CN109721646A - 一种诱导增强水稻稻瘟菌抗性的稻瘟菌分泌蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种稻瘟菌(Magnaporthe oryzae）分泌蛋白及基因序列，并提供了该分泌蛋白在诱导水稻防御反应、提高水稻抗病性方面的应用。该稻瘟菌分泌蛋白质，其氨基酸序列如SEQID NO:1所示。本发明还涉及一种编码上述蛋白质的编码基因，其核苷酸序列如SEQID NO:2。

Description

一种诱导增强水稻稻瘟菌抗性的稻瘟菌分泌蛋白及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种诱导增强水稻稻瘟菌抗性的稻瘟菌分泌蛋白及其应用。

背景技术

植物致病性真菌是世界上许多最具破坏性的植物疾病的致病因子，在全世界造成严重的农业损失。植物病原真菌生活方式多样，与寄主植物以各种方式相互作用：活体营养型从活体宿主组织中进行繁殖和获取养分，死体营养型感染寄主组织并从死亡宿主细胞中获取养分，而半活体营养型真菌则将最初的生物营养阶段与随后的坏死噬菌体结合在一起(Lo Prestietal et al., 2015)。尽管相互作用方式多样，但所有植物病原真菌都会分泌胞外蛋白以促进感染，这些分泌的蛋白质可能在单胞体中作为毒力因子、毒素和降解酶发挥作用，或者在植物细胞质中操纵宿主细胞生理并抑制宿主免疫反应(Giraldo andValent, 2013; Kim et al., 2016)。反过来，植物进化出复杂的免疫系统，以保护自己免受病原体的侵袭，其中包括一个基本防御系统，识别保守的病原体相关分子模式(PAMPs)，以及通过识别分泌的影响蛋白来触发防御反应的第二层免疫系统(Jones and Dangl,2006)。

稻瘟病菌可导致水稻和其它禾本科作物严重病害(Ebbole, 2007; Dean et al.,2012)，它是一种半活体生物营养的真菌病原体，以活体营养型的形式侵入宿主细胞，并在坏死组织上生长。科研人员根据稻瘟菌的全基因组序列，确定了稻瘟菌编码大量假定的分泌蛋白(约739-2,470) (Dean et al., 2005; Yoshida et al., 2009; Choi et al.,2010)。这些分泌蛋白从功能上分为包括PWL1、PWL2 (Kang et al. 1995; Sweigard etal., 1995)、AvrPi-ta (Orbach et al., 2000)、AvrPiz-t (Li et al., 2009), Avr-Pia、Avr-Pii、Avr-Pik/km/kp (Yoshida et al., 2009)、Avr-CO39 (Cesari et al.,2013)、AvrPi9 (Wu et al., 2015)和AvrPib (Zhang et al., 2015; Zhang et al.,2018)等10种无毒(AVR)蛋白，从BAS1到BAS4的四种与生物生长相关的分泌蛋白(Mosqueraet al., 2009)，MPG1 (Talbot et al., 1993)、EMP1 (Ahn et al., 2004)、MHP1 (Kim etal. 2005)、Slp1 (Mentlak et al., 2012)和MC69 (Saitoh et al., 2012)的五种致病所需的分泌蛋白，IUG6、IUG9、NUP1、NUP2、NUP3 (Dong et al., 2015)和MoHEG13 (Mogga etal., 2016)等12个抑制植物细胞坏死蛋白, SPD2、SPD4、SPD7、SPD8、SPD9和SPD10(Sharpee et al., 2016)等12个抑制植物细胞坏死蛋白, 以及MoHrip1 (Chen et al.,2012)、MoCDIP1-MoCDIP5(Chen et al., 2013), MoHrip2 (Chen et al., 2014)、MSP1(Wang et al., 2016)、MoNLP1、MoNLP2、MoNLP4 (Fang et al., 2017)和MoSM1 (Hong etal., 2017)等12个诱导植物细胞坏死蛋白。其中，许多诱导细胞死亡的效应蛋白已经被证明能引起植物的免疫反应。最近的研究发现，有几种效应细胞诱导死亡的蛋白质被认为是PAMPs。如MoHrip1, MoHrip2和 MSP1已被证明能诱导水稻防御反应(Chen et al., 2012;Chen et al., 2014; Wang et al., 2016)。

MoCDIP6是从稻瘟菌鉴定到的分泌蛋白。通过体外表达、纯化MoCDIP6，喷施于水稻植株，能够诱导水稻免疫反应，同时提高水稻对稻瘟病菌的抗性。因此，该蛋白能被作为植物免疫增强剂或诱导剂，应用于生物农药配置。

发明内容

本发明的目的在于针对目前水稻稻瘟菌缺乏有效生物防治药物，提供一种诱导增强水稻稻瘟菌抗性的稻瘟菌分泌蛋白及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明所述的稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）菌株70-15 (Dean et al., 2005,Nature)和Guy11 (Chen et al., 2007, Mol Genet Genomics)为本实验室保存。

通过对受稻瘟菌侵染的水稻叶片做转录组分析，确定了多个在水稻中表达的编码分泌蛋白的效应蛋白，利用瞬时表达分析，确定稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP6能诱导细胞坏死。进一步通过体外表达、纯化MoCDIP6，喷施于水稻秧苗植株，能够增强水稻对稻瘟病菌的抗性。

稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP6的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP6的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。

一种重组表达载体，其含有上述稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP6的编码基因。

进一步的上述重组载体为在pMAL-c2x载体的BamHI位点插入稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP6的编码基因，使MoCDIP6分泌蛋白与麦芽糖标签(MBP)同框融合表达。

一种重组蛋白，利用重组表达载体表达、纯化获得的蛋白MoCDIP6或MoCDIP6与麦芽糖标签融合的重组MBP-MoCDIP6蛋白。

上述稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP6或重组蛋白在诱导水稻稻瘟菌免疫反应中的应用。

上述稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP6或重组蛋白在提高水稻稻瘟菌抗病性中的应用。

本发明的优点为：

稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP6能显著提高水稻对稻瘟菌的抗性。MoCDIP6作为蛋白分子，容易降解，对环境友好，不易产生污染，因而有望作为生物农药前体，在农业生产上具有广阔的应用前景。

附图说明

图 1 为SDS-PAGE检测利用大肠杆菌BL21表达、纯化的MBP-MoCDIP6融合蛋白图。M：Marker ；1：诱导前的BL21细菌溶液； 2：IPTG诱导后的BL21细菌溶液；3：纯化的重组MBP-MoCDIP6蛋白样品。

图2 MBP-MoCDIP6诱导水稻幼苗病程相关基因OsCht1的表达情况。buffer: 缓冲液喷洒水稻幼苗，作为阴性对照1；MBP：以麦芽糖标签表达物(2 μM) 喷洒水稻幼苗，作为阴性对照2；MBP-MoCDIP6：重组的MBP-MoCDIP6 (2 μM)喷洒水稻幼苗。

图3 MBP-MoCDIP6诱导水稻幼苗病程相关基因OsCht3的表达情况。buffer: 缓冲液喷洒水稻幼苗，作为阴性对照1；MBP：以麦芽糖标签表达物(2 μM) 喷洒水稻幼苗，作为阴性对照2；MBP-MoCDIP6：重组的MBP-MoCDIP6 (2 μM)喷洒水稻幼苗。

图4 MBP-MoCDIP6诱导水稻幼苗病程相关基因OsPR1b的表达情况。buffer: 缓冲液喷洒水稻幼苗，作为阴性对照1；MBP：以麦芽糖标签表达物(2 μM) 喷洒水稻幼苗，作为阴性对照2；MBP-MoCDIP6：重组的MBP-MoCDIP6 (2 μM)喷洒水稻幼苗。

图5 MBP-MoCDIP6诱导水稻幼苗病程相关基因OsNac4的表达情况。buffer: 缓冲液喷洒水稻幼苗，作为阴性对照1；MBP：以麦芽糖标签表达物(2 μM) 喷洒水稻幼苗，作为阴性对照2；MBP-MoCDIP6：重组的MBP-MoCDIP6 (2μM)喷洒水稻幼苗。

图6重组MBP-MoCDIP6 (2 μM)预处理的水稻苗提高对水稻稻瘟病的抗性图。A：接种稻瘟菌Guy11后第5天的发病表型；B：接种稻瘟菌Guy11后第5天的病斑相对面积；buffer：缓冲液预处理，作为对照；MBP-MoCDIP6：重组MBP-MoCDIP6 (2 μM)预处理。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1: 稻瘟病效应蛋白MoCDIP6编码基因的克隆

（1）稻瘟病效应蛋白MoCDIP6的分析:

我们在前期研究中通过，对受稻瘟菌侵染的水稻叶片做了转录组分析，确定了多个在水稻中表达的编码分泌蛋白的效应蛋白，利用瞬时表达分析，确定MoCDIP6可能诱导细胞坏死。信号肽剪切后的MoCDIP6成熟蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO:2所示，信号肽剪切后的MoCDIP6氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

（2）设计引物:

根据信号肽剪切后的MoCDIP6编码基因的序列设计引物，引物对碱基序列如下所示:

F1: 5′-TAGGATCCATGGCTCCCACCAGCACCCCT-3′；

R1: 5′-TAGGATCCCTCACAGGATGAAACCCCTCTG-3′。

（3）PCR扩增，获得去信号肽序列的MoCDIP6编码基因

利用上述引物对Fl和R1，以70-15分离的稻瘟病基因DNA作为模板，进行常规PCR扩增后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

扩增反应体系如下:

2 x Reaction Mix: 12.5 μL

引物 Fl (10 μΜ): 1 μL

引物 Rl (10μΜ): 1 μL

Golden DNA Polymerase: 0.2 μL

DNA 模板(20-50 ng/μL): 1 μL

ddH₂O: 补足至 25 μL。

PCR温度循环条件如下: 94℃ 5分钟；94℃ 30秒、58℃ 30秒、72℃ 30秒，35个循环；72℃ 7分钟；10℃保存。

结果：PCR产物经回收测序，序列如SEQ ID NO:2所示。

实施例2: MBP-MoCDIP6重组蛋白表达和纯化

（1）表达载体构建

利用BamHI酶切实施例1获得的PCR扩增片段，插入融合蛋白N末端含有麦芽糖结合蛋白（maltose-binding protein, MBP）的pMAL-c2x载体(New England Biolabs, Ipswich,USA)，转化到大肠杆菌BL21中，挑取阳性克隆，摇菌并提取质粒，酶切并测序验证。

（2）诱导表达

将（1）中验证正确的重组表达菌株过夜活化，pMAL-c2x作为对照。(分别取lmL过夜培养液加入到含有氨苄青霉素(终浓度为100 μg/ml) 100mL LB液体培养基中(1%接种量), 37℃，200 r/min振荡培养2~3h。加入诱导剂IPTG (终浓度为0.5 mM)， 16℃，220 r/min 继续振荡培养过夜，诱导表达目的蛋白。高速离心，收集菌体加入缓冲液。 经超声破碎菌体后，4℃高速离心，收集上请，得到重组蛋白液。取20 µL上清液，加入 5 µL 5×SDS上样缓冲液(变性)重悬菌体，沸水浴中加热10 min, 13000 r/min离心10 min，取上清进行 SDS-PAGE检测，考马斯亮兰R250染色，观察表达情况。

结果：经过SDS-PAGE 检测，获得包含麦芽糖标签的融合表达蛋白MBP-MoCDIP6。

(3）重组蛋白的纯化

利用直链淀粉树脂(New England Biolabs)对MBP-MoCDIP6重组蛋白进行纯化，经SDS-PAGE电泳和考马斯亮兰染色检测，成功获得了MBP-MoCDIP6重组蛋白，见图1。

实施例3: 重组MBP-MoCDIP6蛋白诱导水稻对稻瘟病菌的防卫反应

MBP-MoCDIP6重组蛋白增强水稻抗病性取重组MBP-MoCDIP6蛋白液（2 μM）喷在三周龄的水稻幼苗上，同时以纯化蛋白所用的缓冲液(buffer) (20 mM pH7.4 Tris-HCl，10 mMNaCl，1 mM EDTA，1 mM DTT，10 mM麦芽糖)及麦芽糖标签表达物(MBP) (2 μM)为对照处理水稻幼苗。分接种后0 h, 24 h, 48 h和72 h取样。

用“RNAprep pure植物总RNA提取”试剂盒(TIANGEN公司)提取水稻叶片总 RNA，试验步骤如下：

a、将100 mg植物叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450 μL RL，涡旋剧烈震荡混匀，在56°C孵育1-3min。

b、将所有溶液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12,000 rpm离心5min，小心吸取收集管中的上清至RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收

集管中的细胞碎片沉淀。

c、 缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇(通常为225 μL)，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12,000 rpm离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附 柱CR3放回收集管中。

d、 向吸附柱CR3中加入350 μL去蛋白液RW1，12,000 rpm离心60s，倒掉收集 管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

e、 DNaseI工作液的配制：取10 μL DNaseI 储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70 μL RDD溶液，轻柔混匀。

f、 向吸附柱CR3中央加入80 μL的DNaseI工作液，室温放置15 min。

g、 向吸附柱CR3中加入350 μL去蛋白液RW1，12,000 rpm离心60 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

h、 向吸附柱CR3中加入500 μL漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2 min，12,000 rpm离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

i、重复步骤h。

j、12,000 rpm离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻

底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

k、 将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100 μL RNase-Free ddH₂O，室温放置2 min，12,000 rpm离心2 min，得到RNA溶液，测RNA浓度，调成相同浓度。-70°C中保存。

第一链cDNA 的合成，以提取的经完整性和纯度检测合格的总RNA为模板，采用“Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit”试剂盒(Thermo公司)进行cDNA第一条链反转录合成。

具体步骤如下：

a、将试剂盒中各组分混匀并稍微离心，离心后置于冰上。在置于冰上的无菌无核酸酶的PCR管中，按照顺序加入下面的反应物：模板RNA 1 μg，oligo(dT) 18引物1 μL，无核酸酶的高纯水至总体积为12 μL。

b、如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构，将模板和引物的混合液轻轻混 匀，短暂离心，65°C孵育5 min，冰上冷却，离心，再置于冰上冷却。

c、将下列组分按照顺序加入：5 × Reaction Buffer 4 μL，RiboLock™RNA酶抑制剂(20 u/μL) 1 μL，10mM dNTP Mix 2 μL，RevertAid™M-MuLV逆转录酶(200 u/μL) 1 μL，总体为20 μL。

d、轻轻混匀，离心。

e、42°C孵育60 min。

f、70°C加热5 min终止反应。反应产物可直接用于PCR反应或者在-20°C保存少于一周的时间。如想延长保存时间，使用-70°C保存。

以反转录获得的cDNA为模板，OsActin基因为内参, 利用实时荧光定量PCR 分析4个病程相关基因OsCht1，OsCht3，OsNac4和OsPR1b的表达水平。5个基因的引物分别为：

Actin-F: 5’-CTCAACCCCAAGGCTAACAG-3’，

Actin-R: 5’-CCTTCATAGATTGGCACGGT-3’；

Cht1-F: 5’-GCACTGATAACCACTGATCGG-3’，

Cht1-R: 5’-TGTGGGCATTACTGATGATTG-3’；

Cht3-F: 5’-GCGATAACCTGGATTGCTACAA-3’，

Cht3-R: 5’- GTATTTTATTCGTCTGCTC-3’；

Nac4-F: 5’-TCCTGCCACCATTCTGAGATG-3’，

Nac4-R: 5’- TTGCAGAATCATGCTTGCC-3’；

PR1b-F: 5’-ACGGGCGTACGTACTGGCTA-3’，

PR1b-R: 5’-CTCGGTATGGACCGTGAAG-3’。

实时荧光定量PCR体系为20 μL：包括2.0 μL DNA模板，SYBR Premix ExTaq TM (2×) 10 μL，正、反向引物(10μM)各0.4 μL，ROX Reference Dye II (50×) 0.4 μL，和6.8μL ddH₂O。每个样品设置3个重复。PCR扩增程序为：95°C预变性30s； 95°C 3s，60°C 30s，40个循环；95°C 15s，60°C 1min，95°C 15s。反应结束后，确认Real Time PCR的扩增曲线和熔解曲线，制作标准曲线，计算各基因的相对表达量。观察抗性相关基因的表达情况。

结果：荧光定量PCR分析结果见图2、图3、图4、图5。结果表明，MBP-MoCDIP6处理水稻叶片后，能诱导提高病程相关基因的表达。

实施例4: MBP-MoCDIP6诱导水稻增强对稻瘟菌的抗性

以MBP-MoCDIP6蛋白液(2μM) 喷在三周龄的水稻幼苗上。24 h后，用稻瘟病菌菌株Guy11接种水稻。以纯化蛋白所用的缓冲液(buffer) (20 mM pH7.4 Tris-HCl，10 mMNaCl，1 mM EDTA，1 mM DTT，10 mM麦芽糖) 喷在三周龄的水稻幼苗上为对照组。

稻瘟菌的接种方法为：以0.025% 的Tween20缓冲液洗脱稻瘟菌孢子，均匀喷洒在水稻幼苗上，25℃，>95%相对湿度件下培养。5天后观察发病表型，并取样扫描，分析比较植株叶片发病面积，见图6。

图6结果表明：以缓冲液对照(buffer)和MBP-MoCDIP6溶液预处理的水稻幼苗，均有发病，但MBP-MoCDIP6溶液处理的水稻材料发病症状轻微，而对照材料则感病严重。说明重组MBP-MoCDIP6蛋白溶液诱导水稻增强对稻瘟菌的抗性。

以上实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院生物技术研究所 、闽江学院

<120> 一种诱导增强水稻稻瘟菌抗性的稻瘟菌分泌蛋白及其应用

<130> 14

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 146

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ala Pro Thr Ser Thr Pro Glu Ala Thr Thr Thr Glu Leu Gln Thr Arg

1 5 10 15

Ala Phe Ala Phe Asp Leu Asn Ala Phe Asn Asn Phe Gln Phe Val Asn

20 25 30

Gln Asp Leu Ala Tyr Leu Asn Val Leu Asn Gln Phe Ala Phe Asn Asn

35 40 45

Ile His Gly Leu Ala Val Asn Asn Gly Leu Asn Leu Asn Ala Phe Gln

50 55 60

Gly Leu Phe Ala Gln Gln Gln Phe Asp Leu Asn Ser Leu Leu Leu Leu

65 70 75 80

Ser Gln Leu His Thr Phe Asn Gln Ile Ala Ser Leu Gly Val Leu Asn

85 90 95

Asn Phe Asn Leu Gln Ala Phe Gln Phe Gln Asn Phe Gln Leu Gly Leu

100 105 110

Leu Gln Pro Gly Phe Asn Gln Ile Gln Leu Gly Gln Phe Ile Thr Pro

115 120 125

Thr Val Gly Thr Gln Ile Gly Gly Ile Ala Lys Gln Gln Arg Gly Phe

130 135 140

Ile Leu

145

<210> 2

<211> 441

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctcccacca gcacccctga ggctactact actgagcttc agactcgcgc cttcgctttc 60

gacctgaacg cgttcaacaa cttccagttc gtgaaccagg accttgccta cctgaacgtt 120

ctgaaccagt tcgcgttcaa caacatccac ggtctcgctg tcaacaacgg cctcaacctt 180

aatgctttcc agggcctgtt cgcccagcaa cagttcgacc tcaacagcct gctcctgctc 240

tcgcaactgc acaccttcaa ccagatcgcc tcgctcggtg tcctcaacaa cttcaacctc 300

caggccttcc agttccagaa cttccagctc ggcctgctgc agcccggctt caaccagatc 360

cagctcggcc agttcatcac ccccactgtc ggcacgcaaa tcggtggcat cgccaagcag 420

cagaggggtt tcatcctgtg a 441

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> F1

<400> 3

taggatccat ggctcccacc agcacccct 29

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> R1

<400> 4

taggatccct cacaggatga aacccctctg 30

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Actin-F

<400> 5

ctcaacccca aggctaacag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Actin-R

<400> 6

ccttcataga ttggcacggt 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Cht1-F

<400> 7

gcactgataa ccactgatcg g 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Cht1-R

<400> 8

tgtgggcatt actgatgatt g 21

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Cht3-F

<400> 9

gcgataacct ggattgctac aa 22

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> Cht3-R

<400> 10

gtattttatt cgtctgctc 19

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> Nac4-F

<400> 11

tcctgccacc attctgagat g 21

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> Nac4-R

<400> 12

ttgcagaatc atgcttgcc 19

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> PR1b-F

<400> 13

acgggcgtac gtactggcta 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> PR1b-R

<400> 14

ctcggtatgg accgtgaag 19

Claims (7)

1.一种稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP6，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

2.如权利要求1所述的稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP6的编码基因，其特征在于，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于，其含有权利要求1所述稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP6的编码基因。

4.根据权利要求3所述的一种重组表达载体，其特征在于，所述重组载体为在pMAL-c2载体的BamHI位点插入稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP6的编码基因，使MoCDIP6分泌蛋白与麦芽糖标签(MBP)同框融合表达。

5.一种重组蛋白，其特征在于，利用权利要求3和4所述重组表达载体表达、纯化获得的重组MoCDIP6蛋白或MoCDIP6与麦芽糖标签融合的重组MBP-MoCDIP6蛋白。

6.如权利要求1所述的稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP6在诱导水稻稻瘟菌免疫反应和/或在提高水稻稻瘟菌抗病性中的应用。

7.如权利要求5所述的重组蛋白在诱导水稻稻瘟菌免疫反应和/或在提高水稻稻瘟菌抗病性中的应用。