CN107022552A - 盐生草耐盐基因HgS2及其应用 - Google Patents

盐生草耐盐基因HgS2及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及来源于盐生植物盐生草一个耐盐基因HgS2及其应用。其目的在于提供一个新的耐盐基因HgS2及其编码蛋白与其在提高植物耐盐性和培育耐盐新品种(系)中的应用。耐盐基因HgS2包含如SEQ ID NO.1cDNA的核苷酸序列，分子量为678bp，其cDNA编码序列为SEQ ID NO.1中第30至第290位所述的核苷酸序列，分子量为261bp，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3，由86个氨基酸组成，该基因能够显著提高拟南芥植株的耐盐性。本发明所述的耐盐基因将有助于耐盐作物和植物新品种(系)的培育。

Description

盐生草耐盐基因HgS2及其应用
技术领域
本发明属于植物生物工程和转基因技术领域，具体涉及盐生植物盐生草耐盐基因及其应用。
背景技术
土壤盐渍化已成为限制全球粮食生产的主要因素。据估计，全世界有3.6亿公顷旱作耕地正在遭受水土流失、土壤退化和盐渍化的危害，2.3亿公顷的可灌溉耕地同样受到盐渍化影响。而且，未来几十年全球气候变暖的趋势致使亚热带地区年降水量逐年下降，水资源供需矛盾进一步加剧，农业灌溉的淡水资源不得不优先供应于人畜饮用和城市用水，迫使灌溉农业必须接受用咸水或盐水灌溉的残酷现实。
提高作物耐盐性是解决土壤盐渍化问题的关键。这就要求作物育种必须在提高作物耐盐性方面取得突破，而优良耐盐基因的获得在一定程度上决定了耐盐性育种成败，盐生植物因蕴含更多的耐盐基因和特殊的耐盐机理受到育种家的广泛关注。盐生植物盐生草(Halogeton glomeratus)在我国西北旱区盐渍地广泛分布，对盐渍地适应性极强，是挖掘耐盐基因的优异来源，但关于盐生草中耐盐基因的挖掘鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种盐生草耐盐基因HgS2，以解决当前优良耐盐基因缺乏的现状。
本发明的又一目的在于提供了一种盐生草耐盐基因HgS2的制备方法，从而能够高效、快捷地获得该基因。
本发明的还一目的在于提供了一种所述的盐生草耐盐基因HgS2在提高植株耐盐性的应用。
本发明依据前期盐生草盐胁迫响应转录组学测序结果(Transcriptomicprofiling of the salt-stress response in the halophyte Halogeton glomeratus[J].BMC genomics,2015,16(1):169)，筛选鉴定到盐胁迫诱导表达基因HgS2，进一步以盐生草叶片为材料，分离出HgS2基因，并将该基因连接到表达载体pCAMBIA3300上，而后通过农杆菌浸染法转化拟南芥，连续抗性筛选，获得T2代转基因纯系，经耐盐性验证，HgS2基因能够明显提高拟南芥植株的耐盐性。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种盐生草耐盐基因HgS2，其主要特点在于从盐生草叶片中分离到的HgS2基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1如下,分子量678bp:
所述的盐生草耐盐基因HgS2，其主要特点在于所述的基因cDNA编码序列为分离到的HgS2基因的核苷酸序列中第30至第290位所述的核苷酸序列SEQ ID NO.2如下，分子量为261bp：
所述的盐生草耐盐基因HgS2，所述的基因cDNA编码序列的基因编码蛋白氨基酸序列SEQ ID NO.3，由86个氨基酸组成：
所述的盐生草耐盐基因HgS2，其特异引物为：
HgS2-F1为5’-AAAAAATGGCACAATTTCAGCTCC-3’，
HgS2-R1为5’-GTAGTAGAAATGCGTTGATGTCCA-3’。
由上海生工生物工程公司合成。
所述的盐生草耐盐基因HgS2的制备方法，其主要特点在于步骤为：
以200-500mM NaCl胁迫处理3-7d的盐生草幼苗叶片组织为材料，用Trizol法提取总RNA，采用cDNA合成试剂盒(大连宝生物工程有限公司)反转录合成cDNA第一链，扩增所述基因片段，PCR反应体系为10×Ex Taq Buffer Mg2+Plus 2.5μL，dNTP Mixture各2.5mM 2μL，上游引物F1 5’-AAAAAATGGCACAATTTCAGCTCC-3’10μM 1μL，下游引物R1 5’-GTAGTAGAAATGCGTTGATGTCCA-3’10μM1μL，cDNA 1μL，Ex Taq酶0.2μL，超纯水17.3μL，总体积25μL；扩增程序为94℃4min，94℃50s，60-60.5℃50s，72℃25s，共32-35个循环，72℃延伸7-8min；利用胶回收试剂盒(大连宝生物过程有限公司)回收PCR产物，按照说明书步骤：首先琼脂糖凝胶检测目的片段大小，与目的片段大小一致的DNA片段用小刀片在10min以内切下装入1.5mL离心管中；切下的胶块称重，根据重量换算其体积，1mg＝1μL，然后加3倍体积的Buffer GM用于融化胶块，融化过程中适当振荡或吸打使其充分融化；将Spin柱置于收集管，然后将所有胶块融化液转至Spin柱里，室温离心12000rpm，1min，倒掉滤液；加700μLBuffer WB于Spin柱且静置5min后，室温离心12000rpm，1min，倒掉滤液，重复上一步骤；将空Spin柱放在收集管上，室温离心12,000rpm，1min，放置2min；再将Spin柱放入新离心管上，于膜中央加20-30μL灭菌蒸馏水，放置1min；室温12000rpm，离心1min，用于洗脱DNA，最后吸取2-3μL用于电泳检测，其它产物-20℃保存；接着将回收产物与pMD19-T(北京全式金生物公司)载体连接，得到重组质粒pMD19-HgS2，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选蓝白斑，并进行菌落PCR鉴定，电泳检测含有目标条带的菌液送上海生工生物工程公司进行测序。
所述的盐生草耐盐基因HgS2的表达载体的构建方法，其步骤为：
在所述的盐生草耐盐基因HgS2的上下游引物上分别添加Xba I和Sma I这两个酶切位点，上游引物F1为5’-GCTCTAGAAAAAAATGGCACAATTTCAGCTCC-3’、下游引物R1为5’-CGACCCGGGGTAGTAGAAATGCGTTGATGTCCA-3’，(由上海生工生物工程公司合成):
以200-500mM NaCl胁迫处理3-7d的盐生草幼苗叶片组织为材料，用Trizol法提取总RNA，采用cDNA合成试剂盒(大连宝生物工程有限公司)反转录合成cDNA第一链，扩增该基因片段，PCR反应体系为10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)2.5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)2μL，上游引物5’-GCTCTAGAAAAAAATGGCACAATTTCAGCTCC-3’10μM1μL，下游引物5’-CGACCCGGGGTAGTAGAAATGCGTTGATGTCCA-3’10μM 1μL，cDNA 1μL，Ex Taq酶0.2μL，超纯水17.3μL，总体积25μL；扩增程序为94℃4min，94℃50s，60.0℃50s，72℃25s，共32-35个循环，72℃延伸7min。PCR扩增产物电泳如图1所示，按照说明书步骤，利用胶回收试剂盒(大连宝生物过程有限公司)回收PCR产物，首先琼脂糖凝胶检测目的片段大小，与目的片段大小一致的DNA片段用小刀片迅速切下装入1.5mL离心管中；切下的胶块称重，根据重量换算其体积(1mg＝1μL)，然后加3倍体积的Buffer GM用于融化胶块，融化过程中适当振荡或吸打使其充分融化；将Spin柱置于收集管，然后将所有胶块融化液转至Spin柱里，室温离心12000rpm，1min，倒掉滤液；加700μL Buffer WB于Spin柱且静置5min后，室温离心12000rpm，1min，倒掉滤液，重复上一步骤；将空Spin柱放在收集管上，室温离心12,000rpm，1min，放置2min；再将Spin柱放入新离心管上，于膜中央加25μL灭菌蒸馏水，放置1min；室温12000rpm，离心1min，用于洗脱DNA，最后吸取3μL用于电泳检测，其它产物-20℃保存。接着将回收产物与pMD19-T(北京全式金生物公司)载体连接，得到重组质粒pMD19-HgS2，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α感受态细胞，筛选蓝白斑，并进行菌落PCR鉴定，电泳检测含有目标条带的菌液送上海生工生物工程公司进行测序。PCR测定序列如SEQ ID NO.1:
对HgS2再次进行PCR扩增，链接到T-载体测序，获得的HgS2基因序列如SEQ IDNO.1。提取含有Xba I和Sma I酶切位点的HgS2基因的T-载体和植物表达载体pCAMBIA3300(甘肃农业大学干旱生境作物学重点实验室保存)质粒DNA并用Xba I和Sma I两种内切酶对所提质粒进行双酶切，酶切体系为Sma I 1ul，Xba I 1ul，10×T 2ul，BSA 2ul，质粒DNA6ul，超纯水8ul，总体积20μL。在37℃酶切2.0h，并对酶切产物进行电泳检测并纯化回收。接着用T4 DNA连接酶，对上一步中纯化回收的载体及HgS2基因目的片段进行连接，连接体系为10×T4 DNA Ligase Buffer 1ul，目的片段7ul，载体DNA 1ul，总体积9μL。在65℃水浴保温3min后，即可冰浴1-2min，然后加T4 DNA Ligase 1ul于16℃连接14h，得到重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，筛选蓝白斑并测序，确认得到含有带有目的基因HgS2的重组质粒pCAMBIA3300-HgS2；同时对重组质粒pCAMBIA3300-HgS2在37℃酶切2.5h，其双酶切体系为Sma I 1μL，Xba I 1μL，10×T 2μL，BSA 2μL，质粒DNA 8μL，超纯水6μL，总体积20μL，并对双酶切产物进行电泳检测，见图2。
所述的盐生草耐盐基因HgS2在提高植株耐盐性的应用。
本发明提供的重组质粒pCAMBIA3300-HgS2，所述质粒为插入SEQ ID NO.1所示的HgS2基因cDNA的核苷酸序列或cDNA编码序列。需要说明的是，任何可以将外源基因导入植物的表达载体均适用于本发明，包括直接基因转移技术，如基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等；生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法等。
本发明提供的耐盐基因HgS2在提高植物耐盐性的应用可广泛运用于耐盐作物、植物新品种(系)的选育。
本发明有益效果在于首次从盐生植物盐生草中克隆到一个新的耐盐基因，通过转化拟南芥进行耐盐性鉴定，结果表明转化HgS2基因的拟南芥株系表现良好的耐盐性。同时HgS2其分子量很小，不足700bp，极易于遗传转化操作，本发明中耐盐基因的获得为耐盐作物和植物新品种(系)培育提供了宝贵基因资源。
附图说明：
图1 HgS2基因cDNA编码核苷酸序列的扩增结果。M：D1000Marker；1-3为HgS2基因PCR产物；
图2 pCAMBIA3300-HgS2表达载体构建双酶切验证结果。M：D15000Marker；1-2:pCAMBIA3300-HgS2质粒；3-4：酶切电泳结果；
图3转化HgS2基因拟南芥T2代阳性植株分子检测结果。M：DL2000Marker；1-7：抗性苗PCR产物；“-”：空白对照；“WT”：野生型拟南芥；“+”：质粒；
图4转化HgS2 T2代株系在400mM NaCl胁迫下的生长状态。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下面对本发明的内容进行详细的说明。
以下的实施例便于更好地理解本发明，并非限制本发明。下面实施例的实验方法和试剂等，若无特殊说明，均为常规方法和试剂。
实施例1所述的盐生草耐盐基因HgS2的制备方法，其主要特点在于步骤为：
以200mM NaCl胁迫处理7d的盐生草幼苗叶片组织为材料，用Trizol法提取总RNA，采用cDNA合成试剂盒(大连宝生物工程有限公司)反转录合成cDNA第一链，根据HgS2的序列设计上、下游引物F1(5’-AAAAAATGGCACAATTTCAGCTCC-3’)和R1(5’-GTAGTAGAAATGCGTTGATGTCCA-3’)(由上海生工生物工程公司合成)扩增该基因片段，PCR反应体系为10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)2.5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)2μL，上游引物(5’-AAAAAATGGCACAATTTCAGCTCC-3’)(10μM)1μL，下游引物(5’-GTAGTAGAAATGCGTTGATGTCCA-3’(10μM)1μL，cDNA 1μL，Ex Taq酶0.2μL，超纯水17.3μL，总体积25μL；扩增程序为94℃4min，94℃50s，60.5℃50s，72℃25s，共35个循环，72℃延伸8min。PCR扩增产物电泳如图1所示，按照说明书步骤，利用胶回收试剂盒(大连宝生物过程有限公司)回收PCR产物，首先琼脂糖凝胶检测目的片段大小，与目的片段大小一致的DNA片段用小刀片迅速切下装入1.5mL离心管中；切下的胶块称重，根据重量换算其体积(1mg＝1μL)，然后加3倍体积的Buffer GM用于融化胶块，融化过程中适当振荡或吸打使其充分融化；将Spin柱置于收集管，然后将所有胶块融化液转至Spin柱里，室温离心12000rpm，1min，倒掉滤液；加700μL Buffer WB于Spin柱且静置5min后，室温离心12000rpm，1min，倒掉滤液，重复上一步骤；将空Spin柱放在收集管上，室温离心12,000rpm，1min，放置2min；再将Spin柱放入新离心管上，于膜中央加30μL灭菌蒸馏水，放置1min；室温12000rpm，离心1min，用于洗脱DNA，最后吸取3μL用于电泳检测，其它产物-20℃保存。接着将回收产物与pMD19-T载体连接，得到重组质粒pMD19-HgS2，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α感受态细胞，筛选蓝白斑，并进行菌落PCR鉴定，电泳检测含有目标条带的菌液送上海生工生物工程公司进行测序。PCR测定序列见SEQ ID NO.1:
所述的盐生草耐盐基因HgS2，所述的基因cDNA编码序列为分离到的HgS2基因的核苷酸序列中第30至第290位所述的核苷酸序列SEQ ID NO.2如下，分子量为261bp：
所述的盐生草耐盐基因HgS2基因cDNA编码序列的基因编码蛋白氨基酸序列SEQID NO.3，由86个氨基酸组成：
实施例2：所述的盐生草耐盐基因HgS2的制备方法，其特征在于步骤为：
以500mM NaCl胁迫处理3-7d的盐生草幼苗叶片组织为材料，用Trizol法提取总RNA，采用cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA第一链，扩增所述基因片段，PCR反应体系为10×Ex Taq Buffer Mg2+Plus2.5μL，dNTP Mixture各2.5mM 2μL，上游引物F15’-AAAAAATGGCACAATTTCAGCTCC-3’10μM 1μL，下游引物R1 5’-GTAGTAGAAATGCGTTGATGTCCA-3’10μM1μL，cDNA 1μL，Ex Taq酶0.2μL，超纯水17.3μL，总体积25μL；扩增程序为94℃4min，94℃50s，60℃50s，72℃25s，共32个循环，72℃延伸7min；利用胶回收试剂盒回收PCR产物，按照说明书步骤：首先琼脂糖凝胶检测目的片段大小，与目的片段大小一致的DNA片段用小刀片在10min之内切下装入1.5mL离心管中；切下的胶块称重，根据重量换算其体积，1mg＝1μL，然后加3倍体积的Buffer GM用于融化胶块，融化过程中适当振荡或吸打使其充分融化；将Spin柱置于收集管，然后将所有胶块融化液转至Spin柱里，室温离心12000rpm，1min，倒掉滤液；加700μL Buffer WB于Spin柱且静置5min后，室温离心12000rpm，1min，倒掉滤液，重复上一步骤；将空Spin柱放在收集管上，室温离心12,000rpm，1min，放置2min；再将Spin柱放入新离心管上，于膜中央加20-30μL灭菌蒸馏水，放置1min；室温12000rpm，离心1min，用于洗脱DNA，最后吸取2-3μL用于电泳检测，其它产物-20℃保存；接着将回收产物与pMD19-T载体连接，得到重组质粒pMD19-HgS2，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选蓝白斑，并进行菌落PCR鉴定，电泳检测含有目标条带的菌液送上海生工生物工程公司进行测序。
实施例3：所述的盐生草耐盐基因HgS2的表达载体的构建方法，其步骤为：
在所述的盐生草耐盐基因HgS2的上下游引物上分别添加Xba I和Sma I这两个酶切位点，上游引物F1为5’-GCTCTAGAAAAAAATGGCACAATTTCAGCTCC-3’、下游引物R1为5’-CGACCCGGGGTAGTAGAAATGCGTTGATGTCCA-3’:
以200-500mM NaCl胁迫处理3-7d的盐生草幼苗叶片组织为材料，用Trizol法提取总RNA，采用cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA第一链，扩增该基因片段，PCR反应体系为10×Ex Taq Buffer Mg2+Plus 2.5μL，dNTP Mixture各2.5mM 2μL，上游引物5’-GCTCTAGAAAAAAATGGCACAATTTCAGCTCC-3’10μM1μL，下游引物5’-CGACCCGGGGTAGTAGAAATGCGTTGATGTCCA-3’10μM 1μL，cDNA 1μL，Ex Taq酶0.2μL，超纯水17.3μL，总体积25μL；扩增程序为94℃4min，94℃50s，60.5℃50s，72℃25s，共32个循环，72℃延伸7min；按照说明书步骤，利用胶回收试剂盒回收PCR产物，首先琼脂糖凝胶检测目的片段大小，与目的片段大小一致的DNA片段用小刀片迅速切下装入1.5mL离心管中；切下的胶块称重，根据重量换算其体积1mg＝1μL，然后加3倍体积的Buffer GM用于融化胶块，融化过程中适当振荡或吸打使其充分融化；将Spin柱置于收集管，然后将所有胶块融化液转至Spin柱里，室温离心12000rpm，1min，倒掉滤液；加700μL Buffer WB于Spin柱且静置5min后，室温离心12000rpm，1min，倒掉滤液，重复上一步骤；将空Spin柱放在收集管上，室温离心12,000rpm，1min，放置2min；再将Spin柱放入新离心管上，于膜中央加20-30μL灭菌蒸馏水，放置1min；室温12000rpm，离心1min，用于洗脱DNA，最后吸取2-3μL用于电泳检测，其它产物-20℃保存。接着将回收产物与pMD19-T载体连接，得到重组质粒pMD19-HgS2，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α感受态细胞，筛选蓝白斑，并进行菌落PCR鉴定，电泳检测含有目标条带的菌液送上海生工生物工程公司进行测序。
提取含有Xba I和Sma I酶切位点的HgS2基因的T-载体和植物表达载体pCAMBIA3300质粒DNA并用Xba I和Sma I两种内切酶对所提质粒进行双酶切，酶切体系为Sma I 1ul，Xba I 1ul，10×T 2ul，BSA 2ul，质粒DNA 6ul，超纯水8ul，总体积20μL。在37℃酶切2h，并对酶切产物进行电泳检测并纯化回收。接着用T4 DNA连接酶，对上一步中纯化回收的载体及HgS2基因目的片段进行连接，连接体系为10×T4 DNA Ligase Buffer 1ul，目的片段7ul，载体DNA 1ul，总体积9μL。在65℃水浴保温3min后，即可冰浴1-2min，然后加T4DNA Ligase 1ul于16℃连接18h，得到重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，筛选蓝白斑并测序，确认得到含有带有目的基因HgS2的重组质粒pCAMBIA3300-HgS2；同时对重组质粒pCAMBIA3300-HgS2在37℃酶切2.5h，其双酶切体系为Sma I 1μL，Xba I 1μL，10×T 2μL，BSA 2μL，质粒DNA 8μL，超纯水6μL，总体积20μL。
实施例4：所述的盐生草耐盐基因HgS2的表达载体的构建方法，其步骤为：
根据表达载体构建的需要，在实施例1基因HgS2的上下游引物上分别添加Xba I和Sma I这两个酶切位点，上游引物F1为5’-GCTCTAGAAAAAAATGGCACAATTTCAGCTCC-3’、下游引物R1为5’-CGACCCGGGGTAGTAGAAATGCGTTGATGTCCA-3’，(由上海生工生物工程公司合成)：
以500mM NaCl胁迫处理3d的盐生草幼苗叶片组织为材料，用Trizol法提取总RNA，采用cDNA合成试剂盒(大连宝生物工程有限公司)反转录合成cDNA第一链，扩增该基因片段，PCR反应体系为10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)2.5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)2μL，上游引物5’-GCTCTAGAAAAAAATGGCACAATTTCAGCTCC-3’10μM1μL，下游引物5’-CGACCCGGGGTAGTAGAAATGCGTTGATGTCCA-3’10μM 1μL，cDNA 1μL，Ex Taq酶0.2μL，超纯水17.3μL，总体积25μL；扩增程序为94℃4min，94℃50s，60℃50s，72℃25s，共35个循环，72℃延伸8min。PCR扩增产物电泳如图1所示，按照说明书步骤，利用胶回收试剂盒(大连宝生物过程有限公司)回收PCR产物，首先琼脂糖凝胶检测目的片段大小，与目的片段大小一致的DNA片段用小刀片迅速切下装入1.5mL离心管中；切下的胶块称重，根据重量换算其体积(1mg＝1μL)，然后加3倍体积的Buffer GM用于融化胶块，融化过程中适当振荡或吸打使其充分融化；将Spin柱置于收集管，然后将所有胶块融化液转至Spin柱里，室温离心12000rpm，1min，倒掉滤液；加700μL Buffer WB于Spin柱且静置5min后，室温离心12000rpm，1min，倒掉滤液，重复上一步骤；将空Spin柱放在收集管上，室温离心12,000rpm，1min，放置2min；再将Spin柱放入新离心管上，于膜中央加25μL灭菌蒸馏水，放置1min；室温12000rpm，离心1min，用于洗脱DNA，最后吸取2μL用于电泳检测，其它产物-20℃保存。接着将回收产物与pMD19-T载体连接，得到重组质粒pMD19-HgS2，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α感受态细胞，筛选蓝白斑，并进行菌落PCR鉴定，电泳检测含有目标条带的菌液送上海生工生物工程公司进行测序。PCR测定序列如SEQ ID NO.1所示:
对HgS2再次进行PCR扩增，链接到T-载体测序，获得的HgS2基因序列如SEQ IDNO.1所示。提取含有Xba I和Sma I酶切位点的HgS2基因的T-载体和植物表达载体pCAMBIA3300(甘肃农业大学干旱生境作物学重点实验室保存)质粒DNA并用Xba I和Sma I两种内切酶对所提质粒进行双酶切，酶切体系为Sma I 1ul，Xba I 1ul，10×T 2ul，BSA2ul，质粒DNA 6ul，超纯水8ul，总体积20μL。在37℃酶切2.5h，并对酶切产物进行电泳检测并纯化回收。接着用T4 DNA连接酶，对上一步中纯化回收的载体及HgS2基因目的片段进行连接，连接体系为10×T4 DNA Ligase Buffer 1ul，目的片段7ul，载体DNA 1ul，总体积9μL。在65℃水浴保温3min后，即可冰浴1-2min，然后加T4 DNA Ligase 1ul于16℃连接12h，得到重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，筛选蓝白斑并测序，确认得到含有带有目的基因HgS2的重组质粒pCAMBIA3300-HgS2；同时对重组质粒pCAMBIA3300-HgS2在37℃酶切2h，其双酶切体系为Sma I 1μL，Xba I1μL，10×T 2μL，BSA 2μL，质粒DNA 8μL，超纯水6μL，总体积20μL，并对双酶切产物进行电泳检测，如图2所示。
实施例5农杆菌拟南芥转化与培养
制备LBA4404农杆菌并活化，将重组质粒pCAMBIA3300-HgS2转入感受态农杆菌中，制备农杆菌浸染液，采用蘸花法侵染拟南芥花序，然后将侵染的植株覆盖塑料薄膜避光培养24h后移至温室中常规培养，待拟南芥成熟后分单株收获种子。收获的拟南芥种子低温处理、灭菌后撒播在含抗生素Kan(50ug/ml)的1/2MS固体培养基中筛选抗性苗，并移栽培养，待幼苗长大后，剪取植株叶片提取DNA，用实施例1中HgS2基因上下游引物扩增表达载体pCAMBIA3300-HgS2中HgS2片段。连续筛选，并进行目标基因PCR检测(图3)，直到获得T2转HgS2基因拟南芥纯系。
实施例6转HgS2基因拟南芥耐盐性鉴定
将实施例3中获得T2转HgS2基因拟南芥纯系植株和野生型拟南芥(Col-1)种子播种于培养基质(草炭：蛭石：珍珠岩为1:3:0.5体积比混合)中，在人工温室中培养，待幼苗长至1个月后，分别浇灌400mM NaCl溶液，观察幼苗生长情况，结果发现，随着盐胁迫的持续加剧，野生型拟南芥生长受到明显抑制，在盐胁迫处理6d后；已发现野生型拟南芥严重萎蔫逐渐死亡，而转HgS2基因拟南芥生长健壮，当胁迫至9d后；野生型拟南芥全部死亡，而转HgS2基因拟南芥幼苗依旧存活(图4)。由此可见，转化HgS2基因能够提高拟南芥耐盐性，同样可运用与其他植物或作物耐盐性育种。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 甘肃农业大学
<120> 盐生草耐盐基因HgS2及其应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 678
<212> DNA
<213> 盐生草耐盐基因HgS2
<400> 1
gaaaaaaaaa aaaaaagaaa aaagaaaaaa tggcacaatt tcagctcccc aaagcaacct 60
tgttcttcct agtcttcctg tttatgtcaa aagcttgggc aaccacgacg actggcggag 120
gtgacgacga caatgcagtc ctcgactggg agggcaatcc cgtgcaaact aattatccat 180
acttcattgt tccactcaaa ggcttaatga ctggcctcat atactatcca agagtaacta 240
agcgttgcca tatcttgaac gcggctttga gcccccactt agtccaataa tatttaaaga 300
cattacacaa agtgcgcaaa attaaatcct tatggtagac taattccgaa agtctatcat 360
aaaattttca tatgctgtga cgctcggggg tgacaaaaat tcaagccatt tcttcaggat 420
tcggcctgcg agcaatgggg tggattacaa tattcaactt tcttgtcgcc ttatttggtt 480
ttaaagacga tcagcaactg agcatcccca caataatcaa tactactact attactagta 540
tctaaactaa actagaccag ttgtctagtt ggttagtgca cgaggttcag tttgtaccaa 600
aaataagtcc cttggacatc aacgcatttc tactacttca tatattgtat tgtattgtat 660
ggtattctaa aaaaaaaa 678
<210> 2
<211> 261
<212> DNA
<213> 盐生草耐盐基因HgS2的编码序列
<400> 2
atggcacaat ttcagctccc caaagcaacc ttgttcttcc tagtcttcct gtttatgtca 60
aaagcttggg caaccacgac gactggcgga ggtgacgacg acaatgcagt cctcgactgg 120
gagggcaatc ccgtgcaaac taattatcca tacttcattg ttccactcaa aggcttaatg 180
actggcctca tatactatcc aagagtaact aagcgttgcc atatcttgaa cgcggctttg 240
agcccccact tagtccaata a 261
<210> 3
<211> 86
<212> PRT
<213> 盐生草耐盐基因HgS2编码序列的蛋白氨基酸
<400> 3
Met Ala Gln Phe Gln Leu Pro Lys Ala Thr Leu Phe Phe Leu Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Met Ser Lys Ala Trp Ala Thr Thr Thr Thr Gly Gly Gly Asp
20 25 30
Asp Asp Asn Ala Val Leu Asp Trp Glu Gly Asn Pro Val Gln Thr Asn
35 40 45
Tyr Pro Tyr Phe Ile Val Pro Leu Lys Gly Leu Met Thr Gly Leu Ile
50 55 60
Tyr Tyr Pro Arg Val Thr Lys Arg Cys His Ile Leu Asn Ala Ala Leu
65 70 75 80
Ser Pro His Leu Val Gln
85

Claims (7)

1.一种盐生草耐盐基因HgS2，其特征在于从盐生草叶片中分离到的HgS2基因的核苷酸序列如下,分子量678bp:
2.如权利要求1所述的盐生草耐盐基因HgS2，其特征在于所述的盐生草耐盐基因HgS2的编码序列为权利要求1中第30至第290位所述的核苷酸序列如下，分子量为261bp：
3.如权利要求2所述的盐生草耐盐基因HgS2，其特征在于所述的盐生草耐盐基因HgS2编码序列的蛋白氨基酸序列，由86个氨基酸组成：
4.如权利要求1所述的盐生草耐盐基因HgS2，其特征在于特异引物为：
HgS2-F1为5’-AAAAAATGGCACAATTTCAGCTCC-3’，
HgS2-R1为5’-GTAGTAGAAATGCGTTGATGTCCA-3’。
5.如权利要求1所述的盐生草耐盐基因HgS2的制备方法，其特征在于步骤为：
以200-500mM NaCl胁迫处理3-7d的盐生草幼苗叶片组织为材料，用Trizol法提取总RNA，采用cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA第一链，扩增所述基因片段，PCR反应体系为10×Ex Taq Buffer Mg2+Plus2.5μL，dNTP Mixture各2.5mM 2μL，上游引物F1 5’-AAAAAATGGCACAATTTCAGCTCC-3’10μM 1μL，下游引物R15’-GTAGTAGAAATGCGTTGATGTCCA-3’10μM1μL，cDNA 1μL，Ex Taq酶0.2μL，超纯水17.3μL，总体积25μL；扩增程序为94℃4min，94℃50s，60-60.5℃50s，72℃25s，共32-35个循环，72℃延伸7-8min；利用胶回收试剂盒回收PCR产物，步骤为：首先琼脂糖凝胶检测目的片段大小，与目的片段大小一致的DNA片段用小刀片在10min之内切下装入1.5mL离心管中；切下的胶块称重，根据重量换算其体积，1mg＝1μL，然后加3倍体积的Buffer GM用于融化胶块，融化过程中适当振荡或吸打使其充分融化；将Spin柱置于收集管，然后将所有胶块融化液转至Spin柱里，室温离心12000rpm，1min，倒掉滤液；加700μL Buffer WB于Spin柱且静置5min后，室温离心12000rpm，1min，倒掉滤液，重复上一步骤；将空Spin柱放在收集管上，室温离心12,000rpm，1min，放置2min；再将Spin柱放入新离心管上，于膜中央加20-30μL灭菌蒸馏水，放置1min；室温12000rpm，离心1min，用于洗脱DNA，最后吸取2-3μL用于电泳检测，其它产物-20℃保存；接着将回收产物与pMD19-T载体连接，得到重组质粒pMD19-HgS2，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选蓝白斑，并进行菌落PCR鉴定，电泳检测含有目标条带的菌液进行测序。
6.如权利要求1所述的盐生草耐盐基因HgS2的表达载体的构建方法，其特征在于步骤为：
在所述的盐生草耐盐基因HgS2的上下游引物上分别添加Xba I和Sma I这两个酶切位点，上游引物F1为5’-GCTCTAGAAAAAAATGGCACAATTTCAGCTCC-3’、下游引物R1为5’-CGACCCGGGGTAGTAGAAATGCGTTGATGTCCA-3’:
以200-500mM NaCl胁迫处理3-7d的盐生草幼苗叶片组织为材料，用Trizol法提取总RNA，采用cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA第一链，扩增该基因片段，PCR反应体系为10×ExTaq Buffer Mg2+Plus 2.5μL，dNTP Mixture各2.5mM 2μL，上游引物5’-GCTCTAGAAAAAAATGGCACAATTTCAGCTCC-3’10μM1μL，下游引物5’-CGACCCGGGGTAGTAGAAATGCGTTGATGTCCA-3’10μM 1μL，cDNA 1μL，Ex Taq酶0.2μL，超纯水17.3μL，总体积25μL；扩增程序为94℃4min，94℃50s，60.5℃50s，72℃25s，共32-35个循环，72℃延伸7min；按照说明书步骤，利用胶回收试剂盒回收PCR产物，首先琼脂糖凝胶检测目的片段大小，与目的片段大小一致的DNA片段用小刀片迅速切下装入1.5mL离心管中；切下的胶块称重，根据重量换算其体积1mg＝1μL，然后加3倍体积的Buffer GM用于融化胶块，融化过程中适当振荡或吸打使其充分融化；将Spin柱置于收集管，然后将所有胶块融化液转至Spin柱里，室温离心12000rpm，1min，倒掉滤液；加700μL Buffer WB于Spin柱且静置5min后，室温离心12000rpm，1min，倒掉滤液，重复上一步骤；将空Spin柱放在收集管上，室温离心12,000rpm，1min，放置2min；再将Spin柱放入新离心管上，于膜中央加20-30μL灭菌蒸馏水，放置1min；室温12000rpm，离心1min，用于洗脱DNA，最后吸取2-3μL用于电泳检测，其它产物-20℃保存；接着将回收产物与pMD19-T载体连接，得到重组质粒pMD19-HgS2，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α感受态细胞，筛选蓝白斑，并进行菌落PCR鉴定，电泳检测含有目标条带的菌液进行测序；
提取含有Xba I和Sma I酶切位点的HgS2基因的T-载体和植物表达载体pCAMBIA3300质粒DNA并用Xba I和Sma I两种内切酶对所提质粒进行双酶切，酶切体系为Sma I 1ul，Xba I1ul，10×T 2ul，BSA 2ul，质粒DNA 6ul，超纯水8ul，总体积20μL；在37℃酶切2-2.5h，并对酶切产物进行电泳检测并纯化回收；接着用T4DNA连接酶，对上一步中纯化回收的载体及HgS2基因目的片段进行连接，连接体系为10×T4DNALigase Buffer 1ul，目的片段7ul，载体DNA 1ul，总体积9μL；在65℃水浴保温3min后，即冰浴1-2min，然后加T4DNA Ligase 1ul于16℃连接12-18h，得到重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，筛选蓝白斑并测序，确认得到含有带有目的基因HgS2的重组质粒pCAMBIA3300-HgS2；同时对重组质粒pCAMBIA3300-HgS2在37℃酶切2-2.5h，其双酶切体系为Sma I 1μL，Xba I 1μL，10×T 2μL，BSA 2μL，质粒DNA8μL，超纯水6μL，总体积20μL。
7.如权利要求1或2所述的盐生草耐盐基因HgS2在提高植株耐盐性的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111647681A (zh) * 2020-07-14 2020-09-11 甘肃农业大学 一种鉴别盐生草种质资源亲缘关系的ssr标记引物组及其应用
CN112280788A (zh) * 2020-11-17 2021-01-29 甘肃农业大学 盐生草HgS5基因及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7442852B2 (en) * 1998-03-18 2008-10-28 Eduardo Blumwald High salt plants and uses for bioremediation
CN105806864A (zh) * 2016-06-02 2016-07-27 甘肃农业大学 盐生草不同组织盐分含量直接观察的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7442852B2 (en) * 1998-03-18 2008-10-28 Eduardo Blumwald High salt plants and uses for bioremediation
CN105806864A (zh) * 2016-06-02 2016-07-27 甘肃农业大学 盐生草不同组织盐分含量直接观察的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUNCHENG WANG ET AL.,: ""Transcriptomic profiling of the salt-stress response in the halophyte Halogeton glomeratus"", 《BMC GENOMICS》 *
WANG J ET AL.,: ""Halogeton glomeratus salt-induced S2 mRNA, complete cds，Accession No:KX233497.1"", 《GENBANK》 *
宋展树: ""盐生草盐胁迫响应基因Unigene7547的克隆及在烟草中转化的初步研究"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111647681A (zh) * 2020-07-14 2020-09-11 甘肃农业大学 一种鉴别盐生草种质资源亲缘关系的ssr标记引物组及其应用
CN111647681B (zh) * 2020-07-14 2022-06-03 甘肃农业大学 一种鉴别盐生草种质资源亲缘关系的ssr标记引物组及其应用
CN112280788A (zh) * 2020-11-17 2021-01-29 甘肃农业大学 盐生草HgS5基因及其应用
CN112280788B (zh) * 2020-11-17 2023-06-23 甘肃农业大学 盐生草HgS5基因及其应用

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