CN113150087B

CN113150087B - 禾谷镰刀菌分泌的植物免疫激活蛋白Fg62及其应用

Info

Publication number: CN113150087B
Application number: CN202110255312.7A
Authority: CN
Inventors: 王源超; 戴凯新; 杨波; 叶文武; 郑小波; 杨森; 王雨音
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2021-03-09
Filing date: 2021-03-09
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2041-03-09
Also published as: CN113150087A

Abstract

本发明公开了一种禾谷镰刀菌分泌的植物免疫激活蛋白Fg62及其应用，该植物免疫激活蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。该植物免疫激活蛋白可显著提高植物的抗病性，使用浓度低，见效快，作用时间长。Fg62利用植物自身的免疫系统，为提高植物抗性提供了新的途径，因而在农业生产上具有广阔的应用前景。

Description

禾谷镰刀菌分泌的植物免疫激活蛋白Fg62及其应用

技术领域

本发明设计生物技术领域，具体地，涉及一种禾谷镰刀菌分泌的植物免疫激活蛋白及其应用。

背景技术

禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)被认为是小麦、大麦和燕麦的经济上重要的病原体，还会危害玉米等其他作物，并且可以侵染这些植物的不同部位引起苗腐、根腐、穗腐等多种植物病，给农业生产造成了巨大损失。同时研究发现，禾谷镰刀菌侵染大豆可以引起大豆的种子、根部、幼苗腐烂、出苗率降低以及豆荚枯萎，且其产生的真菌毒素和次生代谢物也会污染豆荚和种子，威胁人和动物的健康(Ellis et al.,2011)。截至目前，防治禾谷镰刀菌引起的作物病害主要是依靠化学防治例如杀菌剂的使用，这种方法极易造成农产品安全问题，而且残留的药剂还会引起环境污染问题。导致的最终结果是农业可持续发展的制约以及对于人类健康的危害。

在植物和病原体军备竞赛的过程中，植物进化出了复杂而多功能的免疫系统来抵御潜在的病原体。比如，在病原菌侵染植物早期会分泌毒性因子攻击植物，植物则利用细胞表面的模式识别受体(Pattern Recognition Receptors,PRRs)识别病原菌的毒性因子，触发植物的基础免疫反应。这些能够激活植物免疫的因子通常被称为植物免疫激发子(PlantImmunity Inducer，PII)，其中很重要的一类是植物免疫激活蛋白。目前，鉴定微生物分泌的植物免疫诱抗蛋白是国内外研究人员关注的焦点，鉴定具有高活性的免疫诱抗因子，对创制新型植物免疫诱抗剂有着重要的意义。

研究表明在镰刀菌侵染植物的早期，能够诱导植物免疫反应(Rep et al.,2004；Houterman et al.,2008；Shcherbakova et al.,2016；Thynne et al.,2017)。因此，鉴定禾谷镰刀菌分泌的新型植物免疫诱抗蛋白，不仅对研究禾谷镰刀菌效应子的功能及其与植物互作机制具有重要意义，而且也能为农作物病虫害的防控、相关药剂的开发提供有效的蛋白资源。

参考文献

Ellis,M.,K.Broders,P.Paul,and A.Dorrance.Infection of soybean seed byFusarium graminearum and effect of seed treatments on disease undercontrolled conditions.Plant Disease, 2011.95:401-407.

Houterman PM,Cornelissen BJC and Rep M.Suppression of plantresistance gene-based immunity by a fungal effector.Plos Pathogens,2008,4(5):e1000061.

Rep M,Van Der Does H C,Meijer M,et al.A small,cysteine-rich proteinsecreted by Fusarium oxysporum during colonization of xylem vessels isrequired for I-3-mediated resistance in tomato. MolecμLar Microbiology,2004,53(5):1373-1383.

Shcherbakova LA,Odintsova TI,Stakheev AA,et al.Identification of anovel small cysteine-rich protein in the fraction from the biocontrolFusarium oxysporum strain CS-20that mitigates Fusarium wilt symptoms andtriggers defense responses in tomato.Frontiers in Plant Science,2016, 6.

Thynne E,Saur IML,Simbaqueba J,et al.Fungal phytopathogens encodefunctional homologues of plant rapid alkalinization factor(RALF)peptides.Molecular Plant Pathology,2017,18(6):811-824.

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种禾谷镰刀菌分泌的植物免疫激活蛋白Fg62。

本发明的目的之二在于提供一种编码上述禾谷镰刀菌分泌的植物免疫激活蛋白Fg62的基因序列。

本发明的目的之三在于提供一种含有上述植物免疫激活蛋白Fg62编码基因的重组表达载体。

本发明的目的之四在于提供上述禾谷镰刀菌分泌的植物免疫激活蛋白Fg62及其编码基因的应用。

本发明的目的可以采用以下技术方案实现：

本发明提供一种禾谷镰刀菌泌的植物免疫激活蛋白Fg62，该植物免疫激活蛋白具有如 SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明提供上述植物免疫激活蛋白Fg62在诱导植物防御反应及提高植物抗病性中的应用。优选的，所述植物为烟草和大豆。当用于诱导植物抗性，减轻大豆根腐病危害时，所述 Fg62的浓度为1μM。

本发明提供上述禾谷镰刀菌分泌的植物免疫激活蛋白Fg62的编码基因。

作为一种优选技术方案，所述的编码基因为如下(1)或(2)：

(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)与SEQ ID NO.1至少具有70％以上的同源性的核苷酸序列；优选为与SEQ IDNO.1至少具有80％以上的同源性的核苷酸序列；进一步优选为与SEQ ID NO.1至少具有85％以上的同源性的核苷酸序列；更进一步优选为与SEQ ID NO.1至少具有90％以上的同源性的核苷酸序列；最优选为与SEQ ID NO.1至少具有95％以上的同源性的核苷酸序列。

本发明还提供一种包含上述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。优选的，所述的重组载体为在pET-32a中插入Fg62编码基因得到的重组表达载体。该重组载体可用于大肠杆菌BL21表达。得到融合表达蛋白Fg62，能够诱导烟草、大豆等植物产生抗性反应，提高植物免疫力，降低禾谷镰刀菌和大豆疫霉菌引起的大豆根腐病的危害。

上述的植物免疫激活蛋白Fg62在诱导植物防御反应及提高植物抗病性中的应用。

上述的基因、上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在诱导植物防御反应及提高植物抗病性中的应用。

优选的，所述植物为烟草或大豆。进一步优选的，所述的抗病性为对大豆根腐病的抗性。

利用本发明的Fg62氨基酸序列，可以设计和人工合成密码子优化的有利于在大肠杆菌中表达的核酸序列。

本发明所述的植物免疫激活蛋白，可以是通过基因工程技术原核表达得到的蛋白，也可以是利用禾谷镰刀菌培养液纯化得到的蛋白质。具有相同的效果。

本发明所述的室温为25±5℃。

本发明的有益效果为：

该植物免疫激活蛋白可显著提高植物的抗病性，使用浓度低，见效快，作用时间长。Fg62利用植物自身的免疫系统，为提高植物抗性提供了新的途径，因而在农业生产上具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为利用植物表达载体在烟草叶片上注射表达植物免疫激活蛋白Fg62后诱导的烟草叶片过敏反应检测；

图2为检测证实Fg62正常表达的SDS-PAGE检测图，所用抗体为anti-HA；

图3为纯化后植物免疫激活蛋白Fg62的SDS-PAGE检测图，所用抗体为anti-His；

图4为植物免疫激活蛋白Fg62诱导抗病相关基因的表达；

图5为植物免疫激活蛋白Fg62诱导烟草抗辣椒疫霉菌的效果图；

图6为植物免疫激活蛋白Fg62诱导烟草抗辣椒疫霉菌的生物量统计图；

图7为植物免疫激活蛋白Fg62诱导大豆抗禾谷镰刀菌的效果图；

图8为植物免疫激活蛋白Fg62诱导大豆抗禾谷镰刀菌的生物量统计图；

图9为植物免疫激活蛋白Fg62诱导大豆抗大豆疫霉菌的效果图；

图10为植物免疫激活蛋白Fg62诱导大豆抗大豆疫霉菌的生物量统计图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。本发明实施例所涉及引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

实施例1.植物免疫激活蛋白Fg62的分离与鉴定

将禾谷镰刀菌接种于PDA(取去皮马铃薯200g，切成小块，加超纯水煮沸30min，用四层纱布过滤除去马铃薯块，向滤液中加入葡萄糖20g，琼脂粉15g，将滤液用超纯水补足至1000mL，溶化后分装，121℃高压蒸汽灭菌30min)平板上，25℃条件下培养7天，挑取菌落边缘处接种于200mL装有PDB(配方同PDA培养基，琼脂粉不加)液体培养基的 500mL三角瓶中，置于25℃、180r/min的摇床中培养5天，得到禾谷镰刀菌的培养液。取培养滤液在4℃、8000rpm条件下离心30min，收集上清液，用0.22μM的滤膜(Whatman) 进一步过滤去除杂质。收集50mL培养液所得滤液送至深圳华大基因公司进行蛋白质组学分析。基于禾谷镰刀菌基因组已经测序完成，将蛋白质组学分析所得的数据比对禾谷镰刀菌蛋白质数据库，确定了培养滤液中的7个禾谷镰刀菌分泌的候选蛋白。

实施例2.植物免疫激活蛋白Fg62编码基因的克隆与植物瞬时表达

(1)总RNA提取：

以液体培养的禾谷镰刀菌菌丝为材料，总RNA的抽提采用Omega公司RNA提取试剂盒按照说明操作，用分光度计检测其RNA含量和质量。

(2)反转录生成第一链：

取0.7μg RNA作模板，根据Takara公司PrimeScript反转录酶配套试剂使用说明进行cDNA合成，定容至20μL反应。取适量的反转录产物用于随后的基因克隆PCR。

(3)以cDNA第一链为RT-PCR模板，常规方法做PCR，扩增Fg62编码基因的全长：

PCR引物扩增序列：

上游引物：SEQ ID NO.3

(5’-CAGCTAGCATCGATTCCC GGCCCTTGCCGTATCAGCTCT-3’)

下游引物：SEQ ID NO.4

(5’-AATCTCTAGAGGATCCCC GTATACGACGACATGGCAA-3’)，

50μL反应体系为，其中5×buffer 10μL，2.5mM dNTPs 4μL,TakaraPrimerSTARTaq酶 0.5μL,模板cDNA 1μL，加水至50μL；PCR扩增程序为98℃预变性3min，98℃变性15 秒，58℃退火15秒，72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸10min；琼脂糖凝胶上进行电泳分离，溴化乙锭(EB)染色照相，记录结果，并切胶回收Fg62编码基因的PCR产物。用Agarose Gel DNAPurification Kit(TaKaRa)对电泳条带进行回收。切胶回收的Fg62编码基因的PCR产物根据CloneExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme)按照说明操作连接到SmaI 酶切的pGR107::3HA载体(载体购自于BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)上得到 pGR107::Fg62-3HA质粒，转化大肠杆菌感受态细胞JM109，涂LB(含卡纳50μg/mL)平板， 37℃培养16h后菌落PCR验证挑取三个阳性克隆按照质粒提取试剂盒操作(Takara)提取质粒，送南京金斯瑞公司测序，测序所得序列应与SEQ ID NO.1序列一致。测序正确的质粒电击转化到农杆菌GV3101中，涂LB(含卡纳霉素50μg/mL，利福平50μg/mL)平板，28℃培养48h后菌落PCR验证挑取正确克隆进行后续实验。

(4)农杆菌培养：

分别从平板上挑取转染pGR107::Fg62-3HA载体及pGR107::GFP-3HA载体的农杆菌GV3101单菌落，分别接种到2mL LB液体培养基中(含卡纳霉素50μg/mL，利福平50μg/mL)于恒温摇床上28℃，200rpm培养过夜至OD600为2.0。将过夜培养的GV3101 农杆菌液5000g离心3min收集菌体。用缓冲液(组分：10mM 2-[N-morpholino]ethanesμL fonic acid,10mMMgCl₂,200μM乙酰丁香酮pH 5.6)悬浮菌液后离心收集菌体。重复洗2次后，用缓冲液稀释菌体，最终浓度各为OD₆₀₀＝1.0。

(5)烟草叶片上瞬时表达Fg62编码基因

将配好的农杆菌用1mL去掉针头的注射器注射到烟草叶片中，注射后烟草于温室(21- 23℃、14h光照/10h黑暗)培养。

(6)Fg62蛋白累计量检测

收集注射两天后的烟草叶片进行蛋白累计量的检测。将收集的烟草叶片液氮速冻后研磨加入蛋白提取液(组分为：150mM NaCl,50mM Tris-HCl pH 7.5,1.0％(v/v)NP-40,1.0％(v/v) protease inhibitor cocktail)混匀至于冰上30min。18000g离心收集上清液80μL加入20μL 5 倍蛋白上样缓冲液混合均匀后沸水浴5min。取10μL样品在SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离，120V跑胶1.5h。反应结束后将蛋白样品转到PVDF膜上，用5％(g/100ml)PBST牛奶孵育封膜。加入1:5000稀释的HA一抗(Abmart)孵育2h后用PBST洗膜5min三次，随后加入1:10000稀释的鼠抗(LI-COR,irdye 800,926-32210)孵育30min后用PBST洗膜5min三次，扫膜拍照。

结果：烟草叶片上瞬时表达Fg62三天后，烟草叶片出现了明显的过敏性坏死反应(如图1)。Western检测证实Fg62能够正常表达(如图2)。

实施例3.植物免疫激活蛋白Fg62的原核表达和纯化

(1)原核表达载体的构建

设计植物免疫激活蛋白Fg62编码基因的特异性引物，

上游引物：SEQ ID NO.5

(5’-AAGGCCATGGCTGATATGATCTTCACCAACTTC-3’)，

下游引物：SEQ ID NO.6

(5’-GAATTCGGATCCGATGTATACGACGACATGGCAA-3’)，

50μL反应体系为，其中5×buffer 10μL，2.5mM dNTPs 4μL,TakaraPrimerSTARTaq酶 0.5μL,模板cDNA 1μL，加水至50μL；PCR扩增程序为98℃预变性3min，98℃变性15 秒，58℃退火15秒，72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸10min；琼脂糖凝胶上进行电泳分离，溴化乙锭(EB)染色照相，记录结果，并切胶回收Fg62编码基因的PCR产物。用Agarose Gel DNAPurification Kit(TaKaRa)对电泳条带进行回收。切胶回收的Fg62编码基因的PCR产物根据CloneExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme)按照说明操作连接到pET- 32a载体上得到pET-32a-Fg62质粒，转化大肠杆菌感受态细胞JM109，涂LB(含氨苄50μg/mL)平板，37℃培养16h后菌落PCR验证挑取三个阳性克隆按照质粒提取试剂盒操作(Takara)提取质粒，送南京金斯瑞公司测序，序列如SEQ ID NO.1。测序正确的质粒热激转化大肠杆菌BL21感受态细胞涂LB(含氨苄50μg/mL)平板，37℃培养16h后菌落PCR验证挑取阳性克隆用于后续实验。

(2)蛋白诱导表达

将验证正确的表达菌株过夜活化，同时取含有pET-32a-GFP的菌株作为对照。分别取 1mL过夜培养液加入到含有50μg/mL氨苄的100mL LB液体培养基中(2％接种量)，37℃，200r/min振荡培养2～3h培养至OD600为0.6～0.8。加入诱导剂IPTG(终浓度为1mM)， 20℃，220r/min继续振荡培养16h，诱导表达目的蛋白。高速离心，收集上清，加入硫酸铵过夜沉淀。高速离心取沉淀，加入缓冲液重悬，过滤后加蛋白上样缓冲液沸水浴中加热 10min，进行SDS-PAGE检测，考马斯亮兰染色。

结果：经过SDS-PAGE检测，获得一个分子量约41kD的包含His的融合表达蛋白(His-Fg62)。

(3)原核表达蛋白的纯化

使用AKTA Explorer 100蛋白纯化仪进行原核表达蛋白的纯化。选用His标签蛋白纯化柱进行亲和层析，先用清洗缓冲液平衡亲和层析柱；取步骤(2)中得到的蛋白溶液进样，流速为1mL/min，至基线平稳后，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰，利用超滤管将洗脱峰的组分进行脱盐处理，随后进行SDS-PAGE电泳检测蛋白的纯度。

结果：获得纯化后的原核表达蛋白(His-Fg62)如图3。

实施例4.植物免疫激活蛋白Fg62在烟草上引起的防卫反应

(1)Fg62诱导抗性相关基因转录水平显著升高

经测定浓度后的Fg62溶液稀释到1μM，均匀喷雾烟草，以0.1％维大利作为对照，1μM 的BSA作为阴性对照，各处理3株，重复3次。诱导72h后，收集烟草中部叶片样品，进行抗性相关基因转录水平的检测。提总RNA的抽提采用Omega公司RNA提取试剂盒按照说明操作，用分光度计检测其RNA含量和质量。

反转录生成第一链:取0.7μg RNA作模板，根据Takara公司PrimeScript反转录酶配套试剂使用说明进行cDNA合成，定容至20μL反应。反转录产物用水进行3倍稀释用于实时定量PCR反应检测基因沉默效率。

实时荧光定量PCR反应所用引物如下：

NbCYP71D20上游引物：SEQ ID NO.7

5’-CCGCACCATGTCCTTAGAG-3’

NbCYP71D20下游引物：SEQ ID NO.8

5’-CTTGCCCCTTGAGTACTTGC-3’

NbPia5上游引物：SEQ ID NO.9

5’-CCTCCAAGTTTGAGCTCGGATAGT-3’

NbPia5下游引物：SEQ ID NO.10

5’-CCAAGAAATTCTCCATGCACTCTGTC-3’

NbPR1上游引物：SEQ ID NO.11

5’-CCGCCTTCCCTCAACTCAAC-3’

NbPR1下游引物：SEQ ID NO.12

5’-GCACAACCAAGACGTACTGAG-3’

NbPR2上游引物：SEQ ID NO.13

5’-CATCACAGGGTTCGTTTAGGA-3’

NbPR2下游引物：SEQ ID NO.14

5’-GGGTTCTTGTTGTTCTCATCA-3’

NbEF1a上游引物：SEQ ID NO.15

5’-TGGTGTCCTCAAGCCTG GTA-3’

NbEF1a下游引物：SEQ ID NO.16

5’-TGCATATCCTGAGAAACCATT-3’

PCR反应体系包含cDNA 5μL，SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNase H Plus)10μL,前后引物各0.4μL，ROX Reference Dye II 0.4μL，水13.8μL。反应程序：I:95度30秒，II:95度5秒，60度34秒，步骤II反应40个循环。溶解曲线分析程序是：95度15秒，60度1 分钟，95度15秒。数据分析采用2-ΔΔCT方法，检测结果如图6所示。参考文献:Livak, K.J.,andSchmittgen,T.D.(2001).Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method.Methods 25,402-408.

结果：荧光定量PCR结果表明1μM Fg62蛋白处理烟草叶片后6h，诱导烟草抗病相关基因的表达量显著升高(如图4)。

(2)Fg62增强烟草对烟草辣椒疫霉菌的抗性

将纯化后的Fg62溶液稀释到1μM，均匀喷雾烟草，以0.1％维大利作为对照，1μM的BSA作为阴性对照，各处理3株，重复3次。诱导72h后，在处理的叶片上接种辣椒疫霉，接种3d取样利用荧光定量PCR进行辣椒疫霉菌侵染生物量测定。

结果：与对照相比，使用Fg62处理的烟草叶片在接种辣椒疫霉菌后均出现病斑长度显著性减小，辣椒疫霉侵染的生物量显著降低(图5、6)。

PcActin上游引物：SEQ ID NO.17

5’-AGGAGATGGCCAAGTTAGC-3’

PcActin下游引物：SEQ ID NO.18

5’-CCGACTCATCATACTCGG-3’

实施例5.植物免疫激活蛋白Fg62增强大豆的抗病性

(1)Fg62增强大豆对禾谷镰刀菌的抗性

将纯化后的Fg62溶液稀释到1μM，将大豆种子浸泡到1μM Fg62溶液中，室温遮光处理12h后，取出大豆种子，种进拌有禾谷镰刀菌的土中，温室中培养10天后进行观察拍照(22-25℃的温度条件，70-80％的湿度条件，日循环光照16h，黑暗8h)。每处理10株，重复3次。

结果：与对照相比，使用Fg62处理的大豆在拌有禾谷镰刀菌的土中生长状态更好，存活率和鲜重显著增加(图7、8)。

(2)Fg62增强大豆对大豆疫霉菌的抗性

将纯化后的Fg62溶液稀释到1μM，将大豆种子浸泡到1μM Fg62溶液中，室温遮光处理12h后，取出大豆种子，种进拌有大豆疫霉菌的土中，温室中培养10天后进行观察拍照(22-25℃的温度条件，70-80％的湿度条件，日循环光照16h，黑暗8h)。每处理10株，重复3次。

结果：与对照相比，使用Fg62处理的大豆在拌有大豆疫霉菌的土中生长状态更好，存活率和鲜重显著增加(图9、10)。

序列表

Fg62编码基因全长核苷酸序列：SEQIDNO.1(DNA序列)禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)序列长534

atgatcttcaccaacttcatcgccggcgctatcgccctctctgtcggtgtcagcgccggcccttgccgtatcagctctcagacaactgggactgct gccaccaccactgctgaggcctcgctcgcaacctctaccgttctcaccaccactgccctcgatttcactaccgatcttaccaccttccttaccttga ctggcacaaccactgctgagaccacttccgccgctgaggaaaccacctctgctgccgaggagaccaccactgccgctgatgagacaactgct atcgagaccactgctgtcgatactactactcttgaggccactacaactgccgaggctaccactaccgccgaagtcatcactactcaggccacca gcgctgcacctgaagcgacaacctcttcagctgtgactgtccagtgcaataccaacgaggagtgcgattcccttctcgacgtcagcggactgag ctgcatggagaacacttgcgagtgcaggactgaccatctttgccatgtcgtcgtatactaa

Fg62全长蛋白序列：SEQIDNO.2(氨基酸序列)禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)序列长177

MIFTNFIAGAIALSVGVSAGPCRISSQTTGTAATTTAEASLATSTVLTTTALDFTTDLTTFLTLT GTTTAETTSAAEETTSAAEETTTAADETTAIETTAVDTTTLEATTTAEATTTAEVITTQATSAA PEATTSSAVTVQCNTNEECDSLLDVSGLSCMENTCECRTDHLCHVVVY

SEQ ID NO.3(DNA人工序列Artificial sequence)序列长39

cagctagcatcgattccc ggcccttgccgtatcagctct

SEQ ID NO.4(DNA人工序列Artificial sequence)序列长37

aatctctagaggatcccc gtatacgacgacatggcaa

SEQ ID NO.5(DNA人工序列Artificial sequence)序列长33

aaggccatggctgatatgatcttcaccaacttc

SEQ ID NO.6(DNA人工序列Artificial sequence)序列长34

gaattcggatccgatgtatacgacgacatggcaa

SEQ ID NO.7(DNA人工序列Artificial sequence)序列长19

ccgcaccatgtccttagag

SEQ ID NO.8(DNA人工序列Artificial sequence)序列长20

cttgccccttgagtacttgc

SEQ ID NO.9(DNA人工序列Artificial sequence)序列长24

cctccaagtttgagctcggatagt

SEQ ID NO.10(DNA人工序列Artificial sequence)序列长26

ccaagaaattctccatgcactctgtc

SEQ ID NO.11(DNA人工序列Artificial sequence)序列长20

ccgccttccctcaactcaac

SEQ ID NO.12(DNA人工序列Artificial sequence)序列长21

gcacaaccaagacgtactgag

SEQ ID NO.13(DNA人工序列Artificial sequence)序列长21

catcacagggttcgtttagga

SEQ ID NO.14(DNA人工序列Artificial sequence)序列长21

gggttcttgttgttctcatca

SEQ ID NO.15(DNA人工序列Artificial sequence)序列长20

tggtgtcctcaagcctg gta

SEQ ID NO.16(DNA人工序列Artificial sequence)序列长21

tgcatatcctgagaaaccatt

SEQ ID NO.17(DNA人工序列Artificial sequence)序列长19

aggagatggccaagttagc

SEQ ID NO.18(DNA人工序列Artificial sequence)序列长18

ccgactcatcatactcgg。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 禾谷镰刀菌分泌的植物免疫激活蛋白Fg62及其应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 534

<212> DNA

<213> 禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)

<400> 1

atgatcttca ccaacttcat cgccggcgct atcgccctct ctgtcggtgt cagcgccggc 60

ccttgccgta tcagctctca gacaactggg actgctgcca ccaccactgc tgaggcctcg 120

ctcgcaacct ctaccgttct caccaccact gccctcgatt tcactaccga tcttaccacc 180

ttccttacct tgactggcac aaccactgct gagaccactt ccgccgctga ggaaaccacc 240

tctgctgccg aggagaccac cactgccgct gatgagacaa ctgctatcga gaccactgct 300

gtcgatacta ctactcttga ggccactaca actgccgagg ctaccactac cgccgaagtc 360

atcactactc aggccaccag cgctgcacct gaagcgacaa cctcttcagc tgtgactgtc 420

cagtgcaata ccaacgagga gtgcgattcc cttctcgacg tcagcggact gagctgcatg 480

gagaacactt gcgagtgcag gactgaccat ctttgccatg tcgtcgtata ctaa 534

<210> 2

<211> 177

<212> PRT

<213> 禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)

<400> 2

Met Ile Phe Thr Asn Phe Ile Ala Gly Ala Ile Ala Leu Ser Val Gly

1 5 10 15

Val Ser Ala Gly Pro Cys Arg Ile Ser Ser Gln Thr Thr Gly Thr Ala

20 25 30

Ala Thr Thr Thr Ala Glu Ala Ser Leu Ala Thr Ser Thr Val Leu Thr

35 40 45

Thr Thr Ala Leu Asp Phe Thr Thr Asp Leu Thr Thr Phe Leu Thr Leu

50 55 60

Thr Gly Thr Thr Thr Ala Glu Thr Thr Ser Ala Ala Glu Glu Thr Thr

65 70 75 80

Ser Ala Ala Glu Glu Thr Thr Thr Ala Ala Asp Glu Thr Thr Ala Ile

85 90 95

Glu Thr Thr Ala Val Asp Thr Thr Thr Leu Glu Ala Thr Thr Thr Ala

100 105 110

Glu Ala Thr Thr Thr Ala Glu Val Ile Thr Thr Gln Ala Thr Ser Ala

115 120 125

Ala Pro Glu Ala Thr Thr Ser Ser Ala Val Thr Val Gln Cys Asn Thr

130 135 140

Asn Glu Glu Cys Asp Ser Leu Leu Asp Val Ser Gly Leu Ser Cys Met

145 150 155 160

Glu Asn Thr Cys Glu Cys Arg Thr Asp His Leu Cys His Val Val Val

165 170 175

Tyr

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagctagcat cgattcccgg cccttgccgt atcagctct 39

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aatctctaga ggatccccgt atacgacgac atggcaa 37

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaggccatgg ctgatatgat cttcaccaac ttc 33

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaattcggat ccgatgtata cgacgacatg gcaa 34

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccgcaccatg tccttagag 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cttgcccctt gagtacttgc 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cctccaagtt tgagctcgga tagt 24

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccaagaaatt ctccatgcac tctgtc 26

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccgccttccc tcaactcaac 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcacaaccaa gacgtactga g 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

catcacaggg ttcgtttagg a 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gggttcttgt tgttctcatc a 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tggtgtcctc aagcctggta 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tgcatatcct gagaaaccat t 21

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aggagatggc caagttagc 19

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ccgactcatc atactcgg 18

Claims

1.氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的禾谷镰刀菌分泌的植物免疫激活蛋白Fg62在（1）或（2）中的应用：

（1）增强烟草对辣椒疫霉菌的抗性；

（2）增强大豆对禾谷镰刀菌或大豆疫霉菌的抗性。

2.核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因，或含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因的重组载体、表达盒或重组菌在（1）或（2）中的应用：

（1）增强烟草对辣椒疫霉菌的抗性；

（2）增强大豆对禾谷镰刀菌或大豆疫霉菌的抗性。