“癌症”。

大丽轮枝菌为土传性植物病原菌，其休眠体微菌核可在土壤中可存活10年以上，防治难度大，至今尚无理想的化学防治药剂。目前，生产上防治棉花黄萎病最为经济有效的方法为培育抗病品种。

陆地棉抗黄萎病遗传资源匮乏，在棉花上还未克隆到主效的抗病基因，而且抗病基因所介导的抗性只对特定的病原菌小种有效，易因病原菌的变异而丧失抗性作用，导致病害的重新爆发和流行，给农业生产造成巨大损失。因此，开发和利用新型针对棉花黄萎病的抗病相关基因显得尤为迫切和重要。

发明内容

为了弥补以上领域的不足，本发明提供了与黄萎病抗性相关的GhAGD13基因及其应用。

本发明的一个目的是提供：如下1)～3)中任一所述的DNA分子在增强或降低植物对黄萎病抗性中的应用：

1)其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA分子；

2)其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的DNA分子；

3)其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子。

所述黄萎病为由黄萎病强致病力落叶型菌株V991引起的黄萎病。

所述植物为棉花或拟南芥。

本发明的另一个目的是提供一种制备对黄萎病抗性增强的转基因拟南芥的方法。

本发明所提供的制备对黄萎病抗性增强的转基因拟南芥的方法，包括如下步骤：将核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的DNA分子导入出发植物拟南芥中，得到转基因拟南芥；与出发植物拟南芥相比，转基因拟南芥对黄萎病抗性增强；

所述将核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的DNA分子导入出发植物中是指将装载有所述如SEQ ID No.3所示的DNA分子的重组表达载体导入出发植物拟南芥中。

所述重组表达载体是将所述如SEQ ID No.3所示的DNA分子插入出发载体pPZP111-eGFP的多克隆位点得到的。

所述黄萎病为由黄萎病强致病力落叶型菌株V991引起的黄萎病。

本发明的又一个目的是提供一种制备对黄萎病抗性降低的转基因棉花的方法。

本发明所提供的制备对黄萎病抗性降低的转基因棉花的方法，包括如下步骤：将连接有核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子的沉默载体导入到出发植物棉花中，得到转基因棉花；选出与出发植物棉花相比黄萎病抗性降低的转基因植物个体，即得到对黄萎病抗性降低的转基因棉花。

所述棉花为陆地棉中植棉KV3。

所示沉默载体的出发载体为棉花皱缩病毒沉默载体pCLCrVA。

所述黄萎病为由黄萎病强致病力落叶型菌株V991引起的黄萎病。

GhAGD13基因是利用转录组测序方法从大丽轮枝菌侵染的抗黄萎病陆地棉品种中植棉KV3中分离鉴定的，该基因受大丽轮枝菌侵染而诱导表达，转录水平显著上调。研究棉花GhAGD13基因在抗黄萎病中的作用，为利用分子育种方法培育抗病品种提供目标基因奠定基础。

附图说明

图1为GhAGD13基因克隆电泳图；其中，M:200bp marker，A:3’RACE，B:5’RACE，C:中间片段即ORF片段，D：GhAGD13全长cDNA。

图2为GhAGD13系统进化发育树。

图3为GhAGD13基因沉默载体构建验证结果图；其中，A为GhAGD13基因沉默目的片段扩增；B为中间载体pEASY-T-GhAGD13双酶切验证；C为沉默载体pCLCrVA-GhAGD13转化大肠杆菌菌落PCR验证；D为沉默载体pCLCrVA-GhAGD13双酶切验证；E为沉默载体pCLCrVA-GhAGD13转化农杆菌菌落PCR验证。

图4为沉默GhAGD13基因的中植棉KV3抗病性鉴定，接种大丽轮枝菌V991 3周后的发病情况；其中，A为野生型棉株(中植棉KV3)，B为转化空载体(pCLCrVA+pCLCrVB)的中植棉KV3，C为沉默GhAGD13基因的中植棉KV3。

图5为苔盼蓝染色结果图；其中，A为野生型棉株(中植棉KV3)，B为转化空载体(pCLCrVA+pCLCrVB)的中植棉KV3，C为沉默GhAGD13基因的中植棉KV3。

图6为超表达载体pPZP111-eGFP-GhAGD13构建验证结果图；M为200bpmarker，A为GhAGD13(981bp)目的基因扩增，B为中间载体pEASY-T1-GhAGD13双酶切，C为菌落PCR验证，D为pPZP111-eGFP-GhAGD13载体双酶切，E为pPZP111-eGFP-GhAGD13转化农杆菌菌落PCR。

图7为转GhAGD13基因拟南芥PCR验证结果图；M为200bp marker；0，野生型Col-0；1-20为转GhAGD13基因植株。

图8为转GhAGD13基因拟南芥抗黄萎病鉴定结果；其中，A为野生型拟南芥Col-0接种大丽轮枝菌V991；B为转化空载体pPZP111-eGFP拟南芥接种大丽轮枝菌V991；C为转化pPZP111-eGFP-GhAGD13拟南芥接种大丽轮枝菌V991。

图9为亚细胞定位载体35S-GhAGD13-GFP构建验证结果图；其中，M为200bpmarker，A为GhAGD13-CL(978bp)目的基因扩增，B为中间载体pEASY-T-GhAGD13-CL双酶切，C为菌落PCR验证，D为35S-GhAGD13-GFP载体双酶切，E为35S-GhAGD13-GFP转化农杆菌菌落PCR。

图10为GhAGD13基因亚细胞定位结果图；其中，A为空载体亚细胞定位(对照)，B为GhAGD13基因亚细胞定位。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

植物材料：

陆地棉高抗黄萎病新品系中植棉KV3，在文献“Zhang W,Zhang H,Qi F,JianG.Generation of transcriptome profiling and gene functional analysis inGossypium hirsutum upon Verticillium dahliae infection.Biochemical andBiophysical Research Communications,2016,473:879-885”中公开过，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。

拟南芥哥伦比亚型(Col-0)，在文献“Szabados L,Kovács I,Oberschall A,Abrahám E,Kerekes I,Zsigmond L,Nagy R,Alvarado M,Krasovskaja I,Gál M,Berente A,Rédei GP,Haim AB,Koncz C.Distribution of 1000sequenced T-DNA tags in theArabidopsis genome.Plant J.2002，32(2):233-42.”中公开过，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。

本生烟，(Nicotiana benthamiana),在文献“Goodin MM,Zaitlin D,Naidu RA,Lommel SA.Nicotiana benthamiana:its history and future as a model for plant-pathogen interactions.Mol Plant Microbe Interact.2008Aug；21(8):1015-26.”中公开过，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。

载体和菌株：

pEASY-T1Simple载体购自于全式金生物公司；

棉花皱缩病毒沉默载体pCLCrVA和pCLCrVB，在文献“Gu Z,Huang C,Li F,ZhouXP.A versatile system for functional analysis of genes and microRNAs incotton.Plant Biotechnology Journal,2014,12:1-12.”中记载过，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。

超表达载体pPZP111-eGFP，为中科院微生物所夏桂先实验室馈赠，在文献“Hajdukiewicz P,Svab Z,Maliga P.The small,versatile pPZP family ofAgrobacterium binary vectors for plant transformation.Plant MolecularBiology，1994，25,989-994.”中记载过，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。

GFP荧光载体Cam35S-GFP,公众可从中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心-Biovector Science Lab购买。

大肠杆菌DH5α购自于天根生化科技(北京)有限公司；

黄萎病强致病力落叶型菌株V991为本实验室保存，在文献“石磊岩，王莉梅。北方棉区棉花黄萎病菌RAPD分析。植物保护，1997，5:3-7.”中公开过，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。

农杆菌菌株EHA105为本实验室保存，在文献“Cheng M,Jarret RL,Li Z,Xing A,Demski JW.Production of fertile transgenic peanut(Arachis hypogaea L.)plantsusing Agrobacterium tumefaciens.Plant Cell Rep.1996，15(9):653-657.”中公开过，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。

实施例1、陆地棉GhAGD13基因的获得及功能验证

一、陆地棉GhAGD13基因的获得

1、棉花材料的种植：

棉花(棉花品种为中植棉KV3(来源见上)，Gossypium hirsutum L.))种子用硫酸脱绒。挑选饱满的棉种，用70％的酒精浸泡5min，再用5％的H₂O₂浸泡2h，无菌水冲洗3遍后，用无菌水浸泡催芽5h。将种子种植到直径11cm的花盆中(营养土与蛭石比例为2:1)，放置温室中培养，培养的条件设置为温度26℃，光照16小时，黑暗8小时，相对湿度为70％。

2、总RNA提取：

采新鲜叶片，提取棉花总RNA。RNA提取参照TIANGEN RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书。微量分光光度计进行浓度和质量检测，-80℃保存备用。

3、GhAGD13基因的克隆：

3.1引物设计

通过转录组测序筛选到GhAGD13基因片段，得到部分序列，通过在线BLAST分析，查找陆地棉测序数据库中的同源序列，通过DNAMAN的Sequence Assembly功能进行序列拼接，设计特异性引物进行扩增，获得中间片段。在利用TAKARA公司的

RACE 5’/3’Kit获得基因全长。中间片段的引物序列为GhAGD13-F、GhAGD13-R；5'RACE引物序列为5’RACEPrimer、UPM；3'RACE引物序列为3’RACE Outer Primer、GSP Outer、3’RACE Inner Primer、GSP Inner；基因全长的引物序列为5'-F、3'-R(表1)。

表1.克隆GhAGD13基因的引物

3.2 cDNA合成：

提取棉花RNA，反转录为cDNA，依次加入下列试剂：

总RNA，2μl；

Random Primer，1μl；

RNA free H2O,7μl；

65℃，5min；冰浴1min

5×M-MLV buffer，4μl；

dNTP(10mM)，1μl；

RNase inhibitor，0.5μl；

M-MLV Reverse Transcriptase(200U)，1μl；

RNA free H2O,3.5μl

混匀后，42℃，1h；70℃，10min。反应完成后，保存于-20℃。3.3基因克隆

中间片段克隆步骤：

扩增体系：

PCR反应程序：94℃3min；35个循环：94℃30s，58℃30s，72℃1min 30s；72℃10min。

3’末端克隆步骤：参考Takara公司的3'RACE试剂盒。

5’末端克隆步骤：参考Takara公司的5'RACE试剂盒。

3.4将获得的PCR产物与T载体连接

将上步获得的各PCR产物与pEASY-T1Simple载体(全式金生物公司)连接，方法参见试剂盒说明书，转化DH5α(天根生化科技(北京)有限公司)，进行菌落PCR检测，对阳性克隆进行测序验证(测序公司为上海生工)。

3.5 GhAGD13基因克隆结果

根据序列拼接得到开放阅读框(ORF)为981bp，3’RACE末端扩增得到157bp序列，5’RACE末端扩增得到121bp序列，最后通过高保真酶扩增获得GhAGD13基因的全长cDNA序列为1259bp。GhAGD13基因的cDNA如SEQ ID No.1所示，其编码框为SEQ ID No.3所示(即SEQ IDNo.1中自5’末端起第122位至第1102位核苷酸)，其编码的GhAGD13蛋白的氨基酸如SEQ IDNo.2所示。PCR扩增结果如图1所示。

4、GhAGD13基因生物信息学分析：

通过NCBI上的在线ORF finder程序查找GhAGD13ORF和编码的氨基酸，利用BLAST搜索和比对GhAGD13的同源序列，分析序列的保守结构域；通过MEGA软件构建不同物种GhAGD13的系统发育树，使用ExPASy中的Compute pI/Mw估算分子量、等电点等信息；利用在线软件SignalP和TMHMM预测该蛋白信号肽和蛋白序列跨膜区。

蛋白氨基酸序列分析、比对及进化树的构建结果如下：

利用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析显示，GhAGD13的理论分子量为35.78kD，理论等电点为5.10。在NCBI在线查找其他物种AGD13氨基酸序列，发现GhAGD13与雷德蒙氏棉、木本棉、可可树等植物的AGD13蛋白具有较高的同源性，系统发育树结果见图2。该蛋白N端有一个GAP(11-128)结构域，包含特征性锌指结构域(Cys-x2-Cys-x(16,17)-x2-Cys)，C端有一个C2结构域，具有钙结合区的C2结构域具有负电荷残基，主要是天冬氨酸，作为钙离子的配体。SignalP-4.1预测结果显示GhAGD13不含信号肽。TMHMM软件分析GhAGD13不含跨膜结构域。

二、陆地棉GhAGD13基因功能验证

1、GhAGD13基因沉默

1.1构建含有GhAGD13基因的VIGS载体

以陆地棉中植棉KV3cDNA为模板扩增GhAGD13基因片段，引物序列为：

V1GhAGD13F:5’-GGACTAGTGGTTTTATCTGTGGCATTGG-3’

V1GhAGD13R:5’-AAGGCGCGCCCCCAAGAGTCAGGACAACATAA-3’

划线部分为酶切位点SpeⅠ：ACTAGT，AscⅠ：GGCGCGCC。

PCR产物是412bp的DNA分子，该分子含有的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示(即SEQID No.1中自5’末端起第307位至第718位所示)。

PCR产物连接到载体pEASY-T1Simple(载体购自全式金生物公司，产品目录号为：CT111-01)上，获得中间载体pEASY-T-GhAGD13。限制性内切酶SpeI和AscI双酶切中间载体pEASY-T-GhAGD13，Axygen公司的胶回收试剂盒回收GhAGD13基因片段，连接到相同酶切的基因沉默载体pCLCrVA上，构建成沉默载体pCLCrVA-GhAGD13。

1.2转化沉默载体

将沉默载体pCLCrVA-GhAGD13转化至大肠杆菌DH5α，酶切及PCR验证后，转化至农杆菌EHA105中。同时将沉默载体pCLCrVA和pCLCrVB分别转化至农杆菌EHA105中。

转化方法：冻融法将构建的VIGS沉默载体pCLCrVA-GhAGD13、pCLCrVA和pCLCrVB分别转入农杆菌菌株EHA105。方法如下：

制备农杆菌感受态细胞：挑取EHA105单菌落，接种到含10ml YEP液体培养基(10g/l蛋白胨，10g/l酵母提取物，5g/l NaCl，15g/l琼脂)中，28℃，200rpm培养过夜。取0.5ml菌液加入50ml YEP液体培养基中，28℃，200rpm培养至OD600＝0.5。将菌液倒入50ml离心管中，冰浴10min，4℃，5000rpm离心10min。弃上清，加入10ml冰预冷的0.1mol/lCaCl2，轻轻悬浮沉淀。冰浴30min，4℃，5000rpm离心10min。弃上清，加入2ml冰预冷的0.1mol/l CaCl2，轻轻悬浮沉淀，分装备用。

冻融法转化：感受态细胞中加入1-2μl沉默载体，轻轻混匀，置于冰上30min。液氮中速冻1min，37℃放置5min。加入400μl YEP液体培养基，28℃，200rpm培养4h。将菌液涂布于YEP固体培养基(50mg/l Kan，50mg/l Rif)，28℃培养约36h。挑取单菌落，以特异性引物进行PCR鉴定，获得阳性转化子。

菌落PCR扩增体系(25μL)

反应程序：94℃3min，36cycles：94℃30s,55℃30s，72℃1min；72℃10min。

引物(CLCrVA，CLCrVB)，引物序列参见Gu et al文献：“Gu Z,Huang C,Li F,ZhouXP.A versatile system for functional analysis of genes and microRNAs incotton.Plant Biotechnology Journal,2014,12:1-12.”)。

CLCrVAF：GGGAGCTCCACTTGGGATAGGTTAAGAA；

CLCrVAR：CCATCGATGTCCCTTATTAACTTTAGGGC

CLCrVBF：GGGCCATAGACATGGTAATGTTGGACTC

CLCrVBR：GTCGCTGCGCGGCCATATTTCTCTATAT

V2GhAGD13F:5’-GGTTTTATCTGTGGCATTGG-3’

V2GhAGD13R:5’-CCCAAGAGTCAGGACAACATAA-3’

1.3沉默棉花植株

待陆地棉中植棉KV3棉苗子叶完全展开时进行接种。取含有pCLCrVA-GhAGD13沉默载体的EHA105菌株，28℃培养至对数生长期，8000rpm离心5min，收集菌体，再用乙酰丁香酮溶液(10mmol/l MES，200μmol/l Acs,10mmol/l MgCl₂)重悬菌体，并调整菌液浓度至OD600＝1.0–1.5。将它们分别与含pCLCrVB的菌株1:1混合，室温静止放置3小时后用于植物接种。同时混合含pCLCrVA和pCLCrVB的EHA105菌株，作为空载体对照，用于植物接种。取一支1ml的一次性注射器，吸取菌液，在子叶背部注射接种。接种后植株置于培养箱中，25/20℃，光照16h，黑暗8h条件下，培养3周。

1.4沉默棉花植株基因表达量检测

将基因沉默植株的叶片总RNA反转录合成cDNA(方法见前)，模板起始量均为100ng，陆地棉ubiquitin(GenBank:EU604080)为内标。荧光定量PCR反应试剂盒为天根公司的SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)试剂盒，反应在ABI 7500Real-time PCR system荧光定量仪中进行，每种处理3次生物学重复，实验结果用相对定量2^-ΔΔCt法计算GhAGD13基因的表达量(Livak and Schmittgen,2001)。

反应体系：

将上述混合液混匀离心后，采用两步法在ABI 7500仪器上进行PCR反应，反应程序：95℃15min；40个循环:95℃10s，60℃32s。

荧光定量PCR引物：

1.5沉默棉花植株接菌、发病调查

分别对野生型棉株、转化空载体的棉株和沉默GhAGD13基因的棉株接种大丽轮枝菌V991，接种方法为蘸根法接种大丽轮枝菌V991，孢子浓度为1.0×10⁷个孢子/ml。3周后调查发病情况，并计算病情指数。

病情指数＝[∑(各级病株数×相应病级)/调查总株数×最高病级(4)]×100。

1.6苔盼蓝染色

分别摘取野生型、转空载体pCLCrV(A+B)、沉默pCLCrV-GhAGD13的棉株叶片，用无菌水冲洗干净后放入小烧杯中；向烧杯中加入苔盼蓝染色液(Typan 0.02％m/v；乙醇：苯酚：水：83％乳酸＝2：1：1：1)，用沸水煮8-10分钟染色；弃掉染色液，加入水合三氯乙醛溶液(2.5g/mL)进行脱色；待脱色完全后，观察拍照。

1.7结果

利用CLCrV沉默载体pCLCrVA构建了沉默GhAGD13基因的沉默载体(图3)。将它们与pCLCrVB共同接种棉花子叶，并以pCLCrVA和pCLCrVB空载体接种棉花子叶作为对照。为检测沉默载体的沉默效率，在接种3周后，利用荧光定量PCR技术检测接种后中植棉KV3中GhAGD13基因的表达量。发现相对于接种空载体的中植棉KV3，沉默GhAGD13基因的植株中GhAGD13基因的表达量下降了70％。

对野生型棉株、转化空载体棉株和基因沉默棉株接菌3周后调查结果显示：野生型棉株病情指数为11.15±1.29，转化空载体棉株病情指数为12.59±3.06，GhAGD13基因沉默棉株病情指数为47.90±3.69，使中植棉KV3对黄萎病抗性丧失(图4)。

苔盼蓝染色结果：对沉默植株进行抗病性鉴定发现，GhAGD13沉默植株的病情指数显著高于对照。对GhAGD13沉默植株的叶片进行了苔盼蓝染色，以野生型和转化空载体植株作为对照。结果可见，GhAGD13沉默植株叶片的坏死现象高于野生型对照和转空载体pCLCrV(A+B)的植株(图5)。

2、GhAGD13基因超表达

扩增GhAGD13基因ORF(引物为PZP-GhAGD13-F/PZP-GhAGD13-R，反应程序同上)，连接到载体pEASY-T1Simple上，获得中间载体，限制性内切酶SpeⅠ(ACTAGT)和SalⅠ(GTCGAC)双酶切中间载体，回收GhAGD13全长片段，连接到相同酶切的超表达载体pPZP111-eGFP上，转化至大肠杆菌DH5α，酶切及PCR验证后，将超表达质粒pPZP111-eGFP-GhAGD13转化至农杆菌EHA105中(图6)。

PZP-GhAGD13-F：GGACTAGTATGAGTGGAGTAAAAAAGTC

PZP-GhAGD13-R：GCGTCGACTTACTGATCAAGAGGCAGCC

PCR产物是981bp的DNA分子，该分子含有的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示(即SEQID No.1中自5’末端起第122位至第1102位所示)。

构建好的超表达载体pPZP111-eGFP-GhAGD13采用花浸法转化拟南芥，以转化pPZP111-eGFP空载体作为阴性对照。取含超表达载体的EHA105菌株，28℃培养至对数生长期，转接到新鲜培养基(LB)中，待菌液浓度为OD600＝0.8-1.0时，5000rpm离心5min，收集菌体，侵染缓冲液重悬，使终浓度OD600达到0.8。取3-4周龄拟南芥哥伦比亚型(Col-0)，剪掉已经开过的花，用滴管吸取菌液滴到即将开放的拟南芥花序上，确保液滴完全覆盖花序。将拟南芥转至黑暗中培养24h，转移到正常光照条件下，每隔5天重复侵染一次，侵染3-4次。将收获的T0代种子点种于含Kan的筛选培养基(含卡那霉素的MS培养基)中，将叶色浓绿、根系发达和植株健壮的拟南芥移栽于花盆，利用Plant Leaf Direct PCR kit(购自成都福际生物技术公司，产品目录号为TP-02111)筛选转基因阳性植株。

引物：

GhAGD13-F：ATGAGTGGAGTAAAAAAGTC

GhAGD13-R：TTACTGATCAAGAGGCAGCC

反应体系(20μL)：

反应程序：

94℃，3min；94℃，10s；55℃，20s；72℃，2min，35个循环，72℃，5min。

用卡那霉素浓度为70mg/L的MS培养基初筛转基因阳性株，将叶片浓绿和植株健壮的拟南芥幼苗移栽于花盆中，通过叶片PCR技术扩增插入目的基因进一步筛选转基因单株(图7，方法同上)，获得T1代阳性株，收单株种子，继续筛选，获得T2代转基因系。

超表达植株抗病性鉴定：超表达植株采用蘸根法接种黄萎病菌V991，转化空载体和Col-0型拟南芥接种V991分别作为对照，20天后调查发病情况，并计算病情指数。

采用蘸根法接种黄萎病菌V991，20天后调查转化pPZP111-eGFP-GhAGD13、pPZP111-eGFP和野生型植株发病情况(图8)，统计病情指数。结果显示超表达GhAGD13拟南芥的病情指数为32.05，野生型和转化空载体拟南芥植株病情指数分别为60.42和62.50，转基因植株对黄萎病抗性显著增加(P<0.05)。野生型和转化空载体的拟南芥对黄萎病抗性表现为高感，转GhAGD13基因拟南芥对黄萎病抗性表现为耐病。表明GhAGD13在抗黄萎病过程中起作用。

3、GhAGD13基因亚细胞定位

3.1棉花材料的种植：方法同上

3.2烟草材料的种植：

本生烟种子用75％的酒精灭菌1min，用无菌水冲洗2到3次。再用3％的过氧化氢处理3min，用无菌水冲洗5到6次。将灭菌处理过的种子点播于直径7×7cm的花盆中(营养土与蛭石比例为3:1)放置温室培养，培养条件为温度24℃，光照16小时，黑暗8小时，相对湿度为70％。

3.3棉花RNA提取及cDNA合成：方法同上。

3.4GhAGD13基因亚细胞定位载体构建

以陆地棉中植棉KV3cDNA为模板扩增GhAGD13基因片段用于构建亚细胞定位载体，引物序列为：

GhAGD13-CLF:GGGGTACCATGAGTGGAGTAAAAAAGTCTACCT

GhAGD13-CLR:GCGTCGACCTGATCAAGAGGCAGCCACTCTAA

划线部分为酶切位点：KpnⅠ：GGTACC，SalⅠ：GTCGAC。PCR产物连接到载体pEASY-T1Simple(载体购自全式金生物公司，产品目录号为：CT111-01)上，获得中间载体pEASY-T-GhAGD13-CL。限制性内切酶KpnⅠ和SalⅠ双酶切中间载体pEASY-T-GhAGD13-CL，Axygen公司的胶回收试剂盒回收GhAGD13-CL基因片段，连接到相同酶切的Cam35S-GFP上，构建成亚细胞定位载体35S-GhAGD13-GFP，转化至大肠杆菌DH5α，酶切及PCR验证后，转化至农杆菌EHA105中。PCR方法、转化方法同上。

3.5接种烟草

取含有亚细胞定位载体35S-GhAGD13-GFP的EHA 105菌株，28℃培养至对数生长期，5000rpm离心5min，收集菌体，用浸润Buffer(100mg/L Kan，50mg/L Rif，10mmol/L MES，20umol/L AS(乙酰丁香酮-Acetosyringone)重悬菌体，黑暗条件下室温静置3小时以上，对适宜苗龄(约生长35天)的本生烟进行浸润注射接种，接种后的烟草需黑暗处理8h，在25℃温室中培养。

3.6共聚焦显微镜观察

接种后24h的本生烟叶片，开始进行激光共聚焦显微观察，具体操作见激光共聚焦显微镜操作手册。

3.7结果

亚细胞定位载体的构建结果见图9，GhAGD13片段大小为978bp。

激光共聚焦显微观察结果：

浸润空载体Cam35S-GFP瞬时表达的本生烟叶片，可见GFP在全细胞均有表达。浸润35S-GhAGD13-GFP瞬时表达的本生烟叶片，可见GhAGD13与GFP融合蛋白在全细胞中均有表达，另外还可见点状分布的圆形荧光信号，推测可能为高尔基体(图10)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 与黄萎病抗性相关的GhAGD13基因及其应用

<130> P190204/ZWB

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1259

<212> DNA

<213> 棉花（Gossypium hirsutum L.）

<400> 1

acatggggat ttttttctcc ttctctctct tacccaaatc tgacactggt tttggatttt 60

ccatttcaat tcagtgtttt caaaccgcat tgttggatga ttgtgggttt gtagcagagc 120

aatgagtgga gtaaaaaagt ctacctcagc aaaaataaga ttgaggggct tattgaatca 180

acctgataat cgcacttgtg ctgattgtgg tgctccagat ccaaagtggg catcagcaaa 240

tattggagtc tttttatgct tgaaatgttg tggtgtgcac agaagcctcg gtacacacat 300

atccaaggtt ttatctgtgg cattggatga atggtctgat gaagaaattg atgctatgat 360

tgaagttgga ggaaattcct ctgctaattc aatctatgag gcttatatac ctgaaggtta 420

tacaaagcct ggcccaaatg ctagtaatga tgagcggagg aaattcatta agtccaagta 480

tgaacttcaa gaatttttga aggccagctt gcggatcaca tcagggaagg attcctcttc 540

ttcttctact caatcgaaca tttctggaaa gattttggat actatcctaa caaattcaac 600

acagaaggaa ggcatggttg aatttattgg gttactgaag gtcaaagtgg taaaaggcac 660

aaatttagct gtccgggata tgatgacgag tgatccttat gttgtcctga ctcttgggaa 720

gcagactgtt cagtcaactg taatatcaag caacttgaat ccagtctgga atgaggaatt 780

aatgctatcg gttcctagca actatgggcc tgttaagttg caagtatatg atcatgacac 840

gttctcagct gatgatataa tgggagaagc agagattgat atccagccct tgataacatc 900

tgcaacatca tatgggaacc cggaaatgtt tgggaatatg cagatcggaa aatggctgaa 960

gtcccatgat aatgccctta tggaggatag cgtcgtcaac atcattgatg ggaaggtgaa 1020

acaagatgta ccactcaagc tccaaaatgt tgaatgtgga gaacttcatc tagaattaga 1080

gtggctgcct cttgatcagt aacctatgtt gggaatttca gactaccatt gccagggatt 1140

tggcttcaat ttgctctgtc gctgctaatt ttgaatatgg gcaataattt ttttgaagtg 1200

cacattttat ttggagttgg ggattggagc aatcattaaa tcaagctttt gattcgtgt 1259

<210> 2

<211> 326

<212> PRT

<213> 棉花（Gossypium hirsutum L.）

<400> 2

Met Ser Gly Val Lys Lys Ser Thr Ser Ala Lys Ile Arg Leu Arg Gly

1 5 10 15

Leu Leu Asn Gln Pro Asp Asn Arg Thr Cys Ala Asp Cys Gly Ala Pro

20 25 30

Asp Pro Lys Trp Ala Ser Ala Asn Ile Gly Val Phe Leu Cys Leu Lys

35 40 45

Cys Cys Gly Val His Arg Ser Leu Gly Thr His Ile Ser Lys Val Leu

50 55 60

Ser Val Ala Leu Asp Glu Trp Ser Asp Glu Glu Ile Asp Ala Met Ile

65 70 75 80

Glu Val Gly Gly Asn Ser Ser Ala Asn Ser Ile Tyr Glu Ala Tyr Ile

85 90 95

Pro Glu Gly Tyr Thr Lys Pro Gly Pro Asn Ala Ser Asn Asp Glu Arg

100 105 110

Arg Lys Phe Ile Lys Ser Lys Tyr Glu Leu Gln Glu Phe Leu Lys Ala

115 120 125

Ser Leu Arg Ile Thr Ser Gly Lys Asp Ser Ser Ser Ser Ser Thr Gln

130 135 140

Ser Asn Ile Ser Gly Lys Ile Leu Asp Thr Ile Leu Thr Asn Ser Thr

145 150 155 160

Gln Lys Glu Gly Met Val Glu Phe Ile Gly Leu Leu Lys Val Lys Val

165 170 175

Val Lys Gly Thr Asn Leu Ala Val Arg Asp Met Met Thr Ser Asp Pro

180 185 190

Tyr Val Val Leu Thr Leu Gly Lys Gln Thr Val Gln Ser Thr Val Ile

195 200 205

Ser Ser Asn Leu Asn Pro Val Trp Asn Glu Glu Leu Met Leu Ser Val

210 215 220

Pro Ser Asn Tyr Gly Pro Val Lys Leu Gln Val Tyr Asp His Asp Thr

225 230 235 240

Phe Ser Ala Asp Asp Ile Met Gly Glu Ala Glu Ile Asp Ile Gln Pro

245 250 255

Leu Ile Thr Ser Ala Thr Ser Tyr Gly Asn Pro Glu Met Phe Gly Asn

260 265 270

Met Gln Ile Gly Lys Trp Leu Lys Ser His Asp Asn Ala Leu Met Glu

275 280 285

Asp Ser Val Val Asn Ile Ile Asp Gly Lys Val Lys Gln Asp Val Pro

290 295 300

Leu Lys Leu Gln Asn Val Glu Cys Gly Glu Leu His Leu Glu Leu Glu

305 310 315 320

Trp Leu Pro Leu Asp Gln

325

<210> 3

<211> 981

<212> DNA

<213> 棉花（Gossypium hirsutum L.）

<400> 3

atgagtggag taaaaaagtc tacctcagca aaaataagat tgaggggctt attgaatcaa 60

cctgataatc gcacttgtgc tgattgtggt gctccagatc caaagtgggc atcagcaaat 120

attggagtct ttttatgctt gaaatgttgt ggtgtgcaca gaagcctcgg tacacacata 180

tccaaggttt tatctgtggc attggatgaa tggtctgatg aagaaattga tgctatgatt 240

gaagttggag gaaattcctc tgctaattca atctatgagg cttatatacc tgaaggttat 300

acaaagcctg gcccaaatgc tagtaatgat gagcggagga aattcattaa gtccaagtat 360

gaacttcaag aatttttgaa ggccagcttg cggatcacat cagggaagga ttcctcttct 420

tcttctactc aatcgaacat ttctggaaag attttggata ctatcctaac aaattcaaca 480

cagaaggaag gcatggttga atttattggg ttactgaagg tcaaagtggt aaaaggcaca 540

aatttagctg tccgggatat gatgacgagt gatccttatg ttgtcctgac tcttgggaag 600

cagactgttc agtcaactgt aatatcaagc aacttgaatc cagtctggaa tgaggaatta 660

atgctatcgg ttcctagcaa ctatgggcct gttaagttgc aagtatatga tcatgacacg 720

ttctcagctg atgatataat gggagaagca gagattgata tccagccctt gataacatct 780

gcaacatcat atgggaaccc ggaaatgttt gggaatatgc agatcggaaa atggctgaag 840

tcccatgata atgcccttat ggaggatagc gtcgtcaaca tcattgatgg gaaggtgaaa 900

caagatgtac cactcaagct ccaaaatgtt gaatgtggag aacttcatct agaattagag 960

tggctgcctc ttgatcagta a 981

<210> 4

<211> 412

<212> DNA

<213> 棉花（Gossypium hirsutum L.）

<400> 4

ggttttatct gtggcattgg atgaatggtc tgatgaagaa attgatgcta tgattgaagt 60

tggaggaaat tcctctgcta attcaatcta tgaggcttat atacctgaag gttatacaaa 120

gcctggccca aatgctagta atgatgagcg gaggaaattc attaagtcca agtatgaact 180

tcaagaattt ttgaaggcca gcttgcggat cacatcaggg aaggattcct cttcttcttc 240

tactcaatcg aacatttctg gaaagatttt ggatactatc ctaacaaatt caacacagaa 300

ggaaggcatg gttgaattta ttgggttact gaaggtcaaa gtggtaaaag gcacaaattt 360

agctgtccgg gatatgatga cgagtgatcc ttatgttgtc ctgactcttg gg 412

Claims (9)

1.如下1)～3)中任一所述的DNA分子在增强或降低植物对黄萎病抗性中的应用：

1)其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA分子；

2)其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的DNA分子；

3)其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述黄萎病为由黄萎病强致病力落叶型菌株V991引起的黄萎病。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述植物为棉花或拟南芥。

4.一种制备对黄萎病抗性增强的转基因拟南芥的方法，包括如下步骤：将核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的DNA分子导入出发植物拟南芥中，得到转基因拟南芥；与出发植物拟南芥相比，转基因拟南芥对黄萎病抗性增强；

所述将核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的DNA分子导入出发植物拟南芥中是指将装载有所述如SEQ ID No.3所示的DNA分子的重组表达载体导入出发植物拟南芥中。

5.根据权利要求4所述的制备对黄萎病抗性增强的转基因拟南芥的方法，其特征在于：所述黄萎病为由黄萎病强致病力落叶型菌株V991引起的黄萎病。

6.一种制备对黄萎病抗性降低的转基因棉花的方法，包括如下步骤：将连接有核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子的沉默载体导入到出发植物棉花中，得到转基因棉花；选出与出发植物棉花相比黄萎病抗性降低的转基因植物个体，即得到对黄萎病抗性降低的转基因棉花。

7.根据权利要求6所述的制备对黄萎病抗性降低的转基因棉花的方法，其特征在于：所述棉花为陆地棉中植棉KV3。

8.根据权利要求6所述的制备对黄萎病抗性降低的转基因棉花的方法，其特征在于：所示沉默载体的出发载体为棉花皱缩病毒沉默载体pCLCrVA。

9.根据权利要求6所述的制备对黄萎病抗性降低的转基因棉花的方法，其特征在于：所述黄萎病为由黄萎病强致病力落叶型菌株V991引起的黄萎病。

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