CN105806864A - 盐生草不同组织盐分含量直接观察的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及盐生草不同组织盐分含量的直接观察方法。具体地说利用是扫描电镜结合利用能量色散X射线光谱仪对叶片肉质化盐生植物根、茎、叶片等组织器官剖面含盐分(主要指Na+)组成进行定性与定量分析的方法。其过程主要包括盐生草根、茎、叶组织样品的采集、琼脂包埋、剖面切割、液氮冷冻干燥、剖面电镜扫描和X‑ray元素组成进行定性和定量分析等过程。本发明方法对不同组织盐分含量观察结果准确、直观、可靠性强，对当前盐生植物耐盐机理研究和利用盐生植物富集盐分的特性进行盐碱地土壤改良具有重要的现实意义。

Description

盐生草不同组织盐分含量直接观察的方法
技术领域
本发明涉及一种盐生植物盐生草不同组织盐分含量直接观察的方法。
背景技术
盐生草(Halogeton glomeratus)属于黎科(Chenopodiaceae)一年生盐生草本植物，为我国西北旱区盐碱地、荒漠区的优势植物种群。在盐碱地环境中，盐生草根尖从土壤中吸收的盐分主要通过根到茎、再到叶片的运输途径，最终将大量盐分贮存在极度肉质化叶片的储水组织中，极大地减缓了在盐碱地中大量盐离子对植株造成的离子毒害(主要为Na+和Cl-)和渗透胁迫，实现了盐生草在盐碱荒漠地的正常生长。这种肉质化叶片对盐分的富集特性是盐生植物组织耐盐性的最主要特征。而当前对盐生植物不同组织，如根、茎、叶中的盐分测定主要是通过分组织采集样品，制成粉末状，经处理后通过原子分光光度计或原子吸收光谱仪测定，并没有一种直接观测组织盐分含量的方法。实现盐生植物不同组织水平盐分含量的直接测定，可为盐生植物组织耐盐性提供最直接、有力的证据，同时对当前盐生植物耐盐机理研究和利用盐生植物富集盐分的特性进行盐碱地土壤改良具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种盐生草不同组织盐分含量直接观察的方法，以解决无法直观观测盐生草不同组织器官盐分含量差别的难题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种盐生草不同组织盐分含量直接观察的方法，其主要特点在于步骤如下：
(1)样品采集：以NaCl胁迫培养1-2月的盆栽盐生草幼苗为对象，首先从花盆中取出盐生草单株，用超纯水冲洗干净植株，依次分离根、茎、叶片组织，并用双面刀片切成切断；
(2)琼脂包埋切割：用质量分数3-5％的琼脂在3min之内包埋步骤(1)所获得根、茎、叶片切断，室温静置3-5min，待琼脂凝固好后，用双面刀片1-2min之内将包埋好的材料切成切片；
(3)液氮冷冻：将步骤(2)获得的材料切片在1min之内投入液氮中瞬间冷冻，直至冷冻完全；
(4)冷冻干燥：将步骤(3)冷冻完全的样品置于冷冻干燥机当中，用温度-50℃，压强20-75pa，冷冻干燥时间16-24h，直至样品冷冻干燥完全；
(5)切面电镜扫描和元素组成分析：将步骤(4)获得的样品置于电镜载物台，用扫描电镜扫描剖面，并用能量色散X射线光谱仪进行样品剖面元素组成与含量分析。
所述的盐生草不同组织盐分含量直接观察的方法，其步骤(1)中根、茎、叶片切断长度为0.5-1.0cm。
所述的盐生草不同组织盐分含量直接观察的方法，其步骤(2)中所获包埋好的根、茎、叶片切断厚度为1-2mm。
所述的盐生草不同组织盐分含量直接观察的方法，其步骤(3)中切片液氮中冷冻时间为2-3min。
所述的盐生草不同组织盐分含量直接观察的方法，其步骤(5)中能量色散X射线光谱仪管压为10kv，样品测试时间为40-60s。
本发明的有益效果：本发明一种盐生植物盐生草不同组织盐分含量直接观察的方法，包括盐生草根、茎、叶组织样品的采集、琼脂包埋、剖面切割、液氮冷冻干燥、剖面电镜扫描和X-ray元素组成进行定性和定量分析。
1.首次提供了适合盐生草等叶片肉质化盐生植物组织盐分含量的直接测定方法；
2.采用琼脂包埋植物鲜样组织、然后液氮迅速冷冻，再冷冻干燥样品的程序，且最大限度保持了植物样品本身属性；
3.以样品的横切面为盐分测定界面，也可比较同一组织切面不同部位的盐分差别，结果准确、直观、可靠性强。
附图说明：
图1无NaCl胁迫幼苗根(A)、茎(B)、叶片(C)组织剖面结构及元素组成；
图2以200mM NaCl胁迫幼苗后根(A)、茎(B)、叶片(C)组织剖面结构及元素组成；
图3以400mM NaCl胁迫幼苗后根(A)、茎(B)、叶片(C)组织剖面结构及元素组成；
图4以400mM NaCl胁迫幼苗后叶片外周绿色组织(a)和贮水组织(b)剖面结构及元素组成。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下面对本发明的内容进行详细的说明。
实施例1：一种盐生草不同组织盐分含量直接观察的方法，其主要特点在于步骤如下：
(1)样品采集：以NaCl胁迫培养1-2月的盆栽盐生草幼苗为对象，首先从花盆中取出盐生草单株，用超纯水冲洗干净植株，依次分离根、茎、叶片组织，并用双面刀片切成切断；
(2)琼脂包埋切割：用质量分数3-5％的琼脂在3min之内包埋步骤(1)所获得根、茎、叶片切断，室温静置3-5min，待琼脂凝固好后，用双面刀片在2min之内将包埋好的材料切成切片；
(3)液氮冷冻：将步骤(2)获得的材料切片在1min之内投入液氮中冷冻，直至冷冻完全；
(4)冷冻干燥：将步骤(3)冷冻完全的样品置于冷冻干燥机当中，用温度-50℃，压强20-75pa，冷冻干燥时间16-24h，直至样品冷冻干燥完全；
(5)切面电镜扫描和元素组成分析：将步骤(4)获得的样品置于电镜载物台，用扫描电镜扫描剖面，并用能量色散X射线光谱仪进行剖面元素组成与含量分析。
所述的步骤(1)中根、茎、叶片切断长度为0.5-1.0cm。
所述的步骤(2)中所获包埋好的根、茎、叶片切断厚度为1-2mm。
所述的步骤(3)中切片液氮中冷冻时间为2-3min。
所述的步骤(5)中能量色散X射线光谱仪管压为10kv，样品测试时间为40s，样品剖面分析元素选为C、O、Na、Mg、Cl、K、Ca。
实施例2：一种盐生草不同组织盐分含量直接观察的方法，其步骤如下：
a.样品采集：以无NaCl胁迫(对照)培养1-2月的盆栽盐生草幼苗为对象，首先从花盆中取出盐生草单株，用超纯水冲洗3次，依次分离根、茎、叶片组织，并用双面刀片切成1.0cm的切断。
b.琼脂包埋切割：用质量分数3％的琼脂在3min之内包埋步骤a所获得根、茎、叶片切断，室温静置5min凝固琼脂，用双面刀片迅速将包埋好的材料切成厚1-2mm的切片。
c.液氮冷冻：将步骤b获得的材料切片在30s之内投入液氮中冷冻3min。
d.冷冻干燥：将步骤c冷冻完全的样品置于冷冻干燥机(FD-1B-5，北京博医康)当中，用温度-50℃，压强25-75pa冷冻干燥样品24h。
e.电镜扫描和元素组成分析。将步骤d获得的样品置于电镜载物台，用扫描电镜(JSM-5600LV，日本JEOL公司)扫描剖面，并用能量色散X射线光谱仪(EDX-9100，日本日立公司)进行剖面元素组成进行定性与定量分析，5次重复。能量色散X射线光谱仪管压为10kv，样品测试时间为60s，样品剖面分析元素选为C、O、Na、Mg、Cl、K、Ca。结果如图1所示。根剖面Na+含量重量百分比平均值为0.41％，茎剖面Na+含量重量百分比平均值为1.22％，叶剖面Na+含量重量百分比平均值为2.97％。
实施例3：一种盐生草不同组织盐分含量直接观察的方法，其步骤如下：
a.样品采集：以200mM NaCl胁迫培养1-2月的盆栽盐生草幼苗为对象，首先从花盆中取出盐生草单株，用超纯水冲洗3次，依次分离根、茎、叶片组织，并用双面刀片切成0.5cm的切断。
b.琼脂包埋切割：用质量分数5％的琼脂在2min之内包埋步骤a所获得根、茎、叶片切断，室温静置4min凝固琼脂，用双面刀片迅速将包埋好的材料切成厚1-2mm的切片。
c.液氮冷冻：将步骤b获得的材料切片在1min之内投入液氮中冷冻2min。
d.冷冻干燥。将步骤c冷冻完全的样品置于冷冻干燥机(FD-1B-5，北京博医康)当中，用温度-50℃，压强25-75pa冷冻干燥样品16h。
e.电镜扫描和元素组成分析。将步骤d获得的样品置于电镜载物台，用扫描电1镜(JSM-5600LV，日本JEOL公司)扫描剖面，并用能量色散X射线光谱仪(EDX-9100，日本日立公司)进行剖面元素组成进行定性与定量分析，5次重复。能量色散X射线光谱仪管压为10kv，样品测试时间为50s，样品剖面分析元素选为C、O、Na、Mg、Cl、K、Ca。结果如图2所示。根剖面Na+含量重量百分比平均值为0.72％，茎剖面Na+含量重量百分比平均值为4.06％，叶剖面Na+含量重量百分比平均值为7.30％。
实施例4：一种盐生草不同组织盐分含量直接观察的方法，其步骤如下：
a.样品采集：以400mM NaCl胁迫培养1-2月的盆栽盐生草幼苗为对象，首先从花盆中取出盐生草单株，用超纯水冲洗3次，依次分离根、茎、叶片组织，并用双面刀片切成0.5-1.0cm的切断。
b.琼脂包埋切割：用质量分数4％的琼脂在3min之内包埋步骤a所获得根、茎、叶片切断，室温静置3min凝固琼脂，用双面刀片迅速将包埋好的材料切成厚1-2mm的切片。
c.液氮冷冻：将步骤b获得的材料切片在40s之内投入液氮中冷冻3min。
d.冷冻干燥。将步骤c冷冻完全的样品置于冷冻干燥机(FD-1B-5，北京博医康)当中，用温度-50℃，压强25-75pa冷冻干燥样品20h。
e.电镜扫描和元素组成分析。将步骤d获得的样品置于电镜载物台，用扫描电镜(JSM-5600LV，日本JEOL公司)扫描剖面，并用能量色散X射线光谱仪(EDX-9100，日本日立公司)进行剖面元素组成进行定性与定量分析，5次重复。能量色散X射线光谱仪管压为10kv，样品测试时间为60s，样品剖面分析元素选为C、O、Na、Mg、Cl、K、Ca。结果如图3所示。根剖面Na+含量重量百分比平均值为1.03％，茎剖面Na+含量重量百分比平均值为5.55％，叶剖面Na+含量重量百分比平均值为12.38％。
实施例5：一种盐生草不同组织盐分含量直接观察的方法，其步骤如下：
a.样品采集：以400mM NaCl胁迫培养1-2月的盆栽盐生草幼苗为对象，首先从花盆中取出盐生草单株，用超纯水冲洗3次，依次分离根、茎、叶片组织，并用双面刀片切成0.5-1.0cm的切断。
b.琼脂包埋切割：用质量分数5％的琼脂在2min之内包埋步骤a所获得叶片切断，室温静置3min凝固琼脂，用双面刀片迅速将包埋好的材料切成厚1-2mm的切片。
c.液氮冷冻：将步骤b获得的材料切片在30s之内投入液氮中冷冻3min。
d.冷冻干燥：将步骤c冷冻完全的样品置于冷冻干燥机(FD-1B-5，北京博医康)当中，用温度-50℃，压强25-75pa冷冻干燥样品18h。
e.电镜扫描和元素组成分析：将步骤d获得的样品置于电镜载物台，用扫描电镜(JSM-5600LV，日本JEOL公司)扫描剖面，并用能量色散X射线光谱仪(EDX-9100，日本日立公司)进行叶片剖面中间贮水组织和外周绿色组织的元素组成进行定性与定量分析，5次重复。能量色散X射线光谱仪管压为10kv，样品测试时间为40s，样品剖面分析元素选为C、O、Na、Mg、Cl、K、Ca。结果如图4所示。叶剖面外周绿色组织(a)Na+含量重量百分比平均值为2.71％。贮水组织(b)Na+含量重量百分比平均值为14.14％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种盐生草不同组织盐分含量直接观察的方法，其特征在于步骤如下：
(1)样品采集：以NaCl胁迫培养1-2月的盆栽盐生草幼苗为对象，首先从花盆中取出盐生草单株，用超纯水冲洗干净植株，依次分离根、茎、叶片组织，并用双面刀片切成切断；
(2)琼脂包埋切割：用质量分数3-5％的琼脂在3min之内包埋步骤(1)所获得根、茎、叶片切断，室温静置3-5min，待琼脂凝固好后，用双面刀片在1-2min之内将包埋好的材料切成切片；
(3)液氮冷冻：将步骤(2)获得的材料切片在1min之内投入液氮中进行瞬间冷冻，直至材料冷冻完全；
(4)冷冻干燥：将步骤(3)冷冻完全的样品置于冷冻干燥机当中，用温度-50℃，压强20-75pa，冷冻干燥时间16-24h，直至样品冷冻干燥完全；
(5)切面电镜扫描和元素组成分析：将步骤(4)获得的样品置于电镜载物台，用扫描电镜扫描剖面，并用能量色散X射线光谱仪进行样品剖面元素组成与含量分析。
2.如权利要求1所述的盐生草不同组织盐分含量直接观察的方法，其特征在于步骤(1)中根、茎、叶片切断长度为0.5-1.0cm。
3.如权利要求1所述的盐生草不同组织盐分含量直接观察的方法，其特征在于步骤(2)中所获包埋好的根、茎、叶片切断厚度为1-2mm。
4.如权利要求1所述的盐生草不同组织盐分含量直接观察的方法，其特征在于步骤(3)中切片液氮中冷冻时间为2-3min。
5.如权利要求1所述的盐生草不同组织盐分含量直接观察的方法，其特征在于步骤(5)中能量色散X射线光谱仪管压为10kv，样品测试时间为40-60s。
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