CN101636649A - 生物材料的固定 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种处理生物材料的方法，该方法包括以下步骤：i)提供生物材料；和ii)使该生物材料与第一种无水组合物接触，该组合物包含：(a1)10－90％体积％的甲醇，和(a2)至少一种其它添加剂，和(a3)任选的一种酸，iii)将该生物材料转移到含至最高达99％体积％乙醇的第二种组合物(B)中，并涉及可用于所述方法的保存生物材料的新组合物，和用此法得到的生物材料，涉及一种分析经处理的生物材料的方法、各种试剂盒及所述组合物在此方法中的应用。
Description
本发明涉及固定生物材料的方法、由该方法得到的生物材料、实施该方法的试剂盒以及一种组合物在所述方法中的应用。
长期以来一直只强调对生物材料作病原学和组织学检查。尚若如此，通常需要将用于这些类型检查的样品保藏在甲醛溶液和/或包埋在石蜡中保存或使之稳定。然而，长期以来冷却或冰冻也是保存生物材料的标准习惯方法。
首先需认识到测定生物材料的具体成分，例如核酸或蛋白质，特别对医学和临床诊断领域具有极大的益处，因而显然仍需要开发新的更有效更经济的保存和稳定试剂和/或方法。
在这些开发过程中，须认识到，对于分子生物学检查，新鲜样品中重要组分的精确状态(基因表达状况或蛋白组状况)可能在将该样品从其天然环境中取出后的即刻就发生了快速改变，因此样品处在无处理贮存状态下过久，例如由于向实验室等处转运的无意延迟而存放过久，可能使分子分析无效或甚至使这种分析完全不可能。
从采样到样品分析之间的耗时越长，生物材料的精确核酸状态改变就越大。由于到处都存在RNA酶，核糖核酸(RNA)的降解特别快。除核酸降解外，还有例如应急基因可能被诱导而导致合成新的RNA分子同样会强烈改变样品的转录模式。因此，为了保存基因的表达状况，必须立即使受检样品稳定。
需要立即稳定样品不仅仅是为了分析核酸，也为了详细检查生物材料的蛋白组学状况，因为取出样品后蛋白质的模式也会很快发生改变。首先发生的是降解或新蛋白的合成，接着，特别迅速的改变是蛋白质修饰的改变，例如磷酸化/去磷酸化。
由于医学和临床诊断领域以外的领域，如法医学、药学、食物分析、农业、环境分析以及许多研究领域也日益增多地采用了蛋白质化学分析和分子分析，因此保存样品分子结构的完整和使它们立即稳定已是所有这些领域的必然要求。
因此，多年以来已开发了各种各样的许多稳定剂和稳定方法以图稳定范围广泛的各种各样生物材料。
如以上所述，长久以来就已熟知可通过福尔马林稳定然后包埋经稳定的样品作组织学检查。然而，此种类型的稳定对于()分子生物学处理很不适合，因为导致的核酸稳定极不充分，大多数只能定性而不能定量检测存在的核酸或核酸片段。此外，采用交联稳定剂如福尔马林的稳定可使提取组织中的核酸或蛋白质减少。毒理学上福尔马林也并非无害。
可得到对核酸的定性鉴定极佳的稳定剂，如US 5,010,184，US 5,300,545，WO-A-02/00599和WO-A-02/00600中所述的阳离子洗涤剂()。然而，这些类型的稳定剂不能充分稳定致密组织切片中的核酸。
其它稳定剂，例如包括高浓度硫酸铵(参见例如US 6,204,375)非常适合稳定各种组织中的核酸。然而，用它们稳定含细胞或无细胞的体液，如血液、血清或血浆却极不合适，而且已证明用于某些类型组织如脂肪组织时稳定性能较差。
此外，用于稳定核酸作定量鉴定的那些试剂和方法通常不适合用于组织学检查，因为这些稳定剂虽能保存核酸却不能保存细胞或组织结构。
这表明要同时稳定组织样品中的RNA、DNA和蛋白质并按组织学要求保存组织样品特别困难。而且，用作细胞和其他生物材料的稳定不一定能应用于致密组织。与其他生物材料相比，稳定致密组织样品中的核酸特别困难。由于它们的组成、组分和结构()，组织是复杂的异质体。为了稳定致密组织样品中的核酸，不仅仅要求稳定剂作用于细胞表面和/或内层细胞，而且要求作用于复杂样品材料的深处。此外，在一种和相同的生物材料中必然常常存在着各种不同类型的组织和/或细胞，例如在细胞结构中，细胞膜的组成、区室化和生物分子如蛋白质、糖类和/或脂肪成分均有所不同。
从现有技术可知，组织样品包括所有组分常用的稳定形式是冷冻或深冷冻样品。在样品从其天然环境中取得后直接用液氮-80℃以下深度冷冻。此法处理的样品在-70℃几乎可无限期保存而不会丧失完整性。然而，这些类型的方法均要求非常吃力的后勤保障条件，如必须在转运、贮存或在大多数不同的应用和使用期间防止样品融化。除了需要专用的样品架和长久冷却样品而增加费用外，不断添加所用的液氮不仅非常麻烦，而且需在特殊的安全措施下才能实施。
此外，对深度冷冻样品的随后分析，特别是对样品各成分的分析常常证明非常困难。因此，在转运或处理过程中样品的解冻或融解将导致()降解，特别是RNA的降解。这意味着这种融解或解冻的样品不再能产生可重现的()结果。还有，例如仅用手工给冰冻状态的组织作精确切片有极大的困难，或要增加设备费用。
也已报导了采用所谓的过渡液能减少与处理深度冷冻样品，特别是分离RNA相关的缺点。此法包括将深度冷冻样品先转移到预先冷却至-70℃到80℃的过渡液中，然后在约-20℃保存数小时(至少16小时)。接着可将用过渡液浸泡的样品加热至-4℃到室温的工作温度，不仅可短期保存，例如时间足够允许制作样品切片而不会改变其中核酸的状态。然而这不可能对样品作进一步分析和贮存，特别是在室温下。已知例如WO-A-2004/72270报导了这些类型的过渡液主要由单羟基醇组成。
用现有过渡液处理的样品缺点是室温下只能在极短时间内保持稳定，结果处理的时间必须非常短因而极易超过，特别是在切片和秤重步骤时。而且，发生的过渡转变很慢随后不能直接进行实验，常常要等待一天时间。类似地，室温运送此法处理的样品不可能无损伤，因为不仅运送而且后续样品的稳定贮藏都必须在≤-20℃下进行。样品转运也只能在≤-20℃下进行，因而需要采用冷冻剂如干冰。
虽然采用常规过渡液改善了样品的处理，例如秤重或切片，但既不能减少设备的费用(因为过渡液必须冷却至-70℃到-80℃，和必须购买合适的冷却设备)，也不能使经过渡液处理的样品在室温下较长时间稳定。
所有方法包括快速冷冻新鲜样品的另一个缺点是，由于形成的人工冰晶使组织的形态细节不能精确保留。这可能损害根据组织学染色作出的诊断。
用于保存形态学结构的组织固定剂可分成二类。一类包括交联剂如甲醛、多聚甲醛或乙二醛。其中4％甲醛缓冲液是使用最广泛的固定剂。自从1896年由F.Blum介绍以来此液的唯一改变是用生理pH缓冲液配成中性福尔马林液(NBF，中性福尔马林缓冲液)。虽然尚未能完全了解，但认为醛能在蛋白质之间形成交联，通过终止酶活性和使可溶性蛋白固定于结构蛋白。因为甲醛也能与核酸反应，NBF固定可导致核酸得率降低和降解。
第二类不包括交联剂，而用醇类作为主要成分。对于免疫组化方法，引入非交联性醇类固定剂可避免有害的甲醛固定更好地保存组织中的大分子，特别是蛋白质的表位。醇类必须穿透组织并达到某种局部浓度使蛋白质沉淀和变性。近年来发现与醛类相比，作为核酸固定剂的某些醇固定剂，如卡诺依液(60％乙醇、30％氯仿、10％醋酸)或麦沙卡液(Methacarn)(用甲醇替代乙醇的卡诺依液)能产生更好的效果(Cox等，Experimental and Molecular Pathology(实验和分子病理学)2006；80：183-191)。其它近年公开的基于醇类的固定剂含70％乙醇(Gillespie等，Am.J.Pathol.2002；160(2)：449-457)、56％乙醇和20％PEG(聚乙二醇，Bostwick等；Arch.Pathol.Lab.Med.1994；118：298-302)或90％甲醇和10％PEG300(Vinvek等，Lab.Investigation 2003；83(10)：1427-35)。
此外，近年来公开的几篇专利申请要求保护其改进的非交联性固定剂。在DE 199 28820中，描述了一种含有不同醇、丙酮、PEG和乙酸混合物的固定剂。在US 2003/0211452A1中，描述了已商品化的固定剂“Umfix”，其含有至少80％的甲醇和高达20％的PEG300，可保存RNA、DNA和形态。已报导的可保存分子成分和形态的基于乙醇的固定剂有：US 2005/0074422A1(“Finefix”)、WO2004/083369(“RCL2”)和WO 05/121747A1(“Boonfix”)。US 2003/119049中描述的通用性收集液以水为基础，包含缓冲组分、一种醇、固定组分和抑制降解的试剂。
然而，上述所有的这些醇类固定剂均显示有显著缺点。基于乙醇或用水平衡的不同醇混合物的固定剂不能防止RNA降解。无酸和醇含量高的固定剂可短时间保存RNA，但显示可导致人工伪迹，如组织硬化或皱缩导致形态细节受到破坏。
上述二类固定剂量均不能保存RNA的长期完整，例如在室温下同时稳定形态三天以上。
除了交联固定剂和醇类固定剂外，还已知有许多用这二类固定剂组合产生的试剂。一个例子是US 5,976,829A描述的可保存形态、免疫原性及RNA和DNA完整性的“Genofix”。由于甲醛是其一种组分，“Genofix”仍显示具有交联剂的所有缺点。
WO 03/029783A1描述了一种不同方法。所谓的HOPE-技术(Hepes-谷氨酸缓冲液介导的有机溶剂保护作用)包含由有机缓冲液、作为唯一脱水剂的丙酮和纯石蜡油组成的保护液，融解温度为52-54℃。HOPE的缺点是组织必须4℃过夜保存直到处理。WO2004/099393A1描述的购自OS公司(OncoSience)的“Liforlab”是一种富含氧的液体，其包含无机盐、氨基酸、维生素、胆固醇和腺苷。由于HOPE或Liforlab都不能固定组织，因而不能保存细胞的分子成分仍象它们在病人机体中的那种状态，而是很可能例如RNA的表达状况在贮藏和/或运送期间发生了改变。
本发明的目的是提供稳定生物材料的有效、快速和简便方法，以供分离核酸和/或蛋白质及作组织学分析。
具体说，本发明的目的是，详细说明不加入交联性、致癌性或损害胎儿的物质而能稳定生物材料导致该生物材料具有可接受的稳定性的方法。
此外，本发明的目的是，详细说明在可能最温和的温度条件如室温下，稳定冷冻的和新鲜的生物材料而不损伤该生物材料中基因组和/或蛋白组表达状况的方法
此外，稳定生物材料的该方法预计能使经过稳定的生物材料接受组织学分析和使其包含的生物分子接受分析。在本文中，所述稳定方法应特别能使经过稳定的生物材料中的蛋白质和核酸接受定性和定量分析。因此，例如通过使生物材料稳定，可用凝胶分析或多轮PCR循环直到获得给定量的核酸，来测定该核酸的性质和含量；可用聚丙烯酰胺凝胶电泳来测定蛋白质的性质和含量，或例如对于酶，可采用适当的不会损伤酶活性的试验来检测。
而且，使生物材料稳定的这种方法预计其提供的稳定化生物材料不仅能在温和的温度如室温下，而且任选能在这种温和的温度条件下保存尽可能长的时间，和在此之前或之后对其进行分析。
就生物分子而言，术语“稳定”指优选抑制其降解、修饰、其活性的降低或改变。就生物材料而言，术语“稳定”指优选防止样品形态发生显著改变。
通过采用处理生物材料的方法可实现上述目的，该方法包括以下步骤：
i)提供生物材料；和
ii)使该生物材料与第一种无水组合物接触，该组合物包含：
(a1)10-90体积％的甲醇，和
(a2)至少一种其它添加剂，和
(a3)任选的一种酸，
iii)将该生物材料转移到含最高达99体积％乙醇的第二种组合物(B)中。
步骤ii)中特别有用的第一种组合物是保存生物材料的无水组合物(A)，该无水组合物(A)包含：
(α1)10体积％到低于80体积％的甲醇，和
(α2)至少一种其它添加剂，和
(α3)一种酸。
令人惊奇地发现，可用含甲醇的组合物(A)来稳定特别新鲜分离的生物材料，并且可()制备生物材料，以供组织学、分子生物学和/或微生物学分析，所述材料优选是新鲜的或冰冻的，例如用液氮深度冰冻的。不需要使生物材料与冷却到0℃以下的该组合物接触和在如此低的温度下分析和贮藏，因此实施本发明的方法无须贵重设备，特别是不需要冷却设备或冷却剂。
开发的本文所述组合物化学组成简单，能保存组织的形态和遗传特征，在室温下使用方便而实用。可将细胞或组织保藏在其中，作为细胞学、组织学和/或遗传学分析的档案(archiva)来源，将其保存和/或贮藏供前瞻性或回顾性研究。虽不是优选，贮藏在本发明组合物中的细胞或组织也可接触其它防腐剂和/或固定剂。
本方法步骤i)制备的生物材料可以是冰冻的、或优选非冰冻的生物材料，本领域技术人员已知的所有生物材料可用作这种生物材料。优选的生物材料选自包含：生物分子，例如天然的，优选分离的线性、分枝或环形核酸，如RNA，具体是mRNA、siRNA、miRNA、snRNA、tRNA、hnRNA或核糖酶、DNA等；合成或修饰的核酸，如寡核苷酸，具体是PCR所用的引物、探针或标准品，用地高辛、生物素或荧光染料标记的核酸或PNA(肽核酸)，优选分离的蛋白质或寡肽、合成或修饰的蛋白质或寡肽，例如带有荧光标记的抗体或与酶偶联的抗体、激素、生长因子、脂质、寡糖、多糖、蛋白聚糖；体液如血液、精液、脑脊液、唾液、痰或尿液；处理血液时所得到的液体如血清或血浆、白细胞组分或“血沉棕黄层”、唾液、粪便、涂片、吸出物、头皮屑、毛发、皮肤碎片、法医学样品、含有游离或结合生物分子特别是游离或结合核酸的食物或环境样品、代谢产物、全生物体，优选无生命的生物体；后生动物优选昆虫和哺乳动物特别是人的组织，其形式例如组织切片或器官、分离的细胞如粘附或悬浮的细胞培养物，细胞器如叶绿体或线粒体、囊泡、细胞核或染色体，植物、植物的一部分、植物组织或植物细胞，细菌，病毒，类病毒，朊病毒，酵母和真菌。
细胞可以是沉淀的细胞团或悬浮细胞，优选从生理性体液(如腹水、血液、脑脊液、淋巴液、胸膜渗出液)分离的细胞、抽吸器官得到的细胞悬液、或体腔灌洗液、或细胞涂片(如宫颈细胞涂片)。可利用酶促和/或机械解聚作用来分离细胞。可将它们培养成能维持存活或增殖的活细胞然后保存和/或贮藏。可离心洗涤细胞和收集细胞成为沉淀细胞团；也可将细胞收集在载玻片或其它基材上。
对于血液和其它单细胞悬液，可通过沉降或密度梯度离心、在包被或未包被的塑料平板上淘选、使细胞悬液通过玻璃毛或其它层析基质、形成玟瑰花结、通过光散射或荧光标记抗体分选、与包被在磁性颗粒上的抗体结合，或这些方法的组合来分离细胞。所述细胞可以是获自患病或怀疑患病(正常或患病)或遭受其它病原影响的动物或人对象的癌(良性或恶性)或前癌细胞，可通过尸体剖检或活组织检查(如导管插入或静脉切开)和其它的液体收集方法获得。优选从机体取出后或在体外培养时使细胞与组合物(A)接触1-30分钟，但将细胞放置冰上冷却时可延长此时间。可保存和/或贮藏细胞。
可处理细胞供细胞学研究。可将细胞涂在载玻片上用显微镜检查。可用可检测的色素、酶、荧光、发冷光、磁性或放射性分子直接或间接标记抗原或抗体。可根据抗体淘选或分选检测抗原表达、或其它亲和层析来鉴定和/或分离细胞。采用细胞计数器分析，或细胞分类器，通过DNA/RNA组成、大小、细胞活性、与荧光标记抗体结合或这些方法的组合来分离细胞。利用磁力亲和纯化结合在包被抗体磁珠上的细胞。通过细胞周期、分裂、生长或细胞器特征鉴定细胞。利用阴性或阳性选择(如亲和或分选技术)分离细胞群。
可通过尸体剖检、活组织检查或外科手术获得组织。可以是实体组织，如实质、结缔组织或脂肪组织、心脏或骨骼肌、平滑肌、皮肤、脑、肾、肝、脾、乳房、癌组织(如大肠癌、鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、胃癌等)、软骨、淋巴瘤、脑膜瘤、胎盘、前列腺、胸腺、扁桃体、脐带或子宫。任选地，钙化组织如骨或牙齿可能需要脱矿物质后才能作进一步处理。“组织”通常不是指生理体液(如腹水、血液、胸膜渗出液)中的单个细胞，抽吸器官或体腔灌洗获得的细胞悬浮液或细胞涂片。所述组织可以是获自患病或怀疑患病(正常或患病)或遭受其它病原影响的动物或人对象的肿瘤(良性或恶性)、癌或前癌细胞。可通过尸体剖检、活组织检查(如内窥镜检查或腹腔镜检查)或手术切除获得。优选死亡后或从机体取出后使组织与组合物(A)接触1-30分钟，但将其放置冰上冷却时可延长此时间。可将组织块(如切片或切块)保存和/或贮藏在本发明的组合物中；也可将已经保存和/或贮藏的组织包埋在介质中。在毗连切片上加入不同的分析试剂进行系列性重建来分析组织。利用阴性或阳性选择(如用光学镊子或激光消融)分离细胞群。
本发明方法步骤i)的非冰冻生物材料优选采用新鲜制备的生物材料，例如活的或死亡生物的新鲜组织样品或新鲜分离的血细胞，或就合成的生物分子如生物材料而言，为新鲜合成的核酸或蛋白质。按照本发明，“新鲜的”生物材料宜理解为指该样品在与步骤ii)中的组合物接触前，从体内取出的时间不超过96小时，优选不超过48小时，特别优选不超过24小时，还要优选不超过10小时，甚至更加优选不超过60分钟，最优选不超过10分钟；或就合成的生物分子而言为其刚刚合成之后。然而，此种指定的“新鲜”生物材料也包括在上述时间内取得的、但在接触本发明组合物之前未经预处理，例如未用常规固定剂如福尔马林、染料如曙红、抗体等处理的样品。可用本领域技术人员已知的所有方法制备新鲜的细胞样品或组织样品，例如，可借助解剖刀在尸体解剖时制备这种组织，离心新鲜取得的血液制备血细胞样品等等。对于新鲜的生物材料，步骤ii)所用的第一种组合物主要用作稳定性组合物。所述第一种组合物优选组合物(A)。
本发明方法步骤i)中所用的生物材料可以是冰冻的生物材料，按照上面所述技术分离后但在接触步骤ii)的第一种组合物前，将其先冷却至0℃温度或以下，优选冷却至-20℃温度或以下，最优选冷却至-70℃或以下(例如接触液氮)。对于本发明方法所用的冰冻生物材料，步骤ii)中所用的第一种组合物主要用作过渡组合物。步骤ii)中所用的第一种组合物优选组合物(A)。
组合物(A)的组分(α1)是甲醇，组合物(A)中甲醇的体积含量为10％到低于80％，优选从20％到低于80％，更优选从30％到低于80％，最优选从60％到低于80％。这意味着组合物(A)中甲醇的含量最高达79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11体积％，或为10体积％。优选含约70体积％、约60体积％或约50％体积％的甲醇。
组合物(A)中的至少一种添加剂(α2)，或上述方法步骤ii)第一种组合物中的(α2)分别是不同于甲醇的另一种溶剂，或是选自以下的一种添加剂：洗涤剂、能抑制核酸或蛋白质降解的抑制剂如蛋白酶抑制剂PMSF、或可商品化购得的产品ANTI-RNA酶(美国安宾公司(Ambion，St.Austin，USA))、RNAsecure
(安宾公司)或DEPC、烷化剂、乙酰化剂、卤化剂、核苷酸、核苷类似化合物、氨基酸、氨基酸类似化合物、粘度调节剂、染料特别是能特异性着染某种细胞结构的染料、缓冲剂如HEPES、MOPS、TRIS，或磷酸缓冲液、保藏剂、络合剂如EDTA或EGTA、还原剂如2-巯基丙醇、二硫苏糖醇(DTT)、喋呤、硫化氢、抗坏血酸、NADPH、三羧乙基膦(TCEP)和六甲基磷酸酰胺、(Me2N)3P；氧化剂如5，5’-二硫代-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)；能促进细胞渗透的物质如DMSO或DOPE；高离液物质如异硫氰酸胍或盐酸胍，或带有F-、PO4 3-、SO4 2-、CH3COO-、Cl-、Br-、I-、NO3 -、ClO4 -、SCN-、Cl3CCOO-等阴离子以及NH4 +、Rb+、K+、Na+、Li+、Mg2+、Ca2+、Ba2+等阳离子的高离液盐、，以及这些添加剂的至少二种、至少三种、至少四种、至少五种或至少六种的混合物。
优选的其它组分是C2-C12多元醇，属于但不限于：1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、2-甲基-1，3-丙二醇、2-甲基-1，2-丙二醇、2，2-二甲基-1，3-丙二醇、2，2-二乙基-1，3-丙二醇、2-甲基-2-丙基-1，3-丙二醇、2-丁酰基-2-乙基-1，3-丙二醇、二羟基丙酮、2，2-二丁酰基-1，3-丙二醇、3-甲氧基-1，3-丙二醇、3-甲氧基-1，2-丙二醇、3-甲氧基-2，3-丙二醇、2-甲氧基甲基-1，3-丙二醇、3-乙氧基-1，3-丙二醇、3-乙氧基-1，2-丙二醇、3-乙氧基-2，3-丙二醇、3-烯丙氧基-1，2-丙二醇、2，3-丁二醇、2，3-二甲基-2，3-丁二醇、3，3-二甲基-1，2-丁二醇、1，2-戊二醇、1，3-戊二醇、1，4-戊二醇、1，5-戊二醇、2，3-戊二醇、2，4-戊二醇、2-甲基-2，4-戊二醇、2，4-二甲基-2，4-戊二醇、2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇、1，2-己二醇、1，3-己二醇、1，4-己二醇、1，5-己二醇、1，6-己二醇、2，3-己二醇、2，4-己二醇、2，5-己二醇、3，4-己二醇、2，5-二甲基-2，5-己二醇、2-乙基-1，3-己二醇、1，2-庚二醇、1，3-庚二醇、1，4-庚二醇、1，5-庚二醇、1，6-庚二醇、1，7-庚二醇、1，8-辛二醇、1，2-辛二醇、1，3-辛二醇、1，4-辛二醇、1，5-辛二醇、1，6-辛二醇、1，7-辛二醇、1，2-壬二醇、1，9-壬二醇、1，10-癸二醇、1，2-十一烷基二醇、1，2-十一烷基二醇、1，11-十一烷基二醇、1，12-十二烷基二醇、1，2-十二烷基二醇、二甘醇、双丙二醇、三甘醇、三丙二醇、四甘醇、四丙二醇、五甘醇、五丙二醇、六甘醇、六丙二醇、七甘醇、七丙二醇、八甘醇、八丙二醇、九甘醇、九丙二醇、十甘醇、十丙二醇、顺式或反式-1，2-环戊二醇、顺-或反-1，3-环戊二醇、顺-或反-1，2-环己二醇、顺-或反-1，3-环己二醇、顺-或反-1，4-环己二醇、顺-或反-1，2-环庚二醇、顺-或反-1，3-环庚二醇、顺-或反-1，4-环庚二醇、1，2，3-环戊三醇、1，2，4-环戊三醇、1，2，3-环己三醇、1，2，4-环己三醇、1，2，3-环庚三醇、1，2，4-环庚三醇、1，2，3-丙三醇、3-乙基-2-羟甲基-1，3-丙二醇、2-羟甲基-2-甲基-1，3-丙二醇、2-羟甲基-2-甲基-1，3-丙二醇、1，2，3-丁三醇、1，2，4-丁三醇、2-甲基-1，2，3-丁三醇、2-甲基-1，2，4-丁三醇、1，2，3-戊三醇、1，2，4-戊三醇、1，2，5-戊三醇、2，3，4-戊三醇、1，3，5-戊三醇、3-甲基-1，3，5-戊三醇、1，2，3-己三醇、1，2，4-己三醇、1，2，5-己三醇、1，2，6-己三醇、2，3，4-己三醇、2，3，5-己三醇、1，2，3-庚三醇、1，2，7-庚三醇、1，2，3-辛三醇、1，2，8-辛三醇、1，2，3-壬三醇、1，2，9-壬三醇、1，2，3-癸三醇、1，2，10-癸三醇、1，2，3-十一烷基三醇、1，2，11-十一烷基三醇、1，2，3-十二烷基三醇、1，1，12-十二烷基三醇、2，2，-双(羟甲基)-1，3-丙二醇、1，2，3，4-丁四醇、1，2，3，4-戊四醇、1，2，3，5-戊四醇、1，2，3，4-己四醇、1，2，3，6-己四醇、1，2，3，4-庚四醇、1，2，3，7-庚四醇、1，2，3，4-辛四醇、1，2，3，8-辛四醇、1，2，3，4-壬四醇、1，2，3，9-壬四醇、1，2，3，4-癸四醇、1，2，3，10-癸四醇、三甲基丙醇、季戊四醇；糖类如甘露糖醇、山梨糖醇或阿拉伯糖醇、己基六糖醇(hexanehexaol)、1，2，3，4，5-戊基五糖醇(pentanepentol)和1，2，3，4，5，6-己基六糖醇最优选的添加组分是二元醇和/或三元醇，如1，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，3-丙二醇、1，2-丙二醇、3-甲基-1，3，5-戊三醇，、1，2，6-己三醇、甘油、乙二醇；聚乙二醇(PEG)和乙酸二甘醇单乙醚(DEGMEA)和氯仿。按照本发明，组合物A或步骤ii)的无水组合物中的添加组分各自不包含卤化烃，具体说不包含氯化烃，特别是氯仿和/或三氯乙烷。优选熔点低于室温的PEG，平均分子量约800道尔顿或更低，优选约600道尔顿或更低，更优选约400道尔顿或更低，甚至还要优选约300道尔顿或更低的PEG，平均分子量可在约200道尔顿至约400道尔顿之间。术语“约”当指PEG的平均分子量时，意味允许有10、25或50道尔顿的差别。不优选较高分子量(如平均分子量1000或以上)的PEG，虽然其存在的量不到分子量分布的5％、10％或20％。PEG400的熔点约为4℃到8℃，PEG600约为20℃到25℃。该组合物中所用的PEG熔点可以是37℃或更低，32℃或更低，27℃或更低，22℃或更低，15℃或更低，10℃或更低，5℃或更低；对于冷藏或冷冻贮藏组织，优选熔点较低的PEG，其密度约1.1-1.2mg/ml，取决于其分子量，因此可用1.1作为其比重，就测量的重量与体积之间修改本文给定的PEG浓度。
不同于甲醇的溶剂可以是有机溶剂，宜选自：一元醇(单醇(monool))、C2-C12多元醇、酮类、二甲基亚砜、芳香烃、卤代烃、醚、羧酸、羧酸酰胺、腈、硝基烷和酯，其中合适的溶剂例如选自：乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1，3-丁二醇、1，4-丁二醇、乙腈、丙酮、苯甲醚、苄腈、1-甲氧基-2-丙醇、喹啉、环己酮、二乙酸甘油酯、二氯甲烷、氯仿、二甲苯、乙醚、二甲醚、甲苯、二甲酮、二乙酮、二甲基己二酸酯、碳酸二甲酯、硫酸二甲酯、二噁烷、二甲基亚砜、醋酸甲酯、醋酸乙酯、苯甲酸、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、乙苯、甲酰胺、甘油三醋酸酯、乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸甲酯、N，N-二乙基乙酰胺、N-甲基-N-乙基乙酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基-N-乙基甲酰胺、N，N-二乙基甲酰胺、N，N-二甲基硫代甲酰胺、N，N-二乙基硫代甲酰胺、N-甲基-N-乙基硫代甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基-N-乙基乙酰胺、N，N-二乙基乙酰胺、硝基乙烷、硝基甲基甲苯和磷酸三乙酯。组合物A或步骤ii)的无水组合物各自宜不含卤化烃，特别是氯化烃，具体是氯仿和/或三氯乙烷。
本发明组分(α2)和(a2)的浓度可以是约50％(v/v)，优选40％(v/v)或更低，更优选约30％(v/v)或更低，甚至还要优选约20％(v/v)或更低，约1％(v/v)或更高，5％(v/v)或更高，约10％(v/v)或更高和其中间范围内的任何值。术语“约”指浓度的差别为1％(v/v)或2.5％(v/v)。
组合物(A)的组分(α3)和上述方法步骤ii)所用第一种组合物的任选组分(a3)各是一种酸，即有机酸或无机酸，优选弱酸。本发明的弱酸优选pK值2-12的酸，更优选3.5-8，最优选4-7.5的酸。优选的所述化合物是弱有机酸。更优选所述的有机酸属于氨基酸、羧酸(一元、二元、三元羧酸)如甲酸、富马酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸，最优选乙酸或丙酸。
组合物(A)中存在的组分(α3)或(a3)含量为0.5％-30％，优选1-15％，更优选5-10％，这意味着其含量可以是百分比1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20％，特别优选5、6、7、8、9、10％。
宜简单混合组分(α1)-(α3)或(a1)-(a3)来分别制备组合物(A)或步骤ii)的第一种组合物。任何一种组分的熔点应高于室温，如此可将该组分加热至其熔点然后与添加剂混合。然而，制备时组合物的各组分(α2)-(α3)或(a2)-(a3)之一有可能是固体，而其它组分是液体，可将固体组分溶于液体组分中，至少可溶于甲醇中。因此可将固体化合物分别溶解于液体添加剂或组分(α1)或(a1)中。
可用作组合物(A)的特别适合的组合物是例如实施例中所用的组合物，属于以上组分(A)的定义，不依赖于本文所示的条件。这意味着实施例所用的所有组合物属于本申请书的上述定义，代表了组合物(A)的最优选实施方式，可用作所述的组合物而不依赖于所示实施例的其它条件。
可将组合物(A)用作本发明方法步骤ii)中的第一种组合物。然而，特别要指出的是，在此方法中组合物(A)也可用于处理或保存无须“转运步骤”iii)中的生物材料。此外，只要步骤ii)中的第一种组合物含有上述主要成分甲醇，本发明方法步骤ii)中的第一种组合物可以是不同于组合物(A)的组合物。
要使生物材料与组合物(A)或步骤ii)中的第一种组合物接触，宜在接触期间将生物材料浸没在优选为液体的此组合物中，这样全部样品都被该组合物饱和。如果所用的生物材料是液体样品或分离的细胞或颗粒样品，那么可将该生物材料与此组合物混合，或将生物材料悬浮在此组合物中使之接触。
因此按照本发明的具体实施方式，生物材料与所述组合物的接触宜在-80℃至+80℃的温度范围内进行，优选在0℃至+80℃范围内，更优选在2、3、4、5、6、7、或8℃至+80℃范围内，还要优选在18℃至+80℃范围内，例如至少在-20℃、-19℃、-18℃、-17℃、-16℃、-15℃、-14℃、-13℃、-12℃、-11℃、-10℃、-9℃、-8℃、-7℃、-6℃、-5℃、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃、0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、室温、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃温度下进行。
这里，语句“生物材料与组合物接触宜在-80℃至+80℃的温度范围内进行或在以上引用的其它温度之一下进行”，指生物材料与组合物接触后此法获得的混合物温度位于以上引用的温度范围内。因此例如，在-20℃以下温度深度冰冻的样品，如保存在液氮中的样品可用作所述的生物材料，此时可采用这类温度(保存)大量或一种组合物，使所述生物材料与这类组合物接触后混合物的温度(也即所述生物材料的温度)位于上述温度范围内。
本发明处理生物材料的方法包括“转移步骤”iii)，此步骤将生物材料转移到含有体积最高达99％乙醇的第二种组合物(B)中。此转移步骤特别适合于贮藏生物材料，例如如果不需要在接下来的1-3天中进行进一步处理。
进行这种转移是将所述生物材料分别从步骤ii)的组合物或组合物(A)中取出，再将其浸没入组合物(B)中，或者，转移或合并全部样品指将生物材料与步骤ii)的组合物或组合物(A)合并到组合物(B)中或与组合物(B)混合。在以上最后面的一个例子中，可将组合物(B)加到样品(含生物材料和步骤ii)的组合物)或组合物(A)中，或者，可将样品倒入组合物(B)中。进行生物材料转移、或混合样品与组合物(B)的所述步骤，可采用例如二个不同的容器/试管/平皿，一个装步骤ii)的组合物或组合物(A)，另一个装组合物(B)，将生物材料从一个容器转移到另一个容器中，或者，可将全部样品[含生物材料和步骤ii)的组合物]或组合物(A)倒入组合物(B)中，或者，将组合物(B)倒入样品中。另一方面，所述转移步骤iii)可采用专门设计的装置，如具有二个腔室的装置，一个腔室装步骤ii)的组合物或组合物(A)，另一个装组合物(B)。设计的此装置通过各种操作对实施所述转移步骤可提供某种选择，例如通过旋转该装置打开一个屏障，或其它合适的步骤，使样品[含生物材料和步骤ii)的组合物]或组合物(A)与组合物(B)混合。
如果实施此转移步骤是使样品与组合物(B)混合，可将步骤ii)的组合物或组合物(A)以各种比例与组合物(B)混合。宜采用与步骤ii)的组合物或组合物(A)等当量比例的组合物(B)，优选采用过量的组合物(B)。因此，步骤ii)的组合物或组合物(A)与组合物(B)的比例范围是20∶1-1∶50，优选1∶1-1∶20，更优选1∶5-1∶10。
宜在生物材料与步骤ii)的第一种组合物接触后10分钟至72小时内进行步骤iii)的转移，优选在48小时内，更优选在24小时内进行。
组合物(B)所含的主要组分为乙醇。乙醇含量可高达99％，优选在20-90％范围内，更优选在40-85％范围内，甚至还要优选在50-80％范围内，最优选在60-70％范围内。组合物(B)还可包含与组合物(A)的组分(α3)或(a3)相对应的酸，其含量为0-30％，优选1-15％，更优选5-10％；和二价或三价醇，及上述含量的与组合物(A)的组分(α2)或(a2)相对应的其它组分。然而，在高度优选的实施方式中，组合物(B)不含水，意味着它也是一种无水组合物。
此外，根据本发明方法的一具体实施方式，优选生物材料与步骤ii)的组合物接触(宜在上述温度条件下)后，在步骤ii)后或优选在步骤iii)后贮藏在-80℃至+80℃的温度范围内，优选在0℃至+80℃范围内，甚至更优选在2、3、4、5、6、7、或8℃至+80℃范围内，还要优选在18℃至+80℃范围内，例如至少在-20℃、-19℃、-18℃、-17℃、-16℃、-15℃、-14℃、-13℃、-12℃、-11℃、-10℃、-9℃、-8℃、-7℃、-6℃、-5℃、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃、0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、室温、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃温度下贮藏，可贮藏的时间至少为一天，优选至少二天，更优选至少三天，任选至少一周，至少二周，至少一个月，至少三个月，至少6个月或至少12个月。
本发明的方法能够在室温、冰箱温度或甚至较高的温度下保存经过处理的生物材料，而该生物材料中的生物分子如核酸或蛋白质不会发生明显降解。此点表明其显著优于常规的中性福尔马林缓冲液固定技术，后者需要在24小时内进一步处理标本以避免固定过度。与危害组织形态的冷冻固定法相比，本方法的优点是不会损害形态，实施本方法不必用液氮或深度冷冻装置，稳定后的样品贮藏不需要用液氮或深度冷冻装置。
经过本发明方法处理和任选在可能的贮藏步骤之前或之后，可对经过处理的生物材料，具体指组织材料作进一步处理。使组织通过一系列试剂，经最后的试剂浸润后包埋到稳定的介质中，该介质变硬为显微切片提供了支持。处理的第一步是脱水。通过处理去除组织中的一些或所有水后，将其包埋入介质中。此步骤的实施是将样品转移通过浓度递增的亲水性或可与水混溶的液体。脱水剂的例子有醇类如乙醇、甲醇、异丙醇、直链叔丁醇；乙二醇-醚如2-氧乙醇、二噁烷或聚乙二醇，以及其它脱水剂如丙酮、四氢呋喃或2.2-二甲氧基丙烷。下一步处理是用溶剂清洗可促进脱水与渗透步骤之间的过渡。此步是必须的即使脱水剂与包埋介质不能混溶。清洗剂的例子包括：二甲苯、柠檬烯、苯、甲苯、氯仿、石油醚、二硫化碳、四氯化碳、二噁烷、丁香油或香柏油，或可市售其它二甲苯代用品。
经处理和任选的清洗步骤后，可用合适的包埋材料(C)，如石蜡、矿物油、非水溶性蜡质、二甘醇、酯蜡、聚酯蜡、火棉胶、聚乙二醇、单硬脂酸聚乙二醇、聚乙烯醇、琼脂、明胶、硝酸纤维素、甲基丙烯酸酯树脂、环氧树脂、其它塑料介质等渗透和包埋生物材料，使生物材料更易制成组织切片从而适合组织学检查。所述的渗透和包埋步骤宜在温和条件下，如在低溶点石蜡(溶点低于60℃)中尽可能快地进行，然而这不是对本发明方法的限制。可用手工或任何自动化系统进行所述步骤。组织处理机的例子有TE公司(Thermo ElectronCorporation)的产品Shandon Excelsior、Shandon Pathcentre或Shandon Citadel，以及LM公司(Leica Microsystems)的产品Leica TP1020、Leica ASP200S或LeicaASP300S，或其它组织处理装置。
此外，按照本发明方法的一具体实施方式，优选在步骤iii)后进行下一步
iv)额外处理步骤，该步骤选自：手工处理该生物材料，用微波能处理该生物材料，或用任何一种组织脱水处理装置处理该生物材料。
用微波能处理生物材料是己知的方法。例如在US 6,207,408B1、WO99/09390、WO01/44783和WO01/44784中描述了其方法和合适装置的最好结果。优选在本发明方法中采用这些文献中描述的装置。
此步中使生物材料经受微波辐射。在经受辐射时宜将其放在100％乙醇中同时搅拌脱水，任选随后用100％异丙醇作为中间试剂，然后放入合适的微波装置内(即能严格控制温度的实验室用微波炉，如麦尔斯通公司(Milestone)的RHS-1、派克公司(Pelco)的Pelco BioWave或赛魔公司(Thermo)ShandoTissueWave)用包埋材料(C)包埋。或者可省略中间步骤，直接搅拌组合物(B)或不同醇的混合液，然后搅拌包埋材料(C)。宜在微波辐射加热到40-85℃，更优选40-75℃，最优选40-65℃下，处理生物材料60分钟，优选30分钟。
按照采用RHS-1微波组织处理器的标准方案，要用麦尔斯通公司的真空泵。在100％乙醇中搅拌生物材料并微波辐射18分钟结束时到65℃，然后在相同条件下用100％异丙醇脱水。70℃500mbar真空干燥组织30秒后，70℃150mbar真空下在液体石蜡中搅拌样品30分钟。
微波处理生物材料有二个主要优点：第一，可显著缩短处理生物材料到最终制成样品的全过程。第二，发现微波能量缩短了处理时间可显著提高未变性核酸，特别是RNA的得率。
因此，在本发明方法的一优选实施方式中，包括以下步骤：i)提供样品，ii)使样品在可以是组合物(A)的第一种组合物中固定/脱水，iii)将样品转移到第二种组合物(B)中，iv)用手工、微波能或处理装置处理样品并包埋。
本发明的组合物和方法提供的经过处理的样品仍能分离出该样品中原先所含的生物组分。生物分子的降解程度很低，仍能分离得到数量非常高的RNA(由于RNA酶广泛存在，RNA是降解程度最高的分子)。与先前开发的仅能保留RNA的组合物如RNAlater(安宾公司)相比，本发明的组合物和方法显示对给定样品可得到几乎相同量的RNA，然而与RNAlater不同，当采用本发明组合物和方法时，完美地保留了样品的形态。因此，可用同一样品作分子生物学和组织学分析。
本发明组合物和方法的另一优点是即使在组织学分析之后中，例如对采用激光显微切片装置制备的很少样品或单个细胞也能够提取到生物分子。
组织学检查宜理解为该领域技术人员己知的通过显微镜和任选利用染色和标记技术的一种适合分析组织形态、组织断面、细胞或亚细胞结构的检查方法。
需要分析的生物分子包括该领域技术人员己知的所有生物分子，具体是天然的、修饰的或合成的核酸，天然的、修饰的或合成的蛋白质或寡肽、激素、生长因子、代谢产物、脂质、寡糖或蛋白聚糖。核酸包括本领域技术人员己知的所有核酸，具体是核糖核酸(RNA)，例如mRNA、siRNA、miRNA、snRNA、tRNA、hnRNA或核糖酶、或脱氧核糖核酸(DNA)。涉及所有类型的多聚核酸苷包括：嘌吟碱基或嘧啶碱基的N-糖苷或C-糖苷。所述核酸可以是单链、双链或多链、线性、分枝或环形核酸。可与细胞中的分子，如基因组DNA或信使RNA(mRNA)相对应，或者在体外产生，如互补性DNA(cDNA)、反链RNA(aRNA)、或合成的核酸。核酸可由几个亚单位基、至少二个亚单位，优选8个或更多个单位组成，例如，寡核苷酸由几百个至几千个亚单位组成，例如表达载体，或显著更多个亚单位组成的基因组DNA。包含多肽编码信息的核酸宜与调控序列功能性相连，而使细胞中天然存在的核酸表达该多肽。在一优选的实施方式中，所述核酸是表达载体。在另一实施方式中，它是pDNA(质粒DNA)、siRNA、siRNA复制物或siRNA异质复制物，其中术语“siRNA”应理解为指长约22个核苷酸的核糖核酸，由酶“Dicer”劈裂双链RNA(dsRNA)而产生，从而构成酶复合体“RISC”(RNA-诱导的沉默复合体)。
句子“分析与所述组合物接触的生物材料中的生物分子”指可以原位分析，或例如，从生物材料中分离该生物分子后进行活体外分析。为了进行分析，需要分离生物分子，具体就细胞、组织或其它复杂或致密的样品而言，首先宜制备匀浆化样品，可用机械方法，例如用套管、研钵、旋转叶片匀浆器、球磨机等实施这种匀浆，和用化学方法，通过加入合适的裂解液制备匀浆，这种裂解液通常含洗涤剂和/或高离液物质；或加入酶，如蛋白酶制备匀浆，或者联合应用这些技术。
为了对生物材料进行组织学分析或生物分子分析，可采用该领域技术人员已知的和合适的所有分析方法，优选的可选方法为：染色法，如用甲酚紫、品红-亚甲基蓝-天蓝(Fuchsine-methylene blue-azur)、法国花青、吉姆萨、马森三色绿(Green Masson Trichrome)、海登海因染料(Heidenhain′s azan)、苏木精铁、苏木精-曙红、苏木精-曙红+阿辛兰染色、牛心果碱浸润银染色、勒克司光兰、亚甲基蓝、帕彭海姆(Pappenheim)染色、甲苯胺兰、魏格特氏间苯二酚-品红、魏格特凡葛森(Weigert Van Gieson)、马森三色黄；光学显微镜、电子显微镜、共聚焦激光扫描显微镜、激光显微解剖、扫描电镜、原位杂交、荧光原位杂交、原位杂交染色体基因检测、免疫组化、Western印迹、Southern印迹、Northern印迹、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫沉淀、亲和层析、突变分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、特别是二维PAGE；核酸扩增技术包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、转录介导的扩增(TMA)、NASBA、SDA、分枝DNA分析、RFLP分析(限制性片段长度多态性分析)、SAGE分析(基因表达的系列分析)、FPLC分析(快速蛋白液相色谱)；质谱如MALDI-TOFF质谱、SELDI质谱；微阵列分析、LiquiChip分析、酶活性分析、HLA-分型、测序、WGA(全基因组扩增)、RT-PCR、实时-PCR、RNA酶保护分析或引物延伸分析。
按照本发明方法的一具体实施方式，所述分析包括对生物材料的组织学分析和生物分子分析。按照本发明方法的另一具体实施方式，生物分子的分析包括对生物材料的核酸分析和蛋白质分析。
用本发明方法处理生物材料可促进了上述目标的实现。
也可采用以下试剂盒来促进上述目标的实现，该试剂盒装有：
(b1)一种可用作以上本发明方法中所述步骤ii)的第一种组合物的组合物，和
(b2)组合物(B)，
(b3)任选的包埋材料(C)和/或用于分析生物材料中的生物分子或生物材料的生物分子或分析生物材料的形态学的试剂。
采用以下试剂盒也可促进上述目标的实现，该试剂盒装有：
(b1)组合物(A)，
(b2)任选的组合物(B)，
(b3)任选的包埋材料(C)和/或用于分析生物材料中的生物分子或生物材料的生物分子或分析生物材料形态学的试剂。
分析生物材料中的生物分子或分析生物材料形态学的试剂主要是本领域技术人员已知的所有试剂，可用它们来对生物材料作形态分析或对生物材料的生物分子进行分析。这些试剂具体包括染色细胞、细胞组分的染料；抗体(任选用荧光染料或酶标记)，吸附基质如DEAE、纤维素或二氧化硅膜，酶的底物，琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，溶剂如乙醇或苯酚，缓冲水溶液，无RNA水，裂解剂，醇溶液等。
也可采用组合物(A)或上面所述的一种试剂盒来处理生物材料来促进上述目标的实现，在本发明方法中，可将本发明方法步骤ii)的第一种组合物和组合物(B)联用，或采用上面所述的一种试剂盒来处理生物材料，特别是稳定生物材料。
也可采用活体外诊断疾病的方法来促进上述目标的实现，该方法包括以下处理步骤：
(c1)实施本发明的包括处理步骤i)、ii)、iii)和任选步骤iv)的方法，和
(c2)用生物学和/或组织学方法分析经过处理的生物材料分子。
附图
图1凝胶显示实施例1中叙述的从肝组织制备的RNA。凝胶中的各泳道与表1样品的编号相对应。
图2凝胶显示实施例2中叙述的从肝组织制备的RNA。凝胶中的各泳道与表2样品的编号相对应。
图3凝胶显示实施例3中叙述的从肝组织制备的RNA。凝胶中的各泳道与表3样品的编号相对应。
图4凝胶显示实施例4中叙述的从肠组织制备的RNA。凝胶中的各泳道与表4样品的编号相对应。
图5凝胶显示实施例5中叙述的从肝组织制备的RNA。凝胶中的各泳道与表5样品的编号相对应。
图6凝胶显示实施例6中叙述的从肝组织制备的RNA。凝胶中的各泳道与表6样品的编号相对应。
图7凝胶显示实施例7中叙述的从肝组织制备的RNA。凝胶中的各泳道与表7样品的编号相对应。
图8凝胶显示实施例8中叙述的从脾组织制备的RNA。凝胶中的各泳道与表8样品的编号相对应。
图9凝胶显示实施例9中叙述的从脾组织制备的RNA。凝胶中的各泳道与表9样品的编号相对应。
图10显示按照实施例10制备的经过固定和染色的肠组织。
图11显示按照实施例11制备的经过固定和染色的脾组织。
图12显示按照实施例11制备的经过固定和染色的脾和肾组织。
图13凝胶显示从按照实施例12制备的固定的脾组织分离得到的DNA。
现在通过以下实施例对本发明作更详细的说明。提供的实施例只是为了说明，不应认为是将本发明限制于所示的实施方式。
实施例1
用组合物A的不同试剂稳定的组织样品的RNA分离
解剖后立即将大鼠肝组织切成约5x4x4mm的切片。将样品完全浸没在5ml聚丙烯收集管中的2-4ml组合物A固定液(表1)中。室温保存组织样品24小时。
用市售试剂盒(RNeasy Mini，恰根公司(QIAGEN))按RNeasy Mini方案所述提取RNA，分离得到动物组织的总RNA。将组织样品切成小切片置于2ml微量离心管中。测定每张组织切片的重量，每10mg组织加入350μl含异硫氰酸胍(GITC)的裂解缓冲液(缓冲液RLT，恰根公司)和钢球(5mm)。在混合-球磨机(Tissue-Lyser，恰根公司)上以20Hz进行组织粉碎同时匀浆2分钟。按该工艺所述GITC能裂解细胞并沉淀蛋白质。14.000rpm离心裂裂解液3分钟。将代表大约10mg的350μl上清液转移到一新试管与1个体积(350μl)70％乙醇混合后，加到含二氧化硅膜的旋转柱(RNeasy-Mini柱)上。离心使裂解液通过膜，此时RNA吸附于膜。用350μl含GITC的洗涤缓冲液RWI(恰根公司)洗涤膜2次除去污染物。2次洗涤步骤之间在膜上加入10μl DNA酶(约30Kunitz单位)和70μl缓冲液RDD(恰根公司)混合室温培育15分钟以去除残留的DNA。再用500μl含Tris-CI和醇的洗涤缓冲液RWI(恰根公司)洗涤2次后，14,000rpm全速离心1分钟干燥该膜。最后加入40μl水室温培育1分钟10,000rpm离心1分钟洗脱得到RNA。加入40μl水重复此洗脱步骤，合并2次洗脱液。所有提取实验重复3次。
在分光光度计上测定260nm吸光度(A260)确定RNA浓度。为确保显著性，用10mM Tris-Cl pH7.5稀释洗脱液后显示其吸光度A260在1-0.15之间。在此条件下，260nm吸光度1个单位对应于44μg RNA。
用变性琼脂糖凝胶电泳分析总RNA的完整性和大小分布。例如将15μl洗脱液与3μl含甲醛(FA)和溴酚兰的样品缓冲液混合后70℃培育10分钟，置冰上冷却后加到用1xFA凝胶电泳缓冲液平衡的1.0％甲醛-琼脂糖-MOPS凝胶上电泳90分钟，电泳室每cm长度施加约3伏电压。溴化乙锭染色显示RNA。图1为凝胶图，凝胶上的泳道与表1所示样品的编号相对应。
如表1所示，如果组织保存不超过24小时，与用RNAlater固定组织相比，用组合物A处理组织样品后导致RNA得率提高。显示了用不同浓度的组分a1和不同浓度的不同添加组分a2和a3(表1，1-18和20-26)处理的结果，用RNAlater作为参照(表1.19)。
完整性和大小分布的分析显示，在染色的凝胶核糖体条带中18S-和28SrRNA呈现为清晰条带(图1)。由于染色凝胶上28S rRNA条带的强度约为18SRNA条带的2倍，无较小的RNA和几乎看不见污迹(smear)，可得出结论：在此法的固定和制备期间RNA样品未受到降解。
表1
| 编号 | 试剂组成 | 从10mg组织得到的RNA量[μg] |
| 1 | 70％甲醇，10％冰乙酸，10％PEG300，10％三元醇混合物(25％3-甲基-1，3，5-戊三醇，75％1，2，6-己三醇)10％冰乙酸 | 13,79 |
| 2 | 70％甲醇，10％冰乙酸，10％PEG300，10％二甘醇单乙醚醋酸酯 | 15,20 |
| 3 | 70％甲醇，10％冰乙酸，10％PEG300，10％1，3-丁二醇 | 19,13 |
| 4 | 70％甲醇，10％冰乙酸，10％PEG300，10％1，4-丁二醇 | 20,26 |
| 5 | 70％甲醇，10％冰乙酸，20％PEG300 | 14,73 |
| 6 | 70％甲醇，10％冰乙酸，20％三元醇混合物(25％3-甲基-1，3，5-戊三醇，75％1，2，6-己三醇)，10％冰乙酸 | 19,17 |
| 7 | 70％甲醇，10％冰乙酸，20％二甘醇单乙醚醋酸酯 | 29,14 |
| 8 | 70％甲醇，10％冰乙酸，20％1，3-丁二醇 | 29,90 |
| 9 | 70％甲醇，10％冰乙酸，20％1，4-丁二醇 | 28,08 |
| 10 | 60％甲醇，10％冰乙酸，20％三元醇混合物(25％3-甲基-1，3，5-戊三醇，75％1，2，6-己三醇)10％冰乙酸，10％PEG300 | 17,53 |
| 11 | 60％醇，10％冰乙酸，20％二甘醇单乙醚醋酸酯，10％PEG300 | 17,64 |
| 12 | 60％甲醇，10％冰乙酸，20％1，3-丁二醇，10％PEG300 | 18,66 |
| 13 | 60％甲醇，10％乙酸，20％1，4-丁二醇，10％PEG300 | 17,97 |
| 14 | 60％甲醇，10％冰乙酸，30％PEG300 | 9,60 |
| 15 | 60％甲醇，10％冰乙酸，30％三元醇混合物(25％3-甲基-1，3，5-戊三醇，75％1，2，6-己三醇)10％冰乙酸 | 35,03 |
| 16 | 60％甲醇，10％冰乙酸，30％二甘醇单乙醚醋酸酯 | 28,66 |
| 17 | 60％甲醇，10％冰乙酸，30％1，3-丁二醇 | 26,92 |
| 18 | 60％甲醇，10％冰乙酸，30％1，4-丁二醇 | 18,26 |
| 19 | RNAlater | 39,97 |
| 20 | 70％甲醇，10％丙酸，10％PEG300，10％LiCl(1M) | 35,57 |
| 21 | 70％甲醇，10％丙酸，10％PEG300，10％LiCl(100mM) | 32,88 |
| 22 | 70％甲醇，10％丙酸，10％PEG300，10％1，3-丁二醇 | 40,37 |
| 23 | 70％甲醇，10％丙酸，10％LiCl(1M)，10％1，3-丁二醇 | 36,19 |
| 24 | 70％甲醇，10％丙酸，10％LiCl(100mM)，10％1，3-丁二醇 | 33,14 |
| 25 | 60％甲醇，10％酸，10％PEG300，10％LiCl(1M)，10％1，3-丁二醇 | 29,61 |
| 26 | 60％甲醇，10％丙酸，10％PEG300，10％LiCl(100mM)，10％1，3-丁二醇 | 31,79 |
实施例2
用组合物(A)的不同试剂和含乙醇作为主要组分的试剂稳定的组织的RNA
分离
解剖后立即将大鼠肝组织切成约5x4x4mm的切片。将样品完全浸没在5ml聚丙烯收集管中的2-4ml含组合物A的乙醇(表2，4-6)或甲醇(表2，1-3)固定液中。室温保存组织样品24小时。
按实施例1所述提取RNA并分析其得率和完整性。所有提取实验重复3次。凝胶结果见图2。凝胶上的泳道与表2所示样品的编号相对应。
如表2所示，当采用含主要成分乙醇的试剂稳定组织样品时RNA的得率特别高。尽管得率高，但琼脂糖电泳显示含乙醇的稳定剂得到的RNA在贮藏期间遭受到不同程度的降解。与组合物1-3不同，18S和/或28S核糖体RNA未能染成清晰的可区分条带，而是可看见不同程度的污迹和较小的RNA条带(图2)。就含乙醇的试剂而言，推测由于较小的核糖核酸片段260nm吸光度较高而导致了RNA测定的人为升高。
表2：
| 编号 | 试剂组合物 | 从10mg组织得到的RNA量[μg] |
| 1 | 60％甲醇，10％PEG300，25％二甘醇单乙醚醋酸酯，5％丙酸 | 30,66 |
| 2 | 70％甲醇，25％二甘醇单乙醚醋酸酯，5％丙酸 | 38,26 |
| 3 | 70％甲醇，20％二甘醇单乙醚醋酸酯，10％丙酸 | 26,55 |
| 4 | 70％乙醇 | 47,29 |
| 5 | Boonfix(主要成分为乙醇-根据供货商说明) | 50,27 |
| 6 | Finefix(含70％乙醇的工作液) | 52,96 |
实施例3
用含水或不含水的含甲醇作为主要组分的不同试剂稳定的组织的RNA分
离
解剖后立即将大鼠肝组织切成约5x4x4mm的切片。将样品完全浸没在5ml聚丙烯收集管中的2-4ml含组合物A的甲醇水溶液(表3，1)或无水甲醇(表3，2)的固定液中。室温保存组织样品更长时间4天。
按实施例1所述提取RNA并分析其得率和完整性。所有提取实验重复3次。凝胶结果见图3。凝胶上的泳道与表3所示样品的编号相对应。
如表3和图3(no.2)所示，即使保存4天后，从用组合物A的无水甲醇保存的组织样品提取得到了完整的RNA。与实施例1和2的结果相比得率虽减少，但仍可见28S和18S rRNA的完整条带，无污迹或较小的可区分的RNA条带。这与用含水试剂稳定的组织样品得到的RNA受到高度降解和浓度低相反(表3，1和图3)。
表3：
| 编号 | 试剂组合物 | 从10mg组织得到的RNA量[μg] |
| 1 | 60％甲醇，30％水，10％冰乙酸 | 2,25 |
| 2 | 60％甲醇，30％三元醇混合液(25％3-甲基-1，3，5-戊三醇，75％1，2，6-己三醇)10％冰乙酸 | 10,98 |
实施例4
用不同试剂稳定且转移或不转移到本发明第二试剂组合物B的组织的
RNA分离
解剖后立即将大鼠肠组织切成约5x4x4mm的切片。将样品完全浸没在5ml组合物A的不同试剂中室温保存。样品或贮藏7天(表4，1-4)，或4小时后转移到5ml组合物B的试剂中在该试剂中保存7天(表4，5-8)。
按实施例1所述提取RNA并分析其得率和完整性。所有提取实验重复3次。凝胶结果见图4。凝胶上的泳道与表4所示样品的编号相对应。
如表4所示，与转移到本发明组合物B的试剂中那些样品的结果相比，当样品未转移到这种第二试剂中时，其RNA得率显著降低。琼脂糖凝胶电泳显示，即使7天贮藏后，按照本发明处理保存在组合物A和B的试剂中的组织样品仍能分离得到完整的RNA。凝胶电泳证实当省略了这种转移时得率低(图4)。
表4：
| 编号 | 试剂组合物A | 试剂组合物B | 从10mg组织得到的RNA量[μg] |
| 1 | 70％甲醇，25％二甘醇单乙醚醋酸酯，5％丙酸 | - | 3,7 |
| 2 | 70％甲醇，25％1，3-丁二醇，5％丙酸 | - | 3,5 |
| 3 | 90％醇，10％PEG300 | - | 4,4 |
| 4 | 70％甲醇，30％PEG300 | - | 2,4 |
| 5 | 70％甲醇，25％二甘醇单乙醚醋酸酯，5％丙酸 | 70％乙醇，30％1，3-丁二醇 | 8,7 |
| 6 | 70％甲醇，25％1，3-丁二醇，5％丙酸 | 70％乙醇，30％1，3-丁二醇 | 6,8 |
| 7 | 90％甲醇，10％PEG300 | 70％乙醇，30％1，3-丁二醇 | 8,7 |
| 8 | 70％甲醇，30％PEG300 | 70％乙醇，30％1，3-丁二醇 | 12,6 |
实施例5
用本发明组合物A和B的试剂稳定的组织的RNA分离
解剖后立即将大鼠肝组织切成约5x4x4mm的切片。将样品完全浸没在10ml组合物A的试剂中室温保存。一份样品贮藏3天(表5，10)，另一份样品2小时后转移到10ml组合物B的不同试剂中在这些试剂中贮藏3天(表5，1-8)。将一份样品贮藏在RNAlater中作为参比(表5，9)。
按实施例1所述提取RNA并分析其得率和完整性。所有提取实验重复3次。凝胶结果见图5。凝胶上的泳道与表5所示样品的编号相对应。
此实施例再次显示了本发明的组织处理，即从组合物A的试剂转移到组合物B的试剂后对RNA稳定性的影响。样品转移后，RNA的得率仍高，得率范围与用RNAlater的参比品相当(表5，1-7和9)。即使贮藏3天后也未观察到RNA降解(图5，1-7和9)。相反，省略了转移时，RNA得率显著降低并可见其降解，即污迹增多和28S rRNA条带减小(表5，10和图5，10)。当将样品转移到Boonfix(见上文)中时可观察到同样结果，按Boonfix供货商说明该试剂主要为乙醇但采用水平衡(表5，8和图5，8)
表5：
| 编号 | 试剂组合物A | 试剂组合物B | 从10mg组织得到的RNA量[μg] |
| 1 | 70％甲醇，10％冰乙酸/10％PEG300，10％1，3-丁二醇 | 70％乙醇，30％1，3-丁二醇 | 35,90 |
| 2 | 70％甲醇，10％冰乙酸/10％EG300，10％1，3-丁二醇 | 70％乙醇，1％1％冰乙酸，29％1，3-丁二醇 | 33,97 |
| 3 | 70％甲醇，10％冰乙酸/10％PEG300，10％1，3-丁二醇 | 70％乙醇，5％1％冰乙酸，25％1，3-丁二醇 | 19,93 |
| 4 | 70％甲醇，10％冰乙酸/10％PEG300，10％1，3-丁二醇 | 70％乙醇，10％1％冰乙酸，20％1，3-丁二醇 | 18,44 |
| 5 | 70％甲醇，10％冰乙酸/10％PEG300，10％1，3-丁二醇 | 60％乙醇，40％1，3-丁二醇 | 41,68 |
| 6 | 70％甲醇，10％冰乙酸/10％PEG300，10％1，3-丁二醇 | 60％乙醇，1％1％冰乙酸，39％1，3-丁二醇 | 33,86 |
| 7 | 70％甲醇，10％冰乙酸/10％PEG300，10％1，3-丁二醇 | 60％乙醇，5％1％冰乙酸，35％1，3-丁二醇 | 21,02 |
| 8 | 70％甲醇，10％冰乙酸/10％PEG300，10％1，3-丁二醇 | Boonfix | 14,59 |
| 9 | RNAlater | - | 37,25 |
| 10 | 70％甲醇，10％冰乙酸/10％PEG300，10％1，3-丁二醇 | - | 6,00 |
实施例6
用本发明方法稳定的组织的RNA分离
解剖后立即将大鼠肝组织切成约5x4x4mm的切片。将样品完全浸没在2ml步骤ii)的组合物试剂中室温保存4小时，转移到组合物B的不同试剂中再贮藏2天(表6，3-9)。此外，一份样品不转移但贮藏在步骤ii)的试剂组合物中(表6，10)，一份样品转移到100％乙醇中(表6，1)，一份样品转移到70％乙醇中(表6，2)。
按实施例1所述提取RNA并分析其得率和完整性。所有提取实验重复3次。凝胶结果见图6。凝胶上的泳道与表6所示样品的编号相对应。
此实施例显示了本发明转移到组合物B的不同试剂中的稳定效果。显示含有不同添加成分(a2)和不同有机酸浓度(a3)的不同试剂的效果(表6，3-9和图6，3-9)。用水平衡第二试剂导致RNA得率降低、琼脂糖凝胶上的污迹增加，表明高度降解(表6和图6，2)。转移到100％乙醇中不会导致任何降解，RNA得率仍高(表6和图6，1)。然而，为众人共同接受的是保存在100％乙醇中的组织样品会变硬和皱缩，结果样品易破碎，导致进行后续组织学检查时出现人为痕迹。
表6：
| 编号 | 步骤ii)的试剂组合物 | 试剂组合物B | 从10mg组织得到的RNA量[μg] |
| 1 | 60％甲醇，30％氯仿，10％冰乙酸 | 100％乙醇 | 36,51 |
| 2 | 60％甲醇，30％氯仿，10％冰乙酸 | 70％乙醇，30％水 | 8,16 |
| 3 | 60％甲醇，30％氯仿，10％冰乙酸 | 70％乙醇，30％1，3-乙二醇 | 29,50 |
| 4 | 60％甲醇，30％氯仿，10％冰乙酸 | 70％乙醇，30％二甘醇单乙醚醋酸酯 | 33,22 |
| 5 | 60％甲醇，30％氯仿，10％冰乙酸 | 70％乙醇，30％PEG300 | 24,29 |
| 6 | 60％甲醇，30％氯仿，10％冰乙酸 | 70％乙醇，30％1，2，6-己三醇 | 29,22 |
| 7 | 60％甲醇，30％氯仿，10％冰乙酸 | 70％乙醇，5％冰乙酸，25％1，3-丁二醇 | 9,41 |
| 8 | 60％甲醇，30％氯仿，10％冰乙酸 | 70％乙醇，5％冰乙酸，25％二甘醇单乙醚醋酸酯 | 16,74 |
| 9 | 60％甲醇，30％氯仿，10％冰乙酸 | 70％乙醇，5％冰乙酸，25％1，2，6-己三醇 | 14,24 |
| 10 | 60％甲醇，30％氯仿，10％冰乙酸 | - | 4,48 |
实施例7
按本发明方法以氯仿代替稳定的组织的RNA分离
解剖后立即将大鼠肝组织切成约5x4x4mm的切片。将样品完全浸没在5ml含醚或氯仿的试剂中，或用相应量的水或甲醇代替试剂中的氯仿，或浸没在步骤ii)组合物的试剂中，室温保存48小时(表7，1-4)。此外，一份样品3小时后转移到组合物B的试剂中再贮藏45小时(表7，5)。
按实施例1所述提取RNA并分析其得率和完整性。所有提取实验重复3次。凝胶结果见图7。凝胶上的泳道与表7所示样品的编号相对应。
此实施例表明，固定剂中的氯仿不能用相应量的甲醇或水代替(表7和图7，1-3)。用甲醇或水代替氯仿导致RNA得率减少和琼脂糖凝胶上污迹增多，表明高度降解(表7和图7，2.3)。为了达到相似的稳定效果，要代替氯仿必须至少用另一种添加剂(a2)(表7和图7，4)。然而，3小时后组织样品转移到组合物B的试剂中可达到最佳稳定效果、最高的RNA得率和最少的RNA降解(表7和图7，5)。
表7：
| 编号 | 试剂组合物 | 试剂组合物B | 从10mg组织得到的RNA量[μg] |
| 1 | 60％甲醇，30％氯仿，10％冰乙酸 | - | 8,73 |
| 2 | 60％甲醇，30％水，10％冰乙酸 | - | 3,04 |
| 3 | 90％甲醇，10％冰乙酸 | - | 0,96 |
| 4 | 60％甲醇，30％二甘醇单乙醚醋酸酯，10％冰乙酸 | - | 9,42 |
| 5 | 60％甲醇，30％二甘醇单乙醚醋酸酯，10％冰乙酸 | 70％乙醇，30％1，3-丁二醇 | 25,13 |
实施例8
用本发明组合物A和B的试剂稳定并用常规方法处理的石蜡包埋组织的
RNA分离
解剖后立即将大鼠脾组织切成约4x4x4mm的切片。将样品完全浸没在5ml组合物A的试剂中室温保存24小时。培育此时间后将样品直接处理(表8，1和4)或转移到组合物B的试剂中，室温再贮藏4天(表8，2和5)或4℃贮藏(表8，3和6)最后处理。
处理包括脱水、清洗、渗透和包埋，按标准程序用手工进行。将样品置于标准的处理盒(组织处理盒(histosettes))中，依次转移通过浓度递增的乙醇而脱水，即在70％、80％乙醇中培育2次，和在96％乙醇中培育，各60分钟。需明白，脱水与包埋介质渗透之间的过渡步骤是在100％二甲苯中培育2次。组织块和细胞用液体石蜡(低熔点Paraplast XTRA，罗斯公司(Roth Inc.))56℃饱和约12小时。为提供显微切片所需的支撑，将样品包埋在渗透用的相同石蜡中。
采用石蜡块新鲜切片作为RNA的起始材料。用旋转切片机(Leica RM2245)纵切石蜡块，每个样品切取10片各10μm厚的切片并收集到微型离心管中。加入1ml二甲苯，涡旋混合后14,000rpm离心2分钟进行脱蜡。弃去上清液将沉淀溶于1ml100％乙醇。14,000rpm离心2分钟后弃去上清液重复乙醇洗涤步骤。离心和弃去乙醇后将沉淀溶于含0.143M β-巯基乙醇的350μl RLT缓冲液(恰根公司)中。为了匀浆，将裂解液加到QIAshredder旋转柱(恰根公司)上14.000rpm离心3分钟。取流穿液与1个体积(350μl)的70％乙醇混合后加到RNeasyMinElute旋转柱(恰根公司)上。离心使裂解液转移通过膜，此时RNA即吸附在膜上。按实施例1所述用缓冲液RWI和RPE洗涤并在膜上进行DNA酶消化。洗脱时在二氧化硅膜上加入15μl水室温培育1分钟后14,000rpm离心1分钟洗脱得到RNA。
所有提取实验重复3次，按实施例1所述分析RNA得率和完整性。。凝胶结果见图8。凝胶上的泳道与表8所示样品的编号相对应。
琼脂糖凝胶电泳分析RNA的完整性揭示，从本发明方法处理的石蜡包埋的组织样品分离得到了全长RNA。即使必须在液体石蜡中培育多达12小时包埋样品也不导致大多数RNA降解。28S-和18S rRNA条带清晰可见为可区分条带(图8)。RNA得率不同可用起始材料用量不同来解释(表8)。与软组织的RNA提取相反，不能测定切片中的起始材料和按10mg每份样品标准化，4℃或室温组织保存在组合物B的试剂中相互之间未见有显著差异。
表8：
| 编号 | 试剂组合物A | 试剂组合物B | 从10张10μm切片得到的RNA量[μg] |
| 1 | 60％甲醇，5％丙酸，10％PEG300，25％二甘醇单乙醚醋酸酯 | - | 3,53 |
| 编号 | 试剂组合物A | 试剂组合物B | 从10张10μm切片得到的RNA量[μg] |
| 2 | 60％甲醇，5％丙酸，10％PEG300，25％二甘醇单乙醚醋酸酯 | 70％乙醇，30％1，3-丁二醇 | 1,79 |
| 3 | 60％甲醇，5％丙酸，10％PEG300，25％二甘醇单乙醚醋酸酯 | 70％乙醇，30％1，3-丁二醇 | 1,25 |
| 4 | 70％甲醇，10％丙酸，20％二甘醇单乙醚醋酸酯 | - | 2,70 |
| 5 | 70％甲醇，10％丙酸，20％二甘醇单乙醚醋酸酯 | 70％乙醇，30％1，3-丁二醇 | 1,53 |
| 6 | 70％甲醇，10％丙酸，20％二甘醇单乙醚醋酸酯 | 70％乙醇，30％1，3-丁二醇 | 1,39 |
实施例9
按本发明稳定并用微波能处理的石蜡包埋组织的RNA分离
解剖后立即将大鼠脾组织切成约4x4x4mm的切片。将样品完全浸没在5ml组合物A的试剂中。样品室温保存24小时(表9，2和3)或30分钟后转移到组合物B的试剂中室温保存24小时(表9，4和5)。平行试验将一份样品浸没在5ml Boonfix中(表9，1)。
24小时后将样品置于标准的处理盒(组织处理盒)中在RHS-1微波组织处理机(麦尔斯通公司)上处理。处理采用标准的四步方案，包括样品用100％乙醇脱水、用微波能加热至65℃。用异丙醇取代乙醇，抽真空空气干燥后加热，最后一步微波能加热同时抽真空使液体石蜡(低熔点Paraplast XTRA，罗斯公司)渗透样品(此方案的步骤见表10)。为提供显微切片所需的支撑，将样品手工包埋在渗透所用的相同石蜡中。
室温保存石蜡包埋的组织块5周然后提取RNA。提取10张新鲜制备的10μm厚切片中的RNA。分别按实施例8和1所述脱蜡、提取RNA并分析其得率和完整性。所有提取实验重复2次。凝胶结果见图9。凝胶上的泳道与表9所示样品的编号相对应。
如图9所示，按本发明稳定的组织样品经微波能处理后得到的RNA质量高而且无降解现象(图9，2-5)。核糖体28S-和18S rRNA条带清晰无污迹无较小条带可见，这与用Boonfix处理的样品(图9，1)不同。
表9：
| 编号 | 试剂组合物 | 试剂组合物B | 从10张10μm切片得到的RNA量[μg] |
| 1 | Boonfix(主要成分为乙醇-根据供货商说明) | - | 2,43 |
| 2 | 70％甲醇，5％丙酸，25％二甘醇单乙醚醋酸酯 | - | 4,54 |
| 3 | 60％甲醇，5％丙酸，25％二甘醇单乙醚醋酸酯，10％PEG(300) | - | 4,55 |
| 4 | 70％甲醇，5％丙酸，25％二甘醇单乙醚醋酸酯 | 70％乙醇，30％1，3-丁二醇 | 2,11 |
| 5 | 60％甲醇，5％丙酸，25％二甘醇单乙醚醋酸酯，10％PEG(300) | 70％乙醇，30％1，3-丁二醇 | 3,55 |
表10：
| 步骤 | 培育液 | 时间[分] | 微波加热 | 真空[mbar] | 搅拌 |
| 1 | 乙醇 | 18 | 最高达65℃ | 无 | 有 |
| 2 | 异丙醇 | 19 | 最高达68℃ | 无 | 有 |
| 3 | 空气干燥 | 0.5 | 70℃ | 500 | 无 |
| 4 | 液体石蜡 | 22 | 70℃ | 最低至100 | 有 |
实施例10
用本发明组合物A和B的试剂稳定、用常规方法处理的组织样品的组织学
分析
解剖后立即将大鼠肠组织切成长约6mm的切片。将样品完全浸没在5ml组合物A的试剂中。室温放置4小时后转移到组合物B的试剂中室温保存20小时(表11，A)。平行试验取一份样品浸没在5ml 10％福尔马林中性缓冲液中(NBF；表11，B)。24小时后将样品置于标准的处理盒(组织处理盒)中按照标准程序手工处理，开始时在100％乙醇中培育2次各180分钟。用100％二甲苯培育60分钟2次进行清洗。以液体石蜡(低熔点Paraplast XTRA，罗斯公司)65℃渗透样品大约12小时然后用相同的石蜡包埋。
用旋转切片机(Leica RM2245)切成6μm厚的切片固定在载玻片上。用西格玛公司(Sigma Inc.)的染料按照标准程序手工进行苏木精和曙红染色(表12)。
如图10(放大100倍)所示，按本发明稳定的组织样品切片(图10，A)显示了与用10％福尔马林中性缓冲液保存切片的相似形态保存(图10，B)。
表11：
| 编号 | 试剂组合物 | 试剂组合物B |
| A | 70％甲醇，10％丙酸，20％二甘醇单乙醚醋酸酯 | 70％乙醇，30％1，3-丁二醇 |
| B | NBF，10％福尔马林中性缓冲液 | - |
表12：
| 培育/培育液 | 时间[分] |
| 70℃培育 | 10 |
| Rotihistol(二甲苯替代物，罗斯公司) | 10 |
| Rotihistol | 10 |
| 96％乙醇 | 5 |
| 80％醇 | 5 |
| 70％乙醇 | 5 |
| 60％醇 | 5 |
| 水 | 3 |
| 迈尔苏木精 | 5 |
| 水 | 0.5 |
| 70％醇含1％HCl | 0.5 |
| 水 | 5 |
| 曙红 | 5 |
| 水 | 1 |
| 96％乙醇 | 3 |
| 96％乙醇 | 5 |
| 100％异丙醇 | 10 |
| Rotihistol | 10 |
| Rotihistol | 10 |
实施例11
用本发明组合物A的不同试剂稳定、用常规方法处理的组织样品的组织学
分析
解剖后立即将大鼠脾和肾切成约3x5x5mm的切片。将样品完全浸没在10ml组合物A的试剂或10％福尔马林中性缓冲液中(表13)。室温24小时后处理和染色样品。用Leica TP1020组织处理机解剖后大约30小时进行样品处理。将石蜡包埋组织样品切成6μm切片。10％福尔马林保存的肾样品只切成4μm切片。在Leica自动染色机上按照与实施例8和10详述相同或相似程序的标准方案进行苏木精和曙红染色。
图11显示放大100倍的苏木精和曙红染色的脾切片。结果表明，用组合物A的试剂保存的组织样品(图11，A)与用10％福尔马林中性缓冲液保存的样品(图11，B)相互之间组织形态的保存相似。图12(A)或(B)分别描述的放大200倍的肾组织具有真正相同结果。观察到的唯一差别是红细胞。就组合物A的固定试剂而言，红细胞不含血红素。
表13：
| 编号 | 试剂组合物 |
| A | 70％甲醇，10％冰乙酸，10％二甘醇单乙醚醋酸酯，10％PEG300 |
| B | NBF，10％福尔马林中性缓冲液 |
实施例12
用本发明组合物A的试剂稳定并经常规方法处理的石蜡包埋组织的DNA
分离
解剖后立即将大鼠脾组织切成约2x5x5mm的切片。将样品完全浸没在5ml组合物A的不同试剂(表14)中室温保存24小时。经此培育期后按实施例7所述手工处理样品。室温保存石蜡包埋组织块5周后提取DNA。
为提取DNA，将石蜡块切成二半。用二甲苯和乙醇完全去除纯石蜡和组织脱蜡(也参见实施例8)。用市售试剂盒(DNeasy组织试剂盒，恰根公司)按DNeasy Tissue纯化动物组织总DNA的方案所述提取DNA。将脱蜡得到的小团块溶于180μl缓冲液ATL中加入钢球(5mm)。在混合-球磨机(Tissue-Lyser，恰根公司)上以20Hz同时进行组织粉碎和匀浆15秒。-20℃冰冻裂解液加入40μl蛋白酶K(活性600mAU/ml)24小时后作进一步处理。55℃恒速温和搅拌样品消化1小时。加入4μl RNA酶A(100mg/ml)室温培育2分钟去除样品中的RNA。加入200μl裂解缓冲液AL(恰根公司)70℃再培育10分钟，加入200μl乙醇(100％)，将裂解液加到含二氧化硅膜的DNeasy微型旋转柱上，离心(1分钟，8000rpm)使裂解液通过膜，此时DNA即吸附在膜上。用500μl AW1和500μl AW2(恰根公司)洗涤膜去除污染物。最后一次洗涤步骤后，14,000rpm全速离心3分钟使膜干燥。最后加入100μl水室温培育1分钟然后10,000rpm离心1分钟洗脱得到DNA。用另外100μl水重复此洗脱步骤，合并2次洗脱液。
在分光光度计上测定260nm吸光度(A260)确定DNA浓度。对于DNA，260nm吸光度1个单位对应于50μg DNA。
用琼脂糖凝胶电泳分析总DNA的完整性和大小。将含400ng DNA的15μl洗脱液与5μl加载缓冲液(含50％甘油和溴酚兰)混合。将样品加到放在1xTBE缓冲液中的0.8％琼脂糖凝胶上。电泳120分钟，每厘米电泳室长度施加约3.3伏电压。溴化乙锭染色显示DNA。
当用QIAamp DNeasy方法提取时，从保存在组合物A的试剂中并经处理、石蜡块包埋和5周贮藏的组织样品提取得到的DNA仍为高分子量。图13显示用每份样品400ng DNA作的凝胶电泳(泳道对应于表14的相同编号)。表14列出了典型的得率。
表14：
| 编号 | 试剂组合物A | DNA得率[μg] |
| 1 | 70％甲醇，10％丙酸，20％PEG300 | 50,10 |
| 2 | 70％甲醇，10％丙酸，20％三元醇混合液(25％3-甲基-1，3，5-戊三醇，75％1，2，6-己三醇) | 41,90 |
| 3 | 70％甲醇，10％酸，20％二甘醇单乙醚醋酸酯 | 17,80 |
| 4 | 70％甲醇，10％丙酸，20％，3-丁二醇 | 33,10 |
| 5 | 70％醇，10％丙酸，20％1，4-丁二醇 | 61,30 |
Claims (21)
1.一种处理生物材料的方法，该方法包括以下步骤：
i)提供生物材料；和
ii)使该生物材料与第一种无水组合物接触，该组合物包含：
(a1)10-90体积％的甲醇，和
(a2)至少一种其它添加剂，和
(a3)任选的一种酸，
iii)将该生物材料转移到含至最高达99体积％乙醇的第二种组合物(B)中。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物材料与所述组合物的接触在-80℃至+80℃的温度范围内进行。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，实施转移步骤iii)是从步骤ii)的组合物中取出生物材料将该材料浸没在组合物(B)中，或混合步骤ii)含有生物材料的组合物与组合物(B)。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，该方法包括：
iv)额外处理步骤，此步骤选自：手工处理生物材料，用微波能处理生物材料或用任何组织处理装置处理生物材料。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物材料包括细胞或组织。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述生物材料包括：生物体、分离的细胞、细胞器、细菌、真菌或真菌的一部分、病毒、类病毒、朊病毒、组织、组织片段、组织切片、体液、天然的任选分离的蛋白、合成或修饰的蛋白、天然的任选分离的核酸、合成或修饰的核酸、其它生物分子如脂质、糖类、代谢产物和代谢物、植物或植物的一部分、排泄物、拭子、抽吸物、食物样品、环境样品、法医样品。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，该方法还包括：在步骤iii)后用包埋材料(C)渗透和/或包埋所述材料，包埋材料优选石蜡、矿物油、非水溶性蜡质、火棉胶、聚乙二醇、聚乙烯醇、琼脂、明胶、硝酸纤维素、甲基丙烯酸酯树脂、环氧树脂或其它塑料介质。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，该方法还包括：
储存经过处理的生物材料，
分离所述样品原先含有的至少一种生物组分，
分析所述生物材料中的至少一种生物组分或所述生物材料的至少一种生物组分，
其中，所述生物组分包括核酸、蛋白质、肽和/或肽核酸，
和/或
对所述生物材料进行组织学分析，具体包括染色、镜检、解剖、杂交和/或免疫-组化检查。
9.可用于如权利要求1-8中任一项所述方法的用来保存生物材料的无水组合物(A)，该无水组合物包含：
(α1)10体积％到低于80体积％的甲醇，和
(α2)至少一种其它添加剂，和
(α3)一种酸。
10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，组分(α1)的存在量为20％到低于80体积％，优选30％到低于80％，最优选50％到低于80体积％。
11.如权利要求9或10所述的组合物或权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，组分(α2)或(a2)的存在量为1-50％。
12.如权利要求1-11中任一项所述的组合物或方法，其特征在于，组分(α3)或(a3)至少是一种有机酸，优选弱有机酸，更优选甲酸、乙酸和丙酸或它们的混合物。
13.如权利要求1-12中任一项所述的组合物或方法，其特征在于，组分(α2)或(a2)选自下组：一种或多种洗涤剂，一种或多种能抑制核酸/或蛋白质降解的抑制剂，一种或多种粘度调节剂，一种或多种染料，一种或多种缓冲化合物，一种或多种防腐剂，一种或多种络合剂，一种或多种还原剂，一种或多种能改善细胞通透性的物质，一种或多种高离液物质，一种或多种固定剂，一种或多种不同于甲醇的其它溶剂，以及这些添加剂中至少两种的混合物。
14.如权利要求13所述的组合物或方法，其特征在于，组分(α2)或(a2)选自：C2-C12多元醇，特别是二元醇和/或三元醇，如1，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，3-丙二醇、1，2-丙二醇、3-甲基-1，3，5-戊三醇，、1，2，6-己三醇、甘油、乙二醇；PEG和DEGMEA。
15.一种试剂盒，该试剂盒装有：
(b1)一种可用作权利要求1-8中任一项所述方法步骤ii)的第一种组合物的组合物，和
(b2)组合物(B)
(b3)任选的包埋材料(C)和/或用于分析生物材料中的生物分子或分析生物材料的生物分子或分析生物材料的形态的试剂。
16.一种试剂盒，该试剂盒装有：
(b1)组合物(A)
(b2)任选的组合物(B)
(b3)任选的包埋材料(C)和/或用于分析生物材料中的生物分子或分析生物材料的生物分子或分析生物材料形态学的试剂。
17.如权利要求9-14中任一项所述的组合物(A)或权利要求14或15所述的试剂盒在生物材料处理中的应用。
18.如权利要求9-14中任一项所述的组合物(A)或权利要求15或16所述的试剂盒在如权利要求1-8或11-14中任一项所述方法中的应用。
19.一种制备经过处理的生物材料的方法，该方法采用了权利要求9-14中任一项所述的组合物(A)或权利要求15或16所述的试剂盒。
20.一种在活体外分析生物材料的方法，该方法采用了权利要求1-8或11-14中任一项所述的方法、权利要求9-14中任一项所述的组合物(A)或权利要求15或16所述的试剂盒。
21.采用权利要求1-8或11-14中任一项所述方法或使生物材料与权利要求9-14中任一项所定义的组合物(A)接触而获得的经过处理的生物材料。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
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