CN110330554B - VdSCP27蛋白在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及VdSCP27蛋白在提高植物抗性和/或诱导植物防御反应中的应用。本公开将VdSCP27蛋白用于提高植物抗性和诱导植物防御反应时，诱导ROS爆发和胼胝质沉积等免疫反应的效率较高，植物抗性提高和防御反应诱导效果明显。本公开为提高植物抗性和诱导植物防御反应提供了新的途径，在农业生产上具有广阔的应用前景。

Description

VdSCP27蛋白在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用
技术领域
本公开涉及微生物蛋白应用技术领域，具体涉及VdSCP27蛋白在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用。
背景技术
病原相关分子模式(PAMPs)是指病原微生物表面某些共有的高度保守的分子结构，通常为病原微生物所特有，而宿主细胞不产生，是微生物的生存或致病性所必需的。植物能通过细胞膜上的模式识别受体(PRRs)识别PAMPs分子，从而激活植物的病原物相关分子模式触发免疫(PTI)，以抵御病原微生物的侵染。植物识别PAMPs分子后，会产生一系列的防御反应，如胞质内Ca2+浓度的变化、MAPKs激酶信号途径的激活、ROS爆发、胞质酸化、乙烯合成、病程相关基因的表达、细胞壁胼胝质沉淀、植物抗毒素的合成、细胞离子渗漏及产生HR反应等。
ROS爆发在PAMPs分子诱导的植物抗病防卫反应中起着非常重要的作用，它参与调控气孔运动，促进细胞编程性死亡，直接或间接杀死入侵的病原菌，作为第二信使可在转录水平上激活和调控植物体内各种防卫相关基因的表达以及参与系统获得性抗性的建立等。细胞壁胼胝质沉淀，可加强植物细胞壁来阻止病原微生物侵入，阻止大多数病原微生物定殖，从而达到抵抗防御病原微生物的目的。
但是，目前ROS爆发、胼胝质沉积等免疫反应的诱导效率仍然较低。
发明内容
本公开的目的是提高诱导ROS爆发、胼胝质沉积的物质的诱导效率。
为了实现上述目的，本公开提供VdSCP27蛋白在提高植物抗性和/或诱导植物防御反应中的应用，所述VdSCP27蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
可选地，所述提高植物抗性，包括：
提升植物对灰葡萄孢菌、辣椒疫霉菌、大丽轮枝菌、镰孢菌和叶霉菌中至少一种病原体的抗性；
所述诱导植物防御反应，包括：
诱导减少灰葡萄孢菌、辣椒疫霉菌、大丽轮枝菌、镰孢菌和叶霉菌中至少一种病原体对植物的危害。
可选地，所述植物包括烟草、棉花、辣椒、拟南芥、马铃薯和番茄中的至少一种。
可选地，所述VdSCP27蛋白的应用浓度为0.001～10μM。
本公开还提供了一种提高植物抗性和/或诱导植物防御反应的方法，该方法包括：
将VdSCP27蛋白的编码基因导入目的植物，得到抗性提高和/或发生防御反应的植株；或者，
将VdSCP27蛋白或者含有VdSCP27蛋白的组合物施用于目的植株上，得到抗性提高和/或发生防御反应的植株；
其中，所述VdSCP27蛋白的编码基因的多核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述VdSCP27蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
可选地，所述VdSCP27蛋白的编码基因通过植物表达载体导入目的植物。
可选地，所述植物表达载体包括Ti类质粒载体和/或病毒载体。
可选地，所述植物包括烟草、棉花、辣椒、拟南芥、马铃薯和番茄中的至少一种。
本公开还提供了VdSCP27蛋白在制备农药中的应用，所述农药用于提高植物抗性和/或诱导植物防御反应，所述VdSCP27蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
可选地，所述植物包括烟草、棉花、辣椒、拟南芥、马铃薯和番茄中的至少一种。
通过上述技术方案，将VdSCP27蛋白用于提高植物抗性和诱导植物防御反应时，诱导ROS爆发、胼胝质沉积等免疫反应的效率较高，植物抗性提高和防御反应诱导效果明显。本公开为提高植物抗性和诱导植物防御反应提供了新的途径，在农业生产上具有广阔的应用前景。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是本公开实施例1中VdSCP27蛋白诱发烟草叶片ROS反应的实验结果图。
图2是本公开实施例1中VdSCP27蛋白诱发烟草叶片胼胝质积累的实验结果图。
图3是本公开实施例1中VdSCP27蛋白提高烟草防御反应相关基因表达水平的实验结果图。
图4是本公开实施例2中VdSCP27蛋白诱导烟草对灰葡萄孢的抗性反应的实验结果图。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开的第一方面提供VdSCP27蛋白在提高植物抗性和/或诱导植物防御反应中的应用，所述VdSCP27蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
经本公开发明人研究发现，从大丽轮枝菌中敲除VdSCP27的编码基因后，对突变菌株的致病表型进行鉴定，鉴定结果表明，敲除VdSCP27编码基因后的大丽轮枝菌突变菌株对棉花和烟草的致病性没有显著变化，说明VdSCP27并不是大丽轮枝菌的毒力因子；将大丽轮枝菌的VdSCP27蛋白注入植物叶片后，例如烟草叶片，可在叶片中检测到ROS的产生，以及胼胝质的积累，并且被注射植株的一些防御反应相关基因的表达水平也显著上调，例如HR反应标记基因HSR203、H1N1和GRAS2，病程相关基因PR1、PR4和Glnb。因此，可将VdSCP27蛋白用于提高植物抗性和/或诱导植物防御反应。
上述技术方案中，将VdSCP27蛋白用于提高植物抗性和诱导植物防御反应时，诱导ROS爆发、胼胝质沉积等免疫反应的效率较高，植物抗性提高和防御反应诱导效果明显。本公开为提高植物抗性和诱导植物防御反应提供了新的途径，在农业生产上具有广阔的应用前景。
根据本公开，提高植物抗性包括提高目的植株对病原体侵染的抗性，可以减轻病原体对目的植株的感染程度，限制病原体在目的植株中进一步扩散。本公开所指病原体包括病毒、细菌、卵菌、真菌和线虫等，所述病原体的种类可以在较宽的范围内选择。优选地，VdSCP27蛋白能提升植物对灰葡萄孢菌、辣椒疫霉菌、大丽轮枝菌、镰孢菌和叶霉菌中至少一种病原体的抗性。
根据本公开，诱导植物防御反应包括诱导目的植株激活自身防御体系，以减少病原体侵染对目的植株造成的危害，所述病原体的种类可以在较宽的范围内选择。优选地，VdSCP27蛋白能诱导减少灰葡萄孢菌、辣椒疫霉菌、大丽轮枝菌、镰孢菌和叶霉菌中至少一种病原体对植物的危害。
根据本公开，所述植物的种类可以在较宽的范围内选择。作为优选情况，所述植物可以包括烟草、棉花、辣椒、拟南芥、马铃薯和番茄中的至少一种。VdSCP27蛋白对上述优选范围内的植物的抗性提高和防御反应诱导的效果更好。
根据本公开，VdSCP27蛋白的应用浓度可以在较宽的范围内选择。本公开VdSCP27蛋白的应用浓度可以为0.001～10μM，优选为0.01～1μM。在上述优选浓度范围内，VdSCP27蛋白能更快、更好地提高植物抗性和/或诱导植物防御反应。
本公开的第二方面提供了一种提高植物抗性和/或诱导植物防御反应的方法，该方法包括：
将VdSCP27蛋白的编码基因导入目的植物，得到抗性提高和/或发生防御反应的植株；或者，
将VdSCP27蛋白或者含有VdSCP27蛋白的组合物施用于目的植株上，得到抗性提高和/或发生防御反应的植株；
其中，所述VdSCP27蛋白的编码基因的多核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述VdSCP27蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
将VdSCP27蛋白的编码基因导入目的植物，VdSCP27蛋白的编码基因瞬时转染目的植物，并表达产生VdSCP27蛋白；或者，直接将VdSCP27蛋白或含有VdSCP27蛋白的组合物导入目的植物，植物识别VdSCP27蛋白后，会产生一系列的防御反应，例如ROS的产生、胼胝质的积累和防御反应相关基因的表达水平上调等，从而达到提高植物抗性和/或诱导植物防御反应的目的。本公开的方法过程相对简单且容易控制。
根据本公开，优选情况下，VdSCP27蛋白的编码基因可以通过植物表达载体导入目的植物。通过植物表达载体导入编码基因，方法简单、快速，而且成功率相对较高。
根据本公开，所述植物表达载体的种类可以在较宽的范围内选择。优选情况下，植物表达载体可以包括Ti类质粒载体和/或病毒载体。上述载体容易获得，成本较低，且上述载体容易携带编码基因，将编码基因导入并转染目的植物的成功率更高。
根据本公开，所述植物的种类可以在较宽的范围内选择。作为优选情况，所述植物可以包括烟草、棉花、辣椒、拟南芥、马铃薯和番茄中的至少一种。本公开方法对上述植物的抗性提高和防御反应诱导的效果更好。
本公开的第三方面提供VdSCP27蛋白在制备农药中的应用，所述农药用于提高植物抗性和/或诱导植物防御反应，所述VdSCP27蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
可将VdSCP27蛋白与其他可接受的助剂制成农药，并将该农药用于提高植物抗性和/或诱导植物防御反应。本公开为制备提高植物抗性和诱导植物防御反应的农药提供了新的原药选择，在农药生产上具有广阔的应用前景。
根据本公开，所述植物的种类可以在较宽的范围内选择。作为优选情况，所述植物可以包括烟草、棉花、辣椒、拟南芥、马铃薯和番茄中的至少一种。本公开含有VdSCP27蛋白的农药对上述植物的抗性提高和防御反应诱导的效果更好。
下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
本公开实施例所涉及的VdSCP27蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。VdSCP27蛋白的制备方法为：构建重组表达载体，利用大肠杆菌进行原核表达，表达载体中具有麦芽糖结合蛋白MBP标签，利用MBP TrapHP预装柱进行纯化，获得目的蛋白。
实施例1 VdSCP27蛋白激发烟草免疫反应
(1)VdSCP27蛋白诱发烟草叶片ROS反应
用1mL不带针头的注射器，将约20μL，100nM的VdSCP27蛋白，从叶片背面注入3～4周龄烟草叶片中。以相同浓度的Tris-HCl(20nM，pH8.0)作为阴性对照。注射6h后，将处理的烟草叶片用去离子水冲洗干净，置于DAB染液中，于25℃避光孵育8h，去除染液并将染色后的烟草叶片用去离子水冲洗干净，用95％乙醇脱色，利用体式显微镜观察并拍照。
结果：注射VdSCP27蛋白的烟草叶片，注射区域有大量的H2O2的积累；注射Tris-HCl的烟草叶片，注射区域H2O2的积累极其微弱，如图1所示。
上述结果说明，VdSCP27蛋白能诱发烟草叶片ROS反应。
(2)VdSCP27蛋白诱发烟草叶片胼胝质积累
用1mL不带针头的注射器，将约20μL，100nM的VdSCP27蛋白，从叶片背面注入3～4周龄烟草叶片中。以相同浓度的Tris-HCl(20nM，pH8.0)作为阴性对照。注射2d后，将注射区叶片用去离子水洗净后，用95％乙醇脱色，再用去离子水将残留的乙醇冲洗干净，将叶片置于pH9.5的含0.1％(W/V)苯胺蓝的150mM磷酸缓冲液中，暗处理2h，然后取出叶片利用荧光显微镜观察并拍照。
结果：注射VdSCP27蛋白的烟草叶片，注射区域有大量的蓝色斑点；注射Tris-HCl的烟草叶片，注射区域仅有极少数蓝色斑点，如图2所示。
上述结果说明，VdSCP27蛋白能诱发烟草叶片胼胝质积累。
(3)VdSCP27蛋白提高烟草防御反应相关基因表达水平
用1mL不带针头的注射器，将约20μL，100nM的VdSCP27蛋白，从叶片背面注入4周龄烟草叶片中。以相同浓度的Tris-HCl(20nM，pH8.0)作为阴性对照。注射12h后，收集注射区域叶片，提取RNA，反转录为cDNA，通过RT-PCR检测防御反应相关基因的表达水平。
结果：注射VdSCP27蛋白的烟草叶片，HR反应标记基因HSR203、H1N1和GRAS2，病程相关基因PR1、PR4和Glnb的表达水平均有一定程度提高。实验结果如图3所示。
上述结果说明，VdSCP27能够有效提高烟草防御相关基因的表达。
实施例2 VdSCP27蛋白诱导烟草对病原菌的抗性反应
用1mL不带针头的注射器，将约20μL，100nM的VdSCP27蛋白，从叶片背面注入4周龄烟草叶片中。以相同浓度的Tris-HCl(20nM，pH8.0)作为阴性对照。注射12h-24h后，用针头在注射区域进行扎孔处理，将提前制备好的5μL，5×106spores/mL的不同待测病原菌孢子悬浮液滴在针眼正上方，于25℃，80％湿度条件下培养，接种3-5d后观察并测量各病斑的面积。实验结果如图4所示。VdSCP27蛋白对各病原菌所致的烟草叶片病斑的抑制情况见表1。
表1 VdSCP27蛋白对各病原菌所致的烟草叶片病斑的抑制情况
Figure BDA0002133739240000081
上述结果说明，VdSCP27蛋白可明显诱导烟草对灰葡萄孢菌、辣椒疫霉菌、大丽轮枝菌、镰孢菌和叶霉菌的抗性反应。
实施例3 VdSCP27蛋白诱导不同植物对灰葡萄孢菌的抗性反应
利用浓度约100nM的VdSCP27蛋白溶液喷洒或灌根处理不同实验组植物，每组实验叶部喷洒1～2mL或灌根10～15mL上述蛋白溶液，实验用植物的数量为20株。以相同浓度的Tris-HCl(20nM，pH8.0)作为阴性对照。处理约24h后，灌根接种20mL提前制备好的5×106spores/mL的灰葡萄孢菌孢子悬浮液，于25℃，80％湿度条件下培养，接种30d观察并统计各实验组植物的发病情况。
根据发病情况划分病情等级为0级、1级、2级、3级、4级，不同病情等级的发病情况为：
0级：植物叶片无病或者几乎没有发病；
1级：25％的叶片出现病状；
2级：26％～50％的叶片出现病状；
3级：51％～75％的叶片出现病状；
4级：76％～100％的叶片出现病状。
不同实验组植物不同病情等级所占比例(％)如表2所示。
表2 不同实验组植物不同病情等级所占比例(％)
Figure BDA0002133739240000091
上述结果说明，VdSCP27蛋白可明显诱导辣椒、棉花、番茄、马铃薯和拟南芥对灰葡萄孢菌的抗性反应。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 中国农业科学院农产品加工研究所
<120> VdSCP27蛋白在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用
<130> 13628CAAS-F-CJY
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 645
<212> DNA
<213> 大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)
<400> 1
atgaagatcc aactcgtcgc cctcttggct ccagttctgg ccctagccag gcccagattt 60
cccacggtcg tcggcccaag cacgcccaac cctaacgaga ttcagatcgt ctcggcccag 120
ttctccggca gtggttgtcc ccagggcagc gtctcgacca ccatttcccc cgaccgcacc 180
gtcatcacct ttggcttcga ccgcttccag acgtacattg gcccaggtat cccctttgcc 240
gagcgcacta agaactgcaa cctgcatctg aacttgcgct acccgagcgg cttccagttt 300
gccgtcgtcg agtcgacgta tcacggcttc gcgcagctcg accagggcgt cagcggcacc 360
ttcttctcga cttacttctt ctcgcaggac gccggcgcca cgacgacgac gtcgacctcg 420
atcgagggcg gcggcatttg gaaggacggc caggtctaca cgaagcagga cgtcatcccc 480
acggcggcgc tcatctgggc ccagtgcggc gccagcggca tcttgaacgt caacaacagg 540
atcaacctcg tcagcagggt cccgtctgct tacggctcca tcaccgacga tgatgctacc 600
gtcgccttta cgcagcaggt taacgtcaag tggcagaagt gctga 645
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)
<400> 2
Met Lys Ile Gln Leu Val Ala Leu Leu Ala Pro Val Leu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Arg Pro Arg Phe Pro Thr Val Val Gly Pro Ser Thr Pro Asn Pro Asn
20 25 30
Glu Ile Gln Ile Val Ser Ala Gln Phe Ser Gly Ser Gly Cys Pro Gln
35 40 45
Gly Ser Val Ser Thr Thr Ile Ser Pro Asp Arg Thr Val Ile Thr Phe
50 55 60
Gly Phe Asp Arg Phe Gln Thr Tyr Ile Gly Pro Gly Ile Pro Phe Ala
65 70 75 80
Glu Arg Thr Lys Asn Cys Asn Leu His Leu Asn Leu Arg Tyr Pro Ser
85 90 95
Gly Phe Gln Phe Ala Val Val Glu Ser Thr Tyr His Gly Phe Ala Gln
100 105 110
Leu Asp Gln Gly Val Ser Gly Thr Phe Phe Ser Thr Tyr Phe Phe Ser
115 120 125
Gln Asp Ala Gly Ala Thr Thr Thr Thr Ser Thr Ser Ile Glu Gly Gly
130 135 140
Gly Ile Trp Lys Asp Gly Gln Val Tyr Thr Lys Gln Asp Val Ile Pro
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Ile Trp Ala Gln Cys Gly Ala Ser Gly Ile Leu Asn
165 170 175
Val Asn Asn Arg Ile Asn Leu Val Ser Arg Val Pro Ser Ala Tyr Gly
180 185 190
Ser Ile Thr Asp Asp Asp Ala Thr Val Ala Phe Thr Gln Gln Val Asn
195 200 205
Val Lys Trp Gln Lys Cys
210

Claims (9)

1.VdSCP27蛋白在提高植物抗性和/或诱导植物防御反应中的应用，所述VdSCP27蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述提高植物抗性，包括：提升植物对灰葡萄孢菌、辣椒疫霉菌、大丽轮枝菌、镰孢菌和叶霉菌中至少一种病原体的抗性；
所述诱导植物防御反应，包括：诱导减少灰葡萄孢菌、辣椒疫霉菌、大丽轮枝菌、镰孢菌和叶霉菌中至少一种病原体对植物的危害。
2.如权利要求1所述的VdSCP27蛋白在提高植物抗性和/或诱导植物防御反应中的应用，其特征在于，所述植物包括烟草、棉花、辣椒、拟南芥、马铃薯和番茄中的至少一种。
3.如权利要求1所述的VdSCP27蛋白在提高植物抗性和/或诱导植物防御反应中的应用，其特征在于，所述VdSCP27蛋白的应用浓度为0.001～10μM。
4.一种提高植物抗性和/或诱导植物防御反应的方法，其特征在于，该方法包括：
将VdSCP27蛋白的编码基因导入目的植物，得到抗性提高和/或发生防御反应的植株；或者，
将VdSCP27蛋白或者含有VdSCP27蛋白的组合物施用于目的植株上，得到抗性提高和/或发生防御反应的植株；
其中，所述提高植物抗性，包括：提升植物对灰葡萄孢菌、辣椒疫霉菌、大丽轮枝菌、镰孢菌和叶霉菌中至少一种病原体的抗性；
所述诱导植物防御反应，包括：诱导减少灰葡萄孢菌、辣椒疫霉菌、大丽轮枝菌、镰孢菌和叶霉菌中至少一种病原体对植物的危害；
所述VdSCP27蛋白的编码基因的多核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述VdSCP27蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述VdSCP27蛋白的编码基因通过植物表达载体导入目的植物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述植物表达载体包括Ti类质粒载体和/或病毒载体。
7.如权利要求4-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述植物包括烟草、棉花、辣椒、拟南芥、马铃薯和番茄中的至少一种。
8.VdSCP27蛋白在制备农药中的应用，所述农药用于提高植物抗性和/或诱导植物防御反应，所述VdSCP27蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述提高植物抗性，包括：提升植物对灰葡萄孢菌、辣椒疫霉菌、大丽轮枝菌、镰孢菌和叶霉菌中至少一种病原体的抗性；所述诱导植物防御反应，包括：诱导减少灰葡萄孢菌、辣椒疫霉菌、大丽轮枝菌、镰孢菌和叶霉菌中至少一种病原体对植物的危害。
9.如权利要求8所述的VdSCP27蛋白在制备农药中的应用，其特征在于，所述植物包括烟草、棉花、辣椒、拟南芥、马铃薯和番茄中的至少一种。
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