CN103436538A

CN103436538A - 一种抗菌肽及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN103436538A
Application number: CN2013103865564A
Authority: CN
Inventors: 茆振川; 张文玥; 凌键; 陈国华; 杨宇红; 谢丙炎
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-08-30
Filing date: 2013-08-30
Publication date: 2013-12-11

Abstract

本发明公开的一种抗菌肽，其基因序列为抗菌肽Snakin中无信号肽的基因编码序列。还公开了制备抗菌肽的方法，包括如下步骤，(1)提取辣椒叶片组织的总RNA，并采用反转录酶获得第一链cDNA备用；(2)经过PCR技术克隆得到抗菌肽Snakin中无信号肽的基因编码序列，记为Sn基因序列；(3)形成重组质粒；(4)筛选出重组成功的质粒，记为pET-Sn；(5)将上步重组成功的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并采用IPTG进行诱导表达，同时分泌出蛋白质；(6)对(5)步分泌出蛋白的感受态细胞进行超声波破碎，离心后收集上清液中的抗菌肽。本发明的优点为，得到了不含信号肽的抗菌肽，该抗菌肽对南方根结线虫有灭杀作用。

Description

一种抗菌肽及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是一种抗线虫肽及其制备方法与应用。

背景技术

植物寄生线虫是农业生产中的一项重要病害，是世界性的病害，破坏性强、寄主种类多，分布范围广泛，防治难度极大，严重阻碍农业的持续发展，每年给全球农业造成1,570亿美元的经济损失。

目前，植物寄生线虫的防治通常化学杀线虫剂、栽培技术和培育抗性品种等措施。但由于化学杀线虫药剂的食品安全及环境问题，其使用受到严格的控制。根结线虫寄主范围可以达到3000多种，主要危害植物的根部，因此通过轮作方法防治根结线虫是非常有限的。生物防治具有广阔的生物资源潜力，且对环境及人具有一定的安全性，但是生物防治效果不稳定且，易受环境影响，不易商品化，目前只有极少数的菌种用于生防。采用抗线虫基因是防治植物寄生性线虫的高效措施，但是现在发现的抗线虫基因数量很少，资源有限，且面临着线虫毒性种群分化导致抗性极易丧失等问题。Snakin为新型的植物抗菌肽，并已经发现其对植物寄生性线虫具有高效的防治作用，且具有生物安全、分子量小、易于遗传改造等特点，在防治植物寄生性线虫方面显示出独特的优势。因此，发掘和克隆植物中的Snakin家族基因为新型转基因抗线虫新品种培育提供重要的基因来源和技术支撑，对保障我国农业的可持续发展具有重要战略意义。

植物抗菌肽(Antimicrobial protein AMP)是一类分子量小、呈碱性、富含半胱氨酸的短肽，为重要的蛋白酶抑制剂，通常在很低的浓度下(<10⁶M)就能表现出广谱抗菌活性，在植物的防御反应中起着重要的作用，现在已经有超过500抗菌肽被报导。Snakin是一种新型的植物抗菌肽，通常富含半胱氨酸，分量小于11KDa，具有二硫键维持的稳定球形分子结构，具有与赤霉素诱导蛋白及某些蛇毒素具有相似结构。Snakin蛋白属于GASA超家族，具有赤霉素诱导蛋白的pfam，他们在茄科植物中具有较高表达量。遗传分析证实Snakin家族包含三个亚家族，现在已经报道的相关基因有多个基因，分别来自不同的植物如马铃薯(Solanum tuberosum)、拟南芥(Arabidopsis)、辣椒(Capsicum annuum)，以及番茄(Solanum lycopersicum)。

Snakin蛋白为既可以是植物本身组成型表达的一个防御蛋白，也可以被生物及非生物因素诱导表达的蛋白。无论是离体还是活体条件下Snakin蛋白都具有抗菌活性，例如抗细菌(Clavibacter michiganensis)及真菌作用。同时，Snakin蛋白处理根结线虫及秀丽杆线虫，发现证实该蛋白可以是秀丽杆线虫活性降低，生长停止直至死亡。通过基因组扫描可以发现在植物中Snakin家族基因是广泛存在的，且受生物及非生物诱导表达的第二亚家族基因数量要远远高于第1、3亚家族。说明在植物中少数Snakin基因是组成型表达，二大多数为诱导表达，也说明Snakin家族基因在抗线虫作用中具有重要的挖掘潜力。同时，Snakin基因与其他抗病基因具有很好的融合性，Snakin与植物防御素、Bt蛋白及多基因融合提供了支持，为提高寄主的抗植物寄生性线虫效果及其持久利用奠定了基础。

发明内容

基于上述原因，本发明提供了一种抗菌肽及其制备方法与应用，在不改变已知的辣椒抗菌肽Snakin氨基酸序列的前提下，克隆得到无信号肽的基因序列，这样得到的抗菌肽只含有成熟的抗菌肽，分子量更小，经过验证该抗菌肽可以用于防治南方根结线虫。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为，本发明得到的一种新的抗菌肽，其基因序列为抗菌肽Snakin中无信号肽的基因编码序列，该基因序列为：attcaaactg atcatgt tgc cagcaatgct atttctgaag ctgcttattc ctacaagaaa atcgattgtg ggggaaagtg ttcagcgagg tgccgattat cgtcaaggcc aagattgtgt aagagggcat gtggaacttg ctgtgctaga tgcaactgtg ttcctcctgg cacttctggc aacactcaga cttgcccttg ctatgccaat atgactactc acggcaacag acgcaaatgc cct taa。该基因含有246个核苷酸，编码多肽含有81个氨基酸，分子量为8.7KDa，无辣椒抗菌肽Snakin信号肽序列，为成熟的抗菌肽基因序列，经过试验验证，可以对南方根结线虫起到灭杀的作用。

本发明还公开了一种制备所述抗菌肽的方法，包括如下步骤，(1)采用trizol方法提取辣椒叶片组织的总RNA，并采用反转录酶获得第一链cDNA备用；

(2)根据已知抗菌肽Snakin基因的序列，设计上游引物、下游引物，以第一链cDNA为模板，经过PCR技术克隆得到抗菌肽Snakin中无信号肽的基因编码序列，并进行测序得到全长的基因序列，记为Sn基因序列；所述上游引物序列为5′ATT CAA ACT GAT CAT GTT GC3′，下游引物序列为5′TTA AGG GCA TTT GCG TCT3′；

(3)将(2)步得到的Sn基因序列克隆到原核表达载体pET28a(+)形成重组质粒；

(4)再将(3)步得到的全部重组质粒转化到DH5α细菌感受态细胞中，从中筛选出重组成功的质粒，记为pET-Sn；

(5)将上步重组成功的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并采用IPTG进行诱导表达，使感受态细胞表达出抗菌肽，记为抗菌肽Sn，同时分泌出蛋白质；

(6)对(5)步分泌出蛋白的感受态细胞进行超声波破碎，离心后收集上清液中的抗菌肽。

所述步骤(2)的具体操作方法为：①根据已经发表的马铃薯及拟南芥中的snakin家族基因序列，经过生物信息学软件分析出共同的保守区域，设计出上游引物序列为5′ATT CAA ACT GAT CAT GTT GC3′、下游引物序列为5′TTA AGG GCA TTT GCG TCT3′；

②以第一链cDNA为模板，经过PCR技术克隆得到抗菌肽Snakin中无信号肽的基因编码序列，PCR技术所使用的试剂盒，其成份包括：

PCR扩增反应程序为，94℃预变性5min；94℃变性40 sec；63℃退火30 sec；72℃延伸1min；35次循环，72℃延伸10 min；

③对得到的PCR产物经过切胶回收，进行测序分析，确定出抗菌肽Snakin中无信号肽的基因编码序列的全长序列，记为Sn基因序列，并推测获得相应的氨基酸序列。方法步骤中所用到的扩增试剂，用以配合上游引物、下游引物扩增胡基因的最合适的试剂。

所述步骤(3)得到重组质粒的具体操作方法为，①提取原核表达载体pET-28a(+)的质粒，并采用EagI和BamHI对质粒进行双酶切处理，同时将抗菌肽Snakin中的Sn基因序列采用相同的酶酶切下来，在37℃酶切4小时，然后通过琼脂糖凝胶电泳将切下的质粒与Sn基因序列条带切胶回收，酶切质粒的试剂包括：

②将酶切后的Sn基因与质粒进行连接得到重组质粒，在16℃反应过夜，连接所使用的试剂包括如下成份：

所述步骤(4)筛选出重组成功质粒pET-Sn的具体操作方法为，①将重组质粒10μl加入到100ul的DH5α细菌感受态细胞中，放入42℃水浴中热激90s，快速放入冰水中2min，加入不含卡纳的LB培养基中复苏37℃2小时，再将DH5α细菌感受态细胞涂于卡纳抗性平板上，37℃过夜培养；

②在过夜培养的平板上挑取菌落，进行摇菌扩繁，提取细菌细胞中的质粒，如果质粒重组成功，即质粒中含有Sn基因，则采用如下PCR扩增体系能够将质粒中的Sn基因扩增出来，并且采用Eag I和BamHI能够酶切质粒pET-Sn；PCR扩增体系中的上游引物和下游引物是所述步骤(2)中的上游引物和下游引物，PCR扩增体系包括如下成份：

PCR扩增反应程序为，94℃预变性5min；94℃变形40sec；63℃退火30sec；72℃延伸1min；35次循环，72℃延伸10min；

酶切pET-Sn质粒的试剂包括：

所述步骤(5)的具体操作方法为，①将重组成功的质粒Pet-Sn、空载体pET-28a(+)转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂于含有50ug/ml卡纳的卡纳抗性平板上；

②上步平板经37℃培养过夜后，将单菌落接种到5ml、含有50ug/ml卡纳的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；

③再将②步的菌液按质量配比1∶100接种到新鲜的含有50ug/ml卡纳的LB培养基中，37℃培养至0D600为0.6～0.8时，加入IPTG至培养基的终浓度为0.8mm0l/L，此时加入的IPTG开始对Sn基因序列进行诱导表达，诱导6h时后，大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞表达出抗菌肽，记为抗菌肽Sn，分泌出蛋白。

所述步骤(6)中超声波破碎和离心的方法为；①超声破碎：在300W条件下，超声破碎3s间歇3s，共超声破碎30min；②离心：离心速度为1500rpm，离心的时间为20min。

所述的抗菌肽的应用，该抗菌肽作为灭杀南方根结线虫的杀虫液。

综上，本发明的有益效果，通过人工设计合成的抗菌肽Sn，该基因含有246个核苷酸，编码多肽含有81个氨基酸，分子量为8.7KDa，无信号肽序列。通过实验证实该多肽具有显著的杀南方根结线虫作用。因此该基因的人工合成及蛋白的制备技术，为通过生物工程技术防治根结线虫提供了重要的技术储备。

附图说明

图1为本发明合成的抗Sn基因重组质粒示意图，图中kan为卡纳抗性；黑色箭头为靶标基因插入位置；EagI和BamHI为抗Sn基因插入位点对双酶切位点，Sn为本发明抗菌肽基因；

图2为本发明抗菌肽Sn基因的PCR合成示意图，图中，1、DNAmarker；2、靶标基因抗菌肽Sn基因；

图3为本发明方法步骤(4)中对重组成功质粒PCR扩增出Sn基因的图谱，图中1、DNAmarker；2、靶标基因抗菌肽Sn基因；3、pET-Sn为酶切鉴定结果；4、未酶切前pET-Sn质粒；

图4为本发明抗菌肽Sn原核表达蛋白示意图，图中，1、空载体总蛋白检测；2、原核表达Sn蛋白检测；3、蛋白marker；箭头表示抗菌肽Sn基因。

具体实施方式

以下结合具体实施方式进一步说明本发明的内容。

本发明得到的一种抗菌肽，该抗菌肽的基因序列为抗菌肽Snakin中无信号肽的基因编码序列，该基因序列为：attcaaactg atcatgttgc cagcaatgct atttctgaag ctgcttattc ctacaagaaa atcgattgtg ggggaaagtg ttcagcgagg tgccgattat cgtcaaggcc aagattgtgt aagagggcat gtggaacttg ctgtgctaga tgcaactgtg ttcctcctgg cacttctggc aacactcaga cttgcccttg ctatgccaat atgactactc acggcaacag acgcaaatgc cct taa。

本发明开发出的制备所述抗菌肽的方法，包括如下步骤，(1)采用trizol方法提取辣椒叶片组织的总RNA，并采用反转录酶获得第一链cDNA备用；所用到的反转录酶：First-Strand Synthesis Kit (Invitrogen)。

采用trizol方法提取辣椒叶片组织的总RNA，并采用反转录酶获得第一链cDNA备用。总RNA提取步骤如下：

A.将组织在液氮中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10％。

B.研磨液室温(15-30℃)放置5分钟，使得核酸蛋白质复合物完全分离。

C.可选的步骤：4℃，10,000Xg离心10min，取上清液。

D.以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。室温放置3min。

E.5、4℃10,000Xg离心15min，样品分成三层：黄色的有机相、中间层、无的水相，RNA主要存在于水相中，水相的体积约为Trizol体积的60％。取水相进以步操作。

F.取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟

G.7、4℃，12,000g离心10分钟。弃去上清液，离心前RNA是看不到的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。

H.8、按每1ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75％乙醇(OEPC水处理)，涡旋混匀。

I.9、4℃下7500g离心5分钟。小心弃去上清液。

J.10、然后室温或真空干燥5-10分钟，然后将RNA溶于25-200μl水中(DEPC处理)。

第一链cDNA合成步骤：取总RNA50ng-5μg加入5×TransScript

All-in-One SuperMix4μl，并采用RNase-free Water补足20μl，轻轻混匀，42℃孵育30分钟，85℃加热5分钟失活反转录酶。即得到第一链cDNA。

PCR扩增反应程序为，94℃预变性5min；94℃变性40sec；63℃退火 30sec；72℃延伸1min；35次循环，72℃延伸10min；PCR扩增出Sn基因如图2所示。

③对得到的PCR产物经过切胶回收进行测序分析，确定出抗菌肽Snakin中无信号肽的基因编码序列的全长序列，记为Sn基因序列，并推测获得相应的氨基酸序列。基因序列及氨基酸序列见序列表。，回收用到的试剂盒为Easypure Quick Gel Extroction kit，以下采用的均为该回收试剂盒。

酶切Sn基因的试剂包括：

见图1。

②在过夜培养的平板上挑取菌落，进行摇菌扩繁，提取细菌细胞中的质粒，如果质粒重组成功，即质粒中含有Sn基因，则采用如下PCR扩增体系能够将质粒中的Sn基因扩增出来，并且采用EagI和BamHI能够酶切质粒pET-Sn；PCR扩增体系中的上游引物和下游引物是所述步骤(2)中的上游引物和下游引物，PCR扩增体系包括如下成份：

PCR扩增反应程序为，94℃预变性5min；94℃变形40sec；63℃退火30sec；72℃延伸1min；35次循环，72C延伸10min；扩增Sn基因的图谱如图3所示，

酶切pET-Sn质粒的试剂包括：

③再将②步的菌液按质量配比1：100接种到新鲜的含有50ug/ml卡纳的LB培养基中，37℃培养至OD600为0.6～0.8时，加入IPTG至培养基的终浓度为0.8mmol/L，此时加入的IPTG开始对Sn基因序列进行诱导表达，诱导6h时后，大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞表达出抗菌肽，记为抗菌肽Sn，分泌出蛋白。

经本发明得到的抗菌肽的应用，该抗菌肽作为灭杀南方根结线虫的杀虫液。

以下是对于本发明得到的抗菌肽的试验测试内容：

经试验测定本发明得到的抗菌肽Sn蛋白的表达情况：将转化重组质粒的宿主细胞经过诱导表达，经超声波破碎，离心后将抗菌肽集中于上清液中，以便进行研究，具体如下：

将阳性重组质粒pET-Sn及空载体pET-28a(+)分别转化表达宿主 BL21(DE3)，涂于卡纳抗性平板(含50ug/ml Kan)。在37℃培养过夜后，分别将单菌落接种到5ml LB液体培养基中(含50ug/ml Kan)，37℃振荡培养过夜；将饱和菌液按1：100接种到新鲜的LB培养基中(含50ug/ml Kan)，37℃培养至0D600约0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，在诱导6h时，取抗菌肽Sn菌液50ml，加入甘油5ml，20ul的β巯基乙醇，250ul的吐温20，在超声波破碎仪冰水浴中与300W条件下超声破碎30min，超声处理设置为每次3s间歇3s。将菌液在1500rpm离心20min，吸取上清液1ml，加入100μl蛋白上样缓冲液，取8μl上清进行SDS-PAGE电泳检测，其中浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为18％，考马斯亮蓝R250染色，甲醇-冰醋酸脱色液脱色，凝胶成像仪观察分析。如图4所示。

通过凝胶电泳可以看到大约在11KDa处在抗菌肽Sn在重组质粒转化宿主细胞分离上清液中具有一条明显的条带，说明抗菌肽Sn在宿主细胞中得到大量的表达。而经过对比发现在经过超声波破碎的细胞溶液中，抗菌肽Sn表达量明显的高于细胞沉淀中，说明得到的抗菌肽是可溶于水的，经过破碎后主要存在于上清液中。

本发明得到的抗菌肽在灭杀南方根结线虫的应用试验，采用表达抗菌肽Sn的上清液处理南方根结线虫，检测其对线虫的防治效果，具体如下：

(1)将上述制备的抗菌肽Sn产物，溶于水，分别进行1×，10×及100×稀释，用于浸泡处理根结线虫；

(2)制备试验用线虫

采自中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室。将辣椒根系取出，用水轻轻冲洗，小心取下乱开，放在1％的次氯酸钠中消毒3min，再用无菌水冲洗3次，放在含有少量无菌水的培养皿中，在25℃恒温箱中培养，每个24h收集一次孵化的根结线虫J2幼虫。

(3)试验方法

在无菌的细胞培养板上，分别向孔内加入不同浓度的抗菌肽Sn液各 1ml。并以无菌水作为对照，然后分别向处理和对照中加入100ul线虫悬浮液(100条线虫)，放在室温下24h，观察根结线虫的死亡情况，计算校正死亡率，即为杀线虫效果，每个处理重复3次。

(4)试验结果：

通过上述试验，测定不同倍数发酵液处理24h对根结线虫的毒力效果(见表1)，结果表明不同抗菌肽Sn液倍数对线虫的作用效果不同，抗菌肽Sn原液(1×)的作用根结线虫的校正死亡率为99.2％，抗菌肽Sn液稀释后防治效果明显降低在10倍稀释液中杀线虫过只有89.2％，而在100倍稀释液中线虫死亡率与对照没有差异。试验说明发酵液在高浓度下具有良好的防治根结线虫效果。下表为不同浓度发酵液对根结线虫的杀死效果，

以上所述并非对本发明的限制，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种抗菌肽，其特征在于，该抗菌肽的基因序列为抗菌肽Snakin中无信号肽的基因编码序列，该基因序列为：attcaaactg atcatgttgc cagcaatgct atttctgaag ctgcttattc ctacaagaaa atcgattgtg ggggaaagtg ttcagcgagg tgccgattat cgtcaaggcc aagattgtgt aagagggcat gtggaacttg ctgtgctaga tgcaactgtg ttcctcctgg cacttctggc aacactcaga cttgcccttg ctatgccaat atgactactc acggcaacag acgcaaatgc ccttaa。

2.一种制备权利要求1所述抗菌肽的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤，(1)采用trizol方法提取辣椒叶片组织的总RNA，并采用反转录酶获得第一链cDNA备用；

3.根据权利要求2所述制备抗菌肽的方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体操作方法为：①根据已经发表的马铃薯及拟南芥中的snakin家族基因序列，经过生物信息学软件分析出共同的保守区域，设计出上游引物序列为5′ATT CAA ACT GAT CAT GTT GC3′、下游引物序列为5′TTA AGG GCA TTT GCG TCT3′；

PCR扩增反应程序为，94℃预变性5min；94℃变性40 sec；63℃退火30 sec；72℃延伸1 min；35次循环，72℃延伸10 min；

③对得到的PCR产物经过切胶回收，进行测序分析，确定出抗菌肽Snakin中无信号肽的基因编码序列的全长序列，记为Sn基因序列，并推测获得相应的氨基酸序列。

4.根据权利要求2所述制备抗菌肽的方法，其特征在于，所述步骤(3)得到重组质粒的具体操作方法为，①提取原核表达载体pET-28a(+)的质粒，并采用Eag I和BamHI对质粒进行双酶切处理，同时将抗菌肽Snakin中的Sn基因序列采用相同的酶酶切下来，在37℃酶切4小时，然后通过琼脂糖凝胶电泳将切下的质粒与Sn基因序列条带切胶回收，酶切质粒的试剂包括：

酶切Sn基因的试剂包括：

5.根据权利要求2所述制备抗菌肽的方法，其特征在于，所述步骤(4)筛选出重组成功质粒pET-Sn的具体操作方法为，①将重组质粒10μl加入到100ul的DH5α细菌感受态细胞中，放入42℃水浴中热激90s，快速放入冰水中2min，加入不含卡纳的LB培养基中复苏37℃2小时，再将DH5α细菌感受态细胞涂于卡纳抗性平板上，37℃过夜培养；

酶切pET-Sn质粒的试剂包括：

。

6.根据权利要求2所述制备抗菌肽的方法，其特征在于，所述步骤(5)的具体操作方法为，①将重组成功的质粒Pet-Sn、空载体pET-28a(+)转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂于含有50ug/ml卡纳的卡纳抗性平板上；

③再将②步的菌液按质量配比1∶100接种到新鲜的含有50ug/ml卡纳的LB培养基中，37℃培养至0D600为0.6～0.8时，加入IPTG至培养基的终浓度为0.8mmol/L，此时加入的IPTG开始对Sn基因序列进行诱导表达，诱导6h时后，大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞表达出抗菌肽，记为抗菌肽Sn，分泌出蛋白。

7.根据权利要求2所述抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中超声波破碎和离心的方法为；①超声破碎：在300W条件下，超声破碎3s间歇3s，共超声破碎30min；②离心：离心速度为1500rpm，离心的时间为20min。

8.权利要求1所述的抗菌肽的应用，其特征在于，该抗菌肽作为灭杀南方根结线虫的杀虫液。