CN101351693B - 处理生物学样品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及处理生物学样品的方法，该方法包括以下方法步骤：i)制备生物学样品，和ii)使所述生物学样品与包含以下组分的组合物接触：(1)以重量计，1％至100％的至少一种多元醇，和(2)以重量计，0至99％的至少一种添加剂，其中，以重量计，组分(1)和(2)的总量为100％。本发明还涉及通过所述方法获得的生物学样品，分析经处理的生物学样品的方法，处理生物学样品的装置，所述装置的应用、各种试剂盒和所述组合物的应用。
Description
本发明涉及处理生物学样品的方法，通过该方法获得的生物学样品，分析所处理生物学样品的方法，处理生物学样品的装置，这些装置的应用、各种试剂盒以及组合物的应用。
长期以来，科学家关注的只是生物学样品的病理学和/或组织学研究。这些研究所用样品的保存和/或稳定通常只是将样品置于甲醛溶液中和/或包埋在石蜡中。但为了保存目的，目前长期实施的甚至是冷藏或冷冻生物学样品。
只有当认识到检测生物学样品的某些成分，例如核酸或蛋白质有极大益处，特别是在医学和临床诊断领域时，才明白需要新颖的、更有效且更经济的保存和/或稳定试剂和/或方法。
在这些发展过程中，人们认识到对于分子生物学研究至关重要的是新鲜样品中各成分的状态(基因表达或蛋白质模式)即使在将样品从其天然环境中取出后的短时间内可能会迅速改变，因此，即使将样品长期保存于未处理状态(例如由于运输到实验室期间意外延迟等所致的改变)也会使分子生物学分析不真实或者根本不可能进行随后的分析。
随着取样和样品分析之间时间流逝的增加，生物学样品的核酸状态确实会快速改变。特别是普遍存在的RNA酶导致核糖核酸(RNA)极快降解。同样，核酸降解也伴有，例如对应激基因(stress gene)的诱导，因而合成了可能极大改变样品的转录模式的新mRNA分子。因此需要立即稳定样品，从而能保留所分析基因的表达分布模式。
立即稳定样品不仅是分析核酸，也是进行详细的生物学样品中蛋白质组学研究所需，因为取样后蛋白质模式可能会立即改变。这首先是由于降解或从头合成所致，但也可能极快发生蛋白质修饰，例如磷酸化/脱磷酸化。
由于蛋白质-化学和分子生物学分析不仅用于医学和临床诊断领域，其在例如法医学、药学、食品分析、农业、环境分析和许多研究项目等其它领域的应用也日益增加，因此，保留样品的分子结构完整性和使它们立即稳定(本文中)是所有这些领域中至关重要的前提。
多年来，已开发了多种极为不同的稳定剂和/或方法来稳定各种极为不同的生物学样品。
如上所述，早已知晓借助甲醛水溶液稳定样品，随后包埋经稳定的样品以进行组织学研究。然而，在大多数情况中，这种稳定方法不适用于分子生物学方法，因为核酸获得的稳定在于非常不充分，最多只能定性检测存在的核酸或核酸片段，而不是定量检测。此外，用交联稳定剂，例如甲醛水溶液进行稳定导致组织中提取的核酸或蛋白质减少。甲醛水溶液还因毒理学原因而无法接受。
例如US 5.010,184、US 5.300,545、WO-A-02/00599和WO-A-02/00600描述了用阳离子洗涤剂等稳定剂能非常好地定性检测核酸，但只适用于含有单细胞或只含有单层细胞的样品。然而，为稳定致密组织片中的核酸，这种稳定剂不够格。
此外，为定性检测的目的而用于稳定核酸的那些试剂和方法不适用于同时稳定蛋白质。另外，以此方式稳定的样品不可用于组织学研究，因为稳定剂保存的是(例如)核酸，而不是细胞或组织结构。
包含(例如)高浓度硫酸铵的其它稳定剂(参见，例如US 6,204,375)非常适用于稳定不同组织中的核酸。然而，它们对于稳定含细胞或不含细胞的体液，例如血液、血清或血浆很不适用，它们在某些类型的组织，例如脂肪组织中的特性也不佳。
上文均表明特别难于同时稳定组织样品中的RNA、DNA和蛋白质为组织学研究保存组织样品。此外，对细胞或生物学样品的(稳定)操作不一定能应用于致密组织。与其它生物学样品相比，稳定致密组织样品中的核酸特别困难。这种组织由数层构成，并且其组成、成分和结构不均匀。为稳定致密组织样品中的核酸，稳定剂不仅必须作用于细胞表面或一层细胞，还应深入多层样品组织中。此外，在一份和同一生物学样品中，人们往往要应对类型极为不同的组织和/或细胞，它们在例如细胞结构、膜构造、区室构造和诸如蛋白质、碳水化合物和/或脂肪含量等生物分子上有所不同。
本领域已知且频繁使用的稳定组织样品(包括所有成分)的一种方法是冷冻或深冻样品。在该方法中，样品取出后立即用低于-80℃的液氮将其以天然环境冷冻。如此处理的样品实际上可无限期地保存在约-70℃，其完整性不会发生任何变化。然而，所有这些方法需要非常复杂的后勤要求，因为在运输、保存期间或者各种目的和应用期间必须防止样品解冻。此外，特制的样品容器和永久冷却样品增加了费用，应用液氮不仅非常复杂，而且要特别小心地操作。
另外，随后对冷冻样品材料，特别是样品各组分的分析是极难的尝试。例如，保存、运输或加工期间样品的解冻或初期解冻(incipient defrosting)导致(特别是)RNA降解。这表示经历解冻或初期解冻的样品不再获得可重现的结果。此外，冷冻状态的片状组织肯定难以加工，例如难以手工分开或只能借助复杂的技术设备。
为减少加工冷冻样品，特别是分离RNA的不利之处，现已描述了称为过渡溶液(transition solution)的溶液。在该方法中，首先将冷冻组织转移入预冷至-70℃至-80℃的溶液中，在该溶液中于约-20℃保存几小时(至少16小时)。然后将浸渍了过渡溶液的样品短时(例如短于使样品分开所需的时间)加温至-4℃到室温的操作温度，样品中的核酸状态不会发生改变。然而，不可能进一步分析和保存样品，特别是在室温下。例如从WO-A-2004/72270处知晓这种过渡溶液主要由一元醇构成。
用惯常过渡溶液处理样品的不足之处在于，在室温下样品只能保持稳定很短的时间，这表示加工时间极其有限，特别是在加工许多样品时很可能超时，特别是包括切割和切碎过程时。此外，过渡(过程)非常缓慢，从而不能直接进行实验，在大多数情况中要等一天。同样，不能在室温下运输如此处理的样品而不损坏样品，因为，不仅过渡应在≤-20℃的温度下进行，而且随后必须稳定地保存样品。样品的运输也只能在≤-20℃进行，故要求在运输期间应采用冷却手段，例如干冰。此外，还必须考虑WO-A-2004/72270中所用的一元醇，例如甲醇、乙醇或异丙醇易燃、有挥发性或有毒，因此，必须有某些安全措施以备不时之需。
虽然利用传统的过渡溶液改善了样品加工，例如切碎或切割成所需尺寸，但它们既未能减少设备需求(因为过渡溶液必须预冷到-70至-80℃，因而需要合适的冷却装置)，也未能使过渡溶液处理的样品在室温下稳定较长时间。
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处。
具体地说，本发明的目的是提供稳定生物学样品的方法，所述方法利用含量尽可能低(如果有的话)的易燃、挥发性、致癌性、致畸性、环境有害或毒性物质来获得满意的生物学样品稳定作用。
此外，本发明的目的是提供稳定生物学样品的方法，借助所述方法可以使冷冻和新鲜的生物学样品在中温，例如室温下尽可能稳定，而不会对该生物学样品的表达模式或蛋白质组构成产生不利影响。
此外，稳定生物学样品的方法应能对稳定的生物学样品进行组织学分析并对该生物学样品中的生物分子进行分析。在本文中，稳定方法应对(尤其是)稳定的生物学样品中的蛋白质和核酸均能进行定性和定量分析。此外，对生物学样品进行稳定操作对核酸和蛋白质的质量应无不良影响(或者如果有只是轻微地影响)，因而可通过凝胶分析或进行多轮PCR直至获得一定量核酸来测定核酸的质量，可通过合适的活性试验测定蛋白质，例如酶的质量。
此外，稳定生物学样品的方法应获得稳定的生物学样品，该样品不仅能在中温，例如室温下分析，如果合适的话还能在这种分析前后在这种中温下保存尽可能长的时间。
在生物分子的情况中，术语“稳定”应理解为表示抑制生物分子活性的降解、修饰、诱导或改变。在生物学样品的组织学分析的情况中，术语“稳定”宜理解成表示防止样品形态的实质性改变。
此外，本发明的目的在于提供某种装置，借助该装置并采用本发明的稳定方法可以简单的方式稳定生物学样品。
有助于实现上述目的的方法是处理生物学样品的方法，包括以下方法步骤：
i)提供生物学样品，和
ii)使该生物学样品与包含以下组分的组合物接触：
(α1)至少一种多元醇，其含量以重量计为1％到最多100％，特别优选以重量计至少5％，更优选以重量计至少10％，甚至更优选以重量计至少25％，特别优选以重量计至少35％，最优选以重量计至少50％，例如以重量计至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，和
(α2)至少一种添加剂醇，其含量以重量计为0到99％，优选以重量计至少0-95％，特别优选以重量计0.1-50％，甚至更优选以重量计0.5-25％，更优选以重量计1-15％，最优选以重量计2.5-10％，例如以重量计最多0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95或99％，
其中以重量计组分(α1)和(α2)的总量为100％
出乎意料的是，发现采用借助含多元醇的组合物可以稳定新鲜分离的生物学样品，并且可以制备冷冻的生物学样品，例如在液氮中冷冻的生物学样品以供组织学或分子生物学分析。此时无需将与组合物接触的生物学样品冷却至0℃以下并在如此低温下保存和分析该样品，因而无需使用复杂的设备即可实施本发明方法，特别是无需使用冷却设备或冷却装置。
方法步骤i)中提供的生物学样品可采取冷冻或非冷冻生物学样品的形式，其中所用的生物学样品可以是技术人员已知的任何生物学样品。优选的生物学样品选自：生物分子，例如天然分子，优选分离的线形、分支或环形核酸，如RNA，特别是mRNA、siRNA、miRNA、snRNA、tRNA、hnRNA或核酶、DNA等，合成的或修饰的核酸，例如寡核苷酸，如PCR所用的引物、探针或标准品，洋地黄毒苷-、生物素-或荧光-标记的核酸，或称为PNA(“肽核酸”)的天然(优选分离的)蛋白质或寡肽，合成或修饰的蛋白质或寡肽，例如偶联有荧光标记或酶的抗体，或激素，生长因子，脂质，寡糖，多糖，碳水化合物，蛋白葡聚糖(proteoglucan)，体液，例如血液、精液、脑脊液、唾液、痰或尿，加工血液所得的液体，例如血清或血浆，白细胞组分或“血沉棕黄层”，水蛭唾液(leech saliva)，粪便，污迹(smears)，自来水(tap fluid)，头皮屑，毛发，皮肤碎片，法医学样品，含有游离或结合的生物分子，特别是游离或结合的核酸的食品或环境样品，或代谢产物和代谢物，完整的生物，优选完整的非存活生物，组织或多细胞生物，优选来自昆虫和哺乳动物，特别是人，例如组织切片的形式，组织片段或器官，分离的细胞，例如贴壁依赖性或悬浮细胞培养液，细胞器，例如叶绿体或线粒体，囊泡、核或染色体，植物，植物各部分，植物组织或植物细胞，细菌，病毒，类病毒，朊病毒，酵母菌和真菌或真菌的各部分。
本发明方法中方法步骤i)所用的非冷冻生物学样品优选新鲜制备的生物学样品，例如活的或死生物体的新鲜组织样品或新鲜分离的血细胞，或者在合成生物分子作为生物学样品的情况中，非冷冻生物学样品是新鲜合成的核酸或蛋白质。按照本发明，“新鲜”的生物学样品在本文中宜理解成表示样品的获取时间与接触步骤ii)的组合物相距不到96小时，优选不到48小时，特别优选不到24小时，更优选不到10小时，尤其优选不到60分钟，最优选不到10分钟，或者在合成生物分子的情况中，其合成的时间与接触步骤ii)的组合物相距不到96小时，优选不到48小时，特别优选不到24小时，更优选不到10小时，尤其优选不到60分钟，最优选不到10分钟。然而，术语“新鲜”的生物学样品还包括在以上时间段内获取但在与所述组合物接触前还用，例如常规固定剂(如甲醛水溶液)、染料(如曙红)、抗体等作预处理的那些样品。对于该目的，在本文中可通过技术人员已知的所有制备方法制备新鲜细胞或组织样品，以组织样品为例，可用外科手术刀，例如在手术期间或死后，以血细胞样品为例，可通过离心新鲜获取的血液，等等制备样品。当利用新鲜的生物学样品时，方法步骤ii)中所用的组合物主要用作稳定组合物。
本发明方法的方法步骤i)中所用的冷冻生物学样品优选以下生物学样品：用上述方式分离后首先冷却至0℃或更低的温度，优选-20℃或更低的温度，最优选-70℃或更低的温度，例如通过与液氮接触，然后再与方法步骤ii)中的组合物接触。如果本发明方法利用以此方式冷冻的生物学样品，方法步骤ii)中所用的组合物主要用作过渡组合物(transition composition)。
组合物中所含的多元醇(α1)优选为二醇、三醇、四醇、五醇、六醇、七醇、八醇或九醇的形式，特别优选二醇、三醇、四醇、五醇或六醇，更优选二醇和三醇，最优选三醇。
此外，根据本发明，多元醇(α1)优选具有2-20个碳，因此可以是C2-多元醇、C3-多元醇、C4-多元醇、C5-多元醇、C6-多元醇、C7-多元醇、C8-多元醇、C9-多元醇、C10-多元醇、C11-多元醇、C12-多元醇、C13-多元醇、C14-多元醇、C15-多元醇、C16-多元醇、C17-多元醇、C18-多元醇、C19-多元醇或C20-多元醇。然而，特别优选具有2-12个碳原子的多元醇，即C2-多元醇、C3-多元醇、C4-多元醇、C5-多元醇、C6-多元醇、C7-多元醇、C8-多元醇、C9-多元醇、C10-多元醇、C11-多元醇或C12-多元醇；最优选具有2-6个碳原子的多元醇，即C2-多元醇、C3-多元醇、C4-多元醇、C5-多元醇、C6-多元醇。
原则上，所述多元醇可以是直链、支链或环形。以线形或支链多元醇为例，特别优选该分子的最长烃链末端之一连接有OH基团的多元醇。
根据本发明方法所用组合物的特别优选实施方式，所述组合物包含熔点高于0℃，特别优选高于5℃，更优选高于10℃，尤其优选高于15℃，最优选高于20℃的多元醇(α1)，所述熔点优选用林德斯特罗姆熔点仪(Lindstroemmelting-point apparatus)在毛细管中测定。
特别适用于本发明的多元醇选自(但不限于)：1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、2-甲基-1，3-丙二醇、2-甲基-1，2-丙二醇、2，2-二甲基-1，3-丙二醇、2，2-二乙基-1，3-丙二醇、2-甲基-2-丙基-1，3-丙二醇、2-丁基-2-乙基-1，3-丙二醇、二羟基丙酮、2，2-二丁基-1，3-丙二醇、3-甲氧基-1，3-丙二醇、3-甲氧基-1，2-丙二醇、3-甲氧基-2，3-丙二醇、2-甲氧基甲基-1，3-丙二醇、3-乙氧基-1，3-丙二醇、3-乙氧基-1，2-丙二醇、3-乙氧基-2，3-丙二醇、3-烯丙氧基-1，2-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、1，4-丁二醇、2，3-丁二醇、2，3-二甲基-2，3-丁二醇、3，3-二甲基-1，2-丁二醇、1，2-戊二醇、1，3-戊二醇、1，4-戊二醇、1，5-戊二醇、2，3-戊二醇、2，4-戊二醇、2-甲基-2，4-戊二醇、2，4-二甲基-2，4-戊二醇、2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇、1，2-己二醇、1，3-己二醇、1，4-己二醇、1，5-己二醇、1，6-己二醇、2，3-己二醇、2，4-己二醇、2，5-己二醇、3，4-己二醇、2，5-二甲基-2，5-己二醇、2-乙基-1，3-己二醇、1，2-庚二醇、1，3-庚二醇、1，4-庚二醇、1，5-庚二醇、1，6-庚二醇、1，7-庚二醇、1，8-辛二醇、1，2-辛二醇、1，3-辛二醇，1，4-辛二醇、1，5-辛二醇、1，6-辛二醇、1，7-辛二醇、1，2-壬二醇、1，9-壬二醇、1，10-癸二醇、1，2-癸二醇、1，2-十一烷二醇(undecanediol)、1，11-十一烷二醇、1，12-十二烷二醇(dodecanediol)、1，2-十二烷二醇、二甘醇、双丙甘醇、三乙二醇、三丙二醇、四乙二醇、四丙二醇、五乙二醇、五丙二醇、六乙二醇、六丙二醇、七乙二醇、七丙二醇、八乙二醇、八丙二醇、九乙二醇、九丙二醇、十乙二醇、十丙二醇、顺-或反-1，2-环戊二醇、顺或反-1，3-环戊二醇、顺或反-1，2-环己二醇、顺或反-1，3-环己二醇、顺或反-1，4-环己二醇、顺或反-1，2-环庚二醇、顺或反-1，3-环庚二醇、顺或反-1，4-环庚二醇、1，2，3-环戊三醇、1，2，4-环戊三醇、1，2，3-环己三醇、1，2，4-环己三醇、1，2，3-环庚三醇、1，2，4-环庚三醇、1，2，3-丙三醇、3-乙基-2-羟甲基-1，3-丙二醇、2-羟甲基-2-甲基-1，3-丙二醇、2-羟甲基-2-甲基-1，3-丙二醇、1，2，3-丁三醇、1，2，4-丁三醇、2-甲基-1，2，3-丁三醇、2-甲基-1，2，4-丁三醇、1，2，3-戊三醇、1，2，4-戊三醇、1，2，5-戊三醇、2，3，4-戊三醇、1，3，5-戊三醇、3-甲基-1，3，5-戊三醇、1，2，3-己三醇、1，2，4-己三醇、1，2，5-己三醇、1，2，6-己三醇、2，3，4-己三醇、2，3，5-己三醇、1，2，3-庚三醇、1，2，7-庚三醇、1，2，3-辛三醇、1，2，8-辛三醇、1，2，3-壬三醇、1，2，9-壬三醇、1，2，3-癸三醇、1，2，10-癸三醇、1，2，3-十一烷三醇、1，2，11-十一烷三醇、1，2，3-十二烷三醇、1，1，12-十二烷三醇、2，2，-双-(羟甲基)-1，3-丙二醇、1，2，3，4-丁四醇、1，2，3，4-戊四醇、1，2，3，5-戊四醇、1，2，3，4-己四醇、1，2，3，6-己四醇、1，2，3，4-庚四醇、1，2，3，7-庚四醇、1，2，3，4-辛四醇、1，2，3，8-辛四醇、1，2，3，4-壬四醇、1，2，3，9-壬四醇、1，2，3，4-癸四醇、1，2，3，10-癸四醇、三羟甲基丙醇、季戊四醇、糖醇(例如甘露醇、山梨糖醇或阿拉伯糖醇)、己六醇(hexanehexol)、1，2，3，4，5-戊五醇和1，2，3，4，5，6-己六醇。
在本发明的组合物中，所述多元醇可以单独存在或以两种、三种、四种或五种不同多元醇的混合物形式存在，特别优选两种不同二醇的混合物、两种不同三醇的混合物、两种不同四醇的混合物、一种二醇和一种三醇的混合物、一种二醇和一种四醇的混合物以及一种三醇和一种四醇的混合物，最优选两种不同三醇的混合物作为多元醇混合物。
该组合物中任选存在的添加剂(α2)为除多元醇以外的其它溶剂或添加剂的形式，所述其它溶剂或添加剂选自：洗涤剂，抑制核酸或蛋白质降解的抑制剂，如蛋白酶抑制剂PMSF或可商品化购得的产品美国圣奥斯汀市安拜恩公司的抗-RNA酶(ANTI-Rnase，Ambion，St.Austin，USA)、
(安拜恩公司)或DEPC，烷化剂，乙酰化剂，卤化剂，核苷酸，核苷酸类似物，氨基酸，氨基酸类似物，粘度调节剂，着色剂，特别是专门染色某些细胞结构的着色剂，缓冲化合物，例如HEPES、MOPS或TRIS，防腐剂，络合剂，如EDTA或EGTA，还原剂，如2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、喋呤、硫化氢、抗坏血酸、NADPH、三羧基乙膦(tricarboxyethylphosphine)(TCEP)和六甲基磷酰三胺(phosphoric triamide)(Me2N)3P，氧化剂，如5，5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，提高细胞通透性的物质，如DMSO或DOPE，离液物质，如异硫氰酸胍或盐酸胍，固定剂，如甲醛或戊二醛(glutardialdehyde)，交联添加剂，如低聚甲醛，和这些添加剂中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或至少六种的混合物。
除多元醇以外的溶剂可以为水，或者除多元醇以外的有机溶剂形式，所述有机溶剂优选：一元醇、酮、二甲基亚砜、芳族烃、卤化的烃、醚、羧酸、羧酰胺、腈、硝基烷和酯，其中合适的溶剂可以选自：甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、乙腈、丙酮、茴香醚、苄腈、1-甲氧基-2-丙醇、喹啉、环己酮、甘油二乙酸酯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、甲醚、甲苯、二甲酮、二乙酮、己二酸二甲酯、碳酸二甲酯、亚硫酸二甲酯、二噁烷、二甲基亚砜、乙酸甲酯、乙酸乙酯、苯甲酸、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、乙基苯(ethylbenzene)、甲酰胺、甘油三乙酸酯、乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸甲酯、N，N-二乙基乙酰胺、N-甲基-N-乙基乙酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基-N-乙基甲酰胺、N，N-二乙基甲酰胺、N，N-二甲基硫代甲酰胺、N，N-二乙基硫代甲酰胺、N-甲基-N-乙基硫代甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基-N-乙基乙酰胺、N，N-二乙基乙酰胺、硝基乙烷、硝基甲基甲苯(nitromethyltoluene)和磷酸三乙酯。
优选将组分(α1)和(α2)简单混合来制备这两种组分的组合物。如果多元醇(α1)的熔点高于室温，优选先将该多元醇加热至熔点，再将其与添加剂混合。然而，如果制备组合物时组分(α1)或(α2)之一是固体形式而另一种是液体形式，也可将固体组分溶于液体组分中。因此，例如可将固体多元醇溶于液体添加剂中，或可将固体添加剂溶于液体多元醇中。
适用于本发明的组合物是，例如具有以下组成的组合物(除非另有表述，所有的百分比是体积比。此外，除非另有表述，各组分的所有体积百分比相当于市售可得的最高浓度之一的相应化合物量)：5％N，N-二甲基乙酰胺+10％甲醇+20％丙酮+25％DMSO+40％二甘醇，25％1，2-丙二醇+75％丙酮，25％1，2-丙二醇+75％二甘醇，25％1，2-丙二醇+75％DMSO，25％1，2-丙二醇+75％乙醇，25％1，2-丙二醇+75％乙二醇，25％1，3-丙二醇+75％1，2-丙二醇，25％1，3-丙二醇+75％丙酮，25％1，3-丙二醇+75％二甘醇，25％1，3-丙二醇+75％DMSO，25％1，3-丙二醇+75％乙醇，25％1，3-丙二醇+75％乙二醇，25％丙酮+75％甲醇，25％二甘醇+75％丙酮，25％二甘醇+75％DMSO，25％二甘醇+75％乙醇，25％二甘醇+75％甲醇，25％二甘醇+75％N，N-二甲基乙酰胺，25％二羟基丙酮+75％1，2-丙二醇，25％二羟基丙酮+75％1，3-丙二醇，25％二羟基丙酮+75％二甘醇，25％二羟基丙酮+75％乙二醇，25％二羟基丙酮+75％三乙二醇，25％乙二醇+75％二甘醇，25％乙二醇+75％DMSO，25％乙二醇+75％乙醇，25％1，2，3-丙三醇+75％1，2-丙二醇，25％1，2，3-丙三醇+75％1，3-丙二醇，25％1，2，3-丙三醇+75％二甘醇，25％1，2，3-丙三醇+75％二羟基丙酮，25％1，2，3-丙三醇+75％DMSO，25％1，2，3-丙三醇+75％乙二醇，25％1，2，3-丙三醇+75％N，N-二乙基乙酰胺，25％1，2，3-丙三醇+75％三乙二醇，25％N，N-二乙基乙酰胺+75％1，3-丙二醇，25％N，N-二乙基乙酰胺+75％1，2-丙二醇，25％N，N-二乙基乙酰胺+75％二甘醇，25％N，N-二乙基乙酰胺+75％乙二醇，25％N，N-二乙基乙酰胺+75％三乙二醇，25％三乙二醇+75％1，2-丙二醇，25％三乙二醇+75％1，3-丙二醇，25％三乙二醇+75％丙酮，25％三乙二醇+75％二甘醇，25％三乙二醇+75％DMSO，25％三乙二醇+75％乙醇，25％三乙二醇+75％乙二醇，50％N，N-二乙基乙酰胺+50％1，3-丙二醇，50％1，2-丙二醇+50％丙酮，50％1，2-丙二醇+50％二甘醇，50％1，2-丙二醇+50％DMSO，50％1，2-丙二醇+50％乙醇，50％1，2-丙二醇+50％乙二醇，50％1，3-丙二醇+50％1，2-丙二醇，50％1，3-丙二醇+50％丙酮，50％1，3-丙二醇+50％二甘醇，50％1，3-丙二醇+50％DMSO，50％1，3-丙二醇+50％乙醇，50％1，3-丙二醇+50％乙二醇，50％二甘醇+50％丙酮，50％二甘醇+50％DMSO，50％二甘醇+50％甲醇，50％二甘醇+50％N，N-二甲基乙酰胺，50％二羟基丙酮+50％1，2-丙二醇，50％二羟基丙酮+50％1，3-丙二醇，50％二羟基丙酮+50％二甘醇，50％二羟基丙酮+50％乙醇，50％二羟基丙酮+50％乙二醇，50％二羟基丙酮+50％三乙二醇，50％乙二醇+50％丙酮，50％乙二醇+50％二甘醇，50％乙二醇+50％DMSO，50％乙二醇+50％乙醇，50％1，2，3-丙三醇+50％1，2-丙二醇，50％1，2，3-丙三醇+50％1，3-丙二醇，50％1，2，3-丙三醇+50％二甘醇，50％1，2，3-丙三醇+50％二羟基丙酮，50％1，2，3-丙三醇+50％DMSO，50％1，2，3-丙三醇+50％乙二醇，50％1，2，3-丙三醇+50％N，N-二乙基乙酰胺，50％1，2，3-丙三醇+50％三乙二醇，50％N，N-二乙基乙酰胺+50％1，2-丙二醇，50％N，N-二乙基乙酰胺+50％二甘醇，50％N，N-二乙基乙酰胺+50％乙二醇，50％N，N-二乙基乙酰胺+50％三乙二醇，50％三乙二醇+50％1，2-丙二醇，50％三乙二醇+50％1，3-丙二醇，50％三乙二醇+50％丙酮，50％三乙二醇+50％二甘醇，50％三乙二醇+50％DMSO，50％三乙二醇+50％乙醇，50％三乙二醇+50％乙二醇，75％1，2-丙二醇+25％丙酮，75％1，2-丙二醇+25％二甘醇，75％1，2-丙二醇+25％DMSO，75％1，2-丙二醇+25％乙醇，75％1，2-丙二醇+25％乙二醇，75％1，3-丙二醇+25％1，2-丙二醇，75％1，3-丙二醇+25％丙酮，75％1，3-丙二醇+25％二甘醇，75％1，3-丙二醇+25％DMSO，75％1，3-丙二醇+25％乙醇，75％1，3-丙二醇+25％乙二醇，75％二甘醇+25％丙酮，75％二甘醇+25％DMSO，75％二甘醇+25％甲醇，75％二甘醇+25％N，N-二甲基乙酰胺，75％二羟基丙酮+25％乙醇，75％二羟基丙酮+25％1，2-丙二醇，75％二羟基丙酮+25％1，3-丙二醇，75％二羟基丙酮+25％二甘醇，75％二羟基丙酮+25％乙二醇，75％二羟基丙酮+25％三乙二醇，75％乙二醇+25％丙酮，75％乙二醇+25％二甘醇，75％乙二醇+25％DMSO，75％1，2，3-丙三醇+25％1，2-丙二醇，75％1，2，3-丙三醇+25％1，3-丙二醇，75％1，2，3-丙三醇+25％二甘醇，75％1，2，3-丙三醇+25％二羟基丙酮，75％1，2，3-丙三醇+25％DMSO，75％1，2，3-丙三醇+25％乙醇，75％1，2，3-丙三醇+25％乙二醇，75％1，2，3-丙三醇+25％N，N-二乙基乙酰胺，75％1，2，3-丙三醇+25％三乙二醇，75％N，N-二乙基乙酰胺+25％1，3-丙二醇，75％N，N-二乙基乙酰胺+25％1，2-丙二醇，75％N，N-二乙基乙酰胺+25％二甘醇，75％N，N-二乙基乙酰胺+25％乙二醇，75％N，N-二乙基乙酰胺+25％三乙二醇，75％三乙二醇+25％1，2-丙二醇，75％三乙二醇+25％1，3-丙二醇，75％三乙二醇+25％丙酮，75％三乙二醇+25％二甘醇，75％三乙二醇+25％DMSO，75％三乙二醇+25％乙醇，75％三乙二醇+25％乙二醇，90％1，3-丙二醇+10％甲醇，90％二羟基丙酮+10％甲醇，90％乙二醇+10％甲醇，90％1，2，3-丙三醇+10％甲醇，90％三乙二醇+10％甲醇，95％1，2-丙二醇+5％N，N-二甲基乙酰胺，95％1，3-丙二醇+5％N，N-二甲基乙酰胺，95％乙二醇+5％N，N-二甲基乙酰胺，95％1，2，3-丙三醇+5％N，N-二甲基乙酰胺，95％三乙二醇+5％N，N-二甲基乙酰胺，以重量计≥96％的1，2，6-己三醇，以重量计≥99.5％的1，2，3-丙三醇，以重量计≥80％的3-甲基-1，3，5-戊三醇，以重量计≥90％的1，2，4-丁三醇，75％1，2，3-丙三醇+25％1，2，6-己三醇(96％，以重量强度计(by weightstrength))，50％1，2，3-丙三醇+50％1，2，6-己三醇(96％，以重量强度计)，25％1，2，3-丙三醇+75％1，2，6-己三醇(96％，以重量强度计)，75％1，2，3-丙三醇+25％3-甲基-1，3，5-戊三醇(80％，以重量强度计)，50％1，2，3-丙三醇+50％3-甲基-1，3，5-戊三醇(80％，以重量强度计)，25％1，2，3-丙三醇+75％3-甲基-1，3，5-戊三醇(80％，以重量强度计)，75％1，2，6-己三醇(96％，以重量强度计)+25％3-甲基-1，3，5-戊三醇(80％，以重量强度计)，50％1，2，6-己三醇(96％，以重量强度计)+50％3-甲基-1，3，5-戊三醇(80％，以重量强度计)，25％1，2，6-己三醇(96％，以重量强度计)+75％3-甲基-1，3，5-戊三醇(80％，以重量强度计)，4.72M 1，2，3，4，5，6-己六醇和1，2，3，4，5-戊五醇(饱和水溶液)。
优选将生物学样品浸泡在组合物中以实现生物学样品与组合物的接触，接触操作时该组合物优选为液体形式，从而能使整个样品浸泡在此组合物中。如果所用的生物学样品是流体或分离的细胞或者例如颗粒状样品，可混合生物学样品与此组合物或将生物学样品悬浮在此组合物中实现接触。或者，可将在所选择温度下是固体的组合物直接溶于液体生物学样品(例如，血液、血浆、尿液或唾液)中。
还优选在与生物学样品的接触操作期间此组合物是流体，优选液体形式，其中20℃测定的此组合物粘度通常为1-1000000mPa，优选1-100000mPa，特别优选1-10000mPa。然而，此组合物也可以是固体，从而可与液体生物学样品接触。
根据本发明方法的具体实施方式，生物学样品与此组合物的接触优选在以下温度范围内进行：-80℃至+80℃，优选0℃至+80℃，甚至更优选2、3、4、5、6、7或8℃至+80℃，更优选18℃至+80℃，例如至少-20℃、-19℃、-18℃、-17℃、-16℃、-15℃、-14℃、-13℃、-12℃、-11℃、-10℃、-9℃、-8℃、-7℃、-6℃、-5℃、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃、0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、室温、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃。
述及“生物学样品与此组合物接触”在“-80℃至+80℃的温度范围内”或在上述其它温度之一进行，表示生物学样品与此组合物接触后获得的混合物温度在上述温度(范围)以内。因此，生物学材料的形式可以是在低于-20℃冷冻的样品，例如保存于液氮中的样品，此时利用一定量的组合物，或具有某种温度的组合物可以使冷冻生物学样品与该组合物接触后所得混合物的温度(因此也是生物学样品的温度)处于上述温度范围内。
根据本发明方法的具体实施方式，在方法步骤ii)中与此组合物接触后(优选在上述温度条件下)，还优选在方法步骤ii)后的方法步骤iii)中将生物学样品再保存在以下温度范围内：-80℃至+80℃，优选0℃至+80℃，甚至更优选2、3、4、5、6、7或8℃最高到+80℃，更优选18℃至+80℃，例如至少-20℃、-19℃、-18℃、-17℃、-16℃、-15℃、-14℃、-13℃、-12℃、-11℃、-10℃、-9℃、-8℃、-7℃、-6℃、-5℃、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃、0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、室温、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃，其中这种保存可进行至少一天，优选至少2天，更优选至少3天，任选至少1周、至少2周、至少1个月、至少3个月、至少6个月或至少12个月。
本发明方法可将经处理的生物学样品保存在室温下、冷藏温度下或甚至更高的温度下，而不会发生生物学样品中的生物分子，例如核酸或蛋白质明显降解。这明显优于传统的稳定方法，因为无需使用液氮或冷却装置即可实施该方法，而稳定样品的保存也无需使用液氮或冷却装置。
按照本发明处理后，如果合适，还可在可能的保存步骤iii)前或后将经处理的生物学样品包埋在合适的包埋物质，例如石蜡等中，随后可通过简单的方式从该生物学样品制备适于组织学研究的组织切片。
根据本发明方法的具体实施方式，还优选在方法步骤i)和ii)后实施方法步骤
iv)组织学分析与此组合物接触的生物学样品，或者分析与此组合物接触的生物学样品中的生物分子，
如果合适，还可在上述方法步骤iii)保存之前或之后实施该方法步骤iv)。
组织学研究宜理解成适于分析组织、组织切片、细胞的形态或亚细胞结构的任何研究方法，例如借助显微镜，如果合适可采用技术人员已知的染色或标记技术。
可以分析的合适生物分子是技术人员已知的所有生物分子，特别是天然、修饰或合成的核酸，天然、修饰或合成的蛋白质或寡肽，激素，生长因子，代谢物，脂质，寡糖或蛋白葡聚糖。合适的核酸是技术人员已知的所有核酸，特别是核糖核酸(RNA)，例如mRNA、siRNA、miRNA、snRNA、t-RNA、hnRNA或核酶，或脱氧核糖核酸(DNA)。原则上，它们可以是任何类型的多核苷酸，即嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷或C-糖苷。所述核酸可以是单链、双链或多链、线形、分支或环形的。它可对应于细胞中产生的分子，例如DNA或信使RNA(mRNA)或者可在体外产生，例如互补DNA(cDNA)、反义RNA(aRNA)或合成的核酸。所述核酸可由少许亚单位，至少两个亚单位，优选8个或更多个亚单位构成，例如寡核苷酸，可由几百个亚单位到最多几千个亚单位构成，例如某些表达载体，或更多个亚单位构成，例如基因组DNA。所述核酸优选包含与调控序列功能相连的某多肽的编码信息，从而能在引入了或天然存在该核酸的细胞中表达该多肽。因此，所述核酸的优选实施方式是表达载体。在另一实施方式中，所述核酸是pDNA(质粒DNA)、siRNA、siRNA双链体(duplices)或siRNA异质双链体(heteroduplices)，其中术语“siRNA”应理解成表示用“切酶”切割双链RNA(dsRNA)而产生并引入此酶复合体“RISC”(RNA-诱导的沉默复合体)中长度约22个核苷酸的核糖核酸。
在本文中，述及“分析与组合物接触的生物学样品中的生物分子”表示该项分析可在原位和离体进行，即，例如从生物学样品分离生物分子后。如果为分析目的而分离生物学样品的生物分子，优选(特别是在细胞、组织或其它复杂或致密样品的情况中)首先匀浆样品，可采用机械装置，例如借助套管、研钵、转子-定子匀浆器、球磨机等，或采用化学方法，例如使用通常含洗涤剂和/或离液物质的合适裂解缓冲液，或通过酶解方法，例如使用蛋白酶，或联用这些手段匀浆样品。
为组织学分析生物学样品或分析该生物学样品中的生物分子，可采用技术人员已知并认为适合的所有分析方法，优选以下方法：光学显微术、电子显微术、共聚焦激光扫描显微术、激光显微切割、扫描电子显微术、蛋白质印迹、Sourthem印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀、亲和层析、突变分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(特别是二维PAGE)、HPLC、聚合酶链式反应(PCR)、RFLP分析(限制性片段长度多态性分析)、SAGE分析(基因表达系列分析)、FPLC分析(快速蛋白质液相层析)、质谱法(如MALDI-TOF质谱法或SELDI质谱法)、微阵列分析、液相芯片(LiquiChip)分析、酶活性分析、HLA分型、测序、WGA(全基因组扩增)、RT-PCR、实时PCR或实时RT-PCR、RNA酶保护分析或引物延伸分析。
根据本发明方法的具体实施方式，方法步骤iv)包括组织学分析生物学样品和分析该生物学样品中的生物分子。根据本发明方法的另一具体实施方式，方法步骤iv)包括分析生物学样品中的核酸和分析生物学样品中的蛋白质。
通过本发明方法处理的生物学样品也有助于实现上述目的。
处理生物学样品的第一种装置也有助于实现上述目的，其包括以下组件：
(β1)具有至少一个端口的至少一个容器，能接收流体最多至装填高度h，
(β2)用于密封所述至少一个端口的至少一个盖子，
(β3)与至少一个所述盖子(β2)相连的至少一个浸液助器(immersionaid)，和
(β4)混合器件，其绕轴L可旋转地安装并装有导流叶片(guide vane)以混合所述至少一个容器(β1)中的流体。
如果用本发明组合物处理生物学样品，可能导致以下问题，首先是难以将样品浸入所述组合物中，第二是难以充分混合此组合物，而这对于样品浸入组合物后产生的不均匀性有利，特别是在生物学样品的本身环境中(immediateenvironment)，其原因在于组合物的粘度高，而粘度取决于组合物中存在的多元醇的类型和含量。
利用本发明的第一种装置可克服这些困难，因为浸液助器(β3)能使生物学样品浸入此组合物中，而所述混合器件(β4)能混合该组合物，因而组合物能均匀渗透入样品。
所用的容器(β1)可以是技术人员已知并且适合于该目的的任何容器形式。本发明优选的容器是US 6,602,718和US 2004/0043505 A1中披露的，例如参考号12的容器；US 2005/0160701 A1中披露的，例如参考号14的容器；US 2003/0086830 A1中披露的，例如参考号152的容器；US2003/0087423 A1中披露的，例如参考号12的容器；或WO 2005/014173 A1中披露的，例如参考号100的容器。这些出版物中关于接收生物学样品的合适容器的内容通过引用的方式纳入本文并构成本发明内容的一部分。
如果利用圆柱形容器作为容器(β1)，则容器(β1)的直径优选5-500mm，特别优选10-200mm，最优选10-30mm。
所用的盖子(β2)可以是技术人员已知并且适于该目的的任何盖子形式。本发明优选的盖子是US 6,602,718和US 2004/0043505 A1中披露的，例如参考号22的盖子；US 2005/0160701 A1中披露的，例如参考号40的盖子；US 2003/0086830 A1中披露的，例如参考号14的盖子；US 2003/0087423 A1中披露的，例如参考号14的盖子；或WO 2005/014173 A1中披露的，参考号22的盖子。这些出版物中关于密封用于接收生物学样品的容器的合适盖子的内容也通过引用的方式纳入本文并构成本发明内容的一部分。
根据本发明第一种装置的具体实施方式，装填高度h是容器(β1)总高度H的20-99％，特别优选40-90％，最优选50-80％。
除了容器(β1)和盖子(β2)，本发明的第一种装置还包括浸液助器(β3)。
原则上，该浸液助器(β3)可以是适于将样品完全浸入液体中的任何器件形式，当盖子(β2)关闭时，样品例如处在容器(β1)中液体的表面，或者如果浸液助器(β3)装有生物学样品接收器，样品位于该浸液助器(β3)内或其上。
在最简单的情况中，该浸液助器(β3)可以是柱塞形式，其横截面大致对应于容器(β1)的横截面。此处，优选浸液助器(β3)的至少一部分中有开口，关闭盖子(β3)后容器(β1)中的液体可经这些开口溢出，从而关闭盖子不会压迫流体。因此，浸液助器(β3)的至少一部分优选由网格样或筛孔样材料制成。在浸液助器(β3)没有允许液体溢出的开口的情况中，可在浸液助器(β3)之下应用作为浸液助器(β3)和样品之间间隔的突出物，从而使得液体和样品完全接触，但在这种情况中，浸液助器(β3)的横截面应小于容器(β1)的横截面，以避免浸液助器(β3)浸入时压迫流体。
除了简单的柱塞，还可将浸液助器(β3)设计成样品支持器(sampleholder)。例如US 2003/0087423中描述了这种浸液助器，如参考号为152的样品支持器。US 2003/0087423关于样品支持器的结构和性质的内容通过引用的方式纳入本文并构成本发明内容的一部分。具体地说，样品支持器可装有将生物学样品引入其内部的端口，引入样品后可密封该端口。其侧板或底板也优选至少部分由网格样或筛孔样材料制成，在关闭盖子(β2)时容器(β1)中的流体可与样品支持器中的样品接触。此外，还可将此样品支持器设计成简单的夹具，例如能夹住生物学样品的夹具，所述夹具固定在盖子(β2)上从而在关闭盖子(β2)时能使夹住的样品浸入流体中。
本发明优选浸液助器(β3)穿透容器(β1)最高至高度h’，在容器(β1)处于密封状态时，该高度不超过装填高度h，但特别优选不超过80％，甚至更优选不超过装填高度h的50％。
此外，本发明的第一种装置装有混合器件(β4)，其绕轴L可旋转地安装并装有导流叶片以混合所述至少一个容器(β1)中的流体。与容器(β1)的直径相比，这些导流叶片的排列、设计及尺寸应使得当用水填充该装置达容器(β1)总高度H的90％时，以每分钟10圈的转速绕轴L匀速转动混合器件(β4)，在容器(β1)中心引入一滴(2μl)染料溶液(1升水配制的1g高锰酸钾)，室温下在1分钟后，优选60秒后，特别优选30秒后，甚至更优选15秒后，最优选10秒后该染料能明显均匀地分布在整个容器(β1)中。
在最简单的情况中，该混合器件(β4)由，例如排列在浸液助器之上、之下或其水平面的销钉构成，所述销钉的长度大致对应于容器(β1)的直径，其中心通过接头与盖子的中心相连。当盖子(β2)拧紧时，容器(β1)内销钉的运动混合了流体。
原则上，混合器件(β4)可与盖子(β2)刚性连接，优选整体连接，从而只在转动盖子(β2)时发生混合，例如容器(β1)密封时。例如，借助与混合器件(β4)相连的轮盘或借助与混合器件(β4)相连的操纵杆来驱动混合器件(β4)也可行，所述操纵杆或轮盘优选位于容器(β1)外，特别优选装在底板下或盖子(β2)之上。此时，不转动盖子(β2)也可驱动混合器件(β4)，这对于维持装置内的无菌环境特别有利。还可能利用位于容器(β)上的特制螺丝和特制盖子(β2)的适当组合，该组合的特征在于可通过螺丝将盖子拧在容器上，一旦盖子的所有螺丝被拧紧就可在容器上自由转动。例如，已知这种闭合方式已用于含毒性或腐蚀性物质的容器以保护儿童。而此时，也只在转动盖子时才驱动混合器件(β4)，但转动盖子不一定会打开容器(β1)。
根据本发明第一种装置的具体实施方式，浸液助器(β3)是混合器件(β4)的组件。此时，将混合流体的导流叶片安装在浸液助器(β3)上或构成浸液助器(β3)的一部分。
根据本发明第一种装置的特别优选的实施方式，用本发明方法的说明中所述的组合物将本发明第一种装置装填至总高度H的至少10％，优选至少20％，更优选至少30％，甚至更优选至少40％，最优选至少50％，所述组合物包含至少一种多元醇，如果合适还可包含一种或多种添加剂。
此外，根据本发明，本发明的第一种装置优选装有用针刺穿的盖子(β2)，如WO 2005/014173 A1所述，特别优选用本发明方法说明中所述的组合物填充该容器，该容器内可维持低于大气压的压力，安装在该容器中的浸液助器使其能沿高度h垂直运动甚至无需打开盖子。如此，由于容器(β1)中的压力低于大气压，作为生物学样品的一定量的流体，例如一定量的血液经盖子吸入容器(β1)中，通过浸液助器(β3)的垂直运动将该液体样品注入含有至少一种多元醇和至少一种添加剂(如果合适的话)的组合物中，然后立即用混合器件(β4)混合该液体生物学样品和该组合物。
处理生物学样品的第二种装置也有助于实现上述目的，其装有以下组件：
(β1)具有至少一个端口的至少一个容器，从而能接收流体最多至装填高度h，其横截面积为A容器，其中所述容器用本发明方法说明中所述的组合物最高填充至装填高度h，所述组合物含有至少一种多元醇，如果合适的话还含有至少一种添加剂，
(β2)用于密封所述至少一个端口的至少一个盖子，
(β5)横截面积为A物件的至少一个物件(body)，其不与容器(β1)或盖子(β2)相连，但位于容器内，A物件/A容器之比优选约0.02-0.95％，特别优选约0.1-0.9％，最优选0.2-0.5％。
述及“不与容器(β1)或盖子(β2)相连”应理解成物件(β5)可以在该容器内，特别是在组合物内自由移动。当将因为组合物的高粘度而起初维持在组合物表面的生物学样品，例如小组织片段引入本发明的第二种装置时，本发明的该装置还可通过使该装置绕轴L’倾斜使此种组分充分浸入该组合物中，如图5所示。这造成容器(β1)内的物件(β5)向横截面A容器垂直移动，沿移动物件产生的液流导致组合物混合。
特别优选的容器(β1)和盖子(β2)是在本发明第一种装置说明的最初描述的那些容器和盖子。
根据本发明第二种装置的具体实施方式，用组合物填充所述装置的装填高度h是容器(β1)的总高度H的20-99％，特别优选40-90％，最优选50-80％。
在本文中，体(β5)可以是任何形状，但优选球形或立方形，特别优选球形。此外，容器(β1)内可存在多个物件(β5)，例如两个、四个或五个，如果合适的话，最多可存在10个、20个或30个这种物件。
还优选该物件由密度超过所述组合物密度至少5％，特别优选至少10％，更优选至少20％，甚至更优选至少50％，最优选至少100％的材料制成。
根据本发明该第二种装置的特别优选实施方式，如果容器(β1)的直径优选为5-500mm，特别优选10-200mm，最优选10-30mm，物件(β5)可以是直径为1-20mm，特别优选5-10mm的钢球形式。原则上，物件(β5)还可以具有磁性，此时，物件(β5)可以是例如搅拌棒的形式。
此外，本发明的第二种装置优选装有用针刺穿的盖子(β2)，如WO2005/014173 A1所述，特别优选容器内的压力维持低于大气压。如此，由于容器(β1)中的压力低于大气压，可将作为生物学样品的一定量的流体，例如一定量的血液经盖子吸入容器(β1)中，通过移动盖子(β1)，优选使盖子(β1)绕轴L’倾斜或转动来确保生物学样品和组合物均匀混合。
在特别优选的实施方式中，本发明的第一种和第二种装置可以是无菌的，特别是容器的内部无菌。
一种试剂盒也有助于实现上述目的，其装有：
(γ1)本发明方法说明中所述的组合物，其包含至少一种多元醇，如果合适，还包含至少一种添加剂，和
(γ2)上述装置之一或技术人员认为适合于接收该组合物的另一个容器，优选可密封容器，例如Greiner试管、Falcon试管、Eppendorf容器或出版物US 6,602,718、US 2004/0043505 A1、US 2005/0160701 A1、US2003/0086830 A1、US 2003/0087423 A1或WO 2005/014173 A1中所述的容器之一。
在本文中，组合物可以早已分散在装置或容器(γ2)中，例如，本发明的第二种装置也是如此。然而，试剂盒也可装有作为另一种组件的加料器件(γ4)，其填充了所述组合物，借助该加料器件可将明确体积的组合物注入(优选无菌条件下)该装置或容器(γ2)中。这种加料器件(γ4)可以设计成，例如皂液压送器(soap dispenser)的形式。
装有以下组分的试剂盒也有助于实现上述目的：
(γ1)本发明方法说明中所述的组合物，其包含至少一种多元醇，如果合适，还包含至少一种添加剂，和
(γ3)分析生物学样品中生物分子或分析生物学样品的形态的试剂。
原则上，分析生物学样品中生物分子或分析生物学样品的形态的试剂可以是技术人员已知可用于生物学样品形态分析或分析生物学样品中生物分子的所有试剂形式。具体地说，这些试剂包括染色细胞或细胞组分的染料，任选用荧光染料或酶标记的抗体，吸附基质，例如DEAE-纤维素或二氧化硅膜，酶的底物，琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，诸如乙醇或苯酚等溶剂，缓冲水溶液，不含RNA酶的水，裂解试剂，醇溶液等。
装有以下组分的试剂盒也有助于实现上述目的：
(γ1)本发明方法说明中所述的组合物，其包含至少一种多元醇，如果合适，还包含至少一种添加剂，
(γ2)上述装置之一或技术人员认为适合于接收该组合物的另一个容器，优选可密封容器，和
(γ3)分析生物学样品中生物分子或分析生物学样品的形态的试剂。
组合物也可分散在该装置或容器(γ2)中，或者该试剂盒可装有合适的加料器件(γ4)。
使用上述装置或上述试剂盒之一来处理生物学样品，在本发明方法中使用本发明装置或使用上述试剂盒之一来处理生物学样品，使用本发明方法说明中所述含有至少一种多元醇和至少一种添加剂(如果合适的话)的组合物来处理生物学样品，特别是来稳定生物学样品也有助于实现上述目的。
治疗疾病的方法也有助于实现上述目的，所述方法包括以下方法步骤：
(σ1)通过诊断方法来诊断疾病，所述诊断方法包括采用本发明方法分析生物学样品，本发明方法包括方法步骤i)、ii)和iv)，和
(σ2)治疗性治疗所诊断的疾病。
现在，借助非限制性附图和实施例详细说明本发明。
图1显示了本发明第一种装置的一种实施方式的侧视图，其中混合器件(β4)安装在浸液助器(β3)的上方。图1a和1b显示了装有设计的不同导流叶片的两种混合器件(β4)的横截面，这些导流叶片安装在浸液助器(β3)之下。
图2显示了本发明第一种装置的另一种实施方式的侧视图，其中混合器件(β4)安装在浸液助器(β3)的下方。
图3显示了本发明第一种装置的另一种实施方式的侧视图，其中混合器件(β4)是浸液助器(β3)的一个组件。
图4显示了本发明第一种装置的另一种实施方式的侧视图，其中浸液助器(β3)包括样品接收器，其中混合器件(β4)是浸液助器(β3)的一个组件。图4a显示了与盖子相连的浸液助器(β3)的侧视图。图4b显示了设计成具有倾斜侧板作为导流叶片的浸液助器(β3)。
图5显示了本发明第二种装置的一种实施方式的侧视图。图5a显示了其中装有物件(β5)的装置的顶视图。
图6显示了实施例4所得SDS聚丙烯酰胺凝胶和实施例4所得蛋白质印迹。
图7以直方图的形式显示了实施例5所得酶活性分析的结果。
图8、8a和8b显示了对实施例6所得RNA样品在高温保存后形成的琼脂糖-甲醛-MOPS凝胶的分析结果。
图8c显示了对实施例2a所得RNA形成的琼脂糖-甲醛-MOPS凝胶的分析结果。
图9显示了对实施例7所得RNA样品用五元醇或六元醇稳定后形成的琼脂糖-甲醛-MOPS凝胶的分析结果。
图9a和9b显示了对实施例2b所得RNA形成的琼脂糖-甲醛-MOPS凝胶的分析结果。
图9c和9d显示了对实施例5a中获得的蛋白质用BCA试验分析的结果。
图10和10a显示了按照本发明稳定的蛋白质(恰根公司的逆转录酶“奥姆尼斯可利普特”(“Omniscript”，QIAGEN))的活性分析结果，在实施例8中PCR反应后形成琼脂糖-TAE凝胶进行所述分析。
图1所示的装置包括总高度为H的容器1，该容器可用盖子2密封。容器1用组合物，优选液体组合物，优选含有至少一种多元醇和至少一种添加剂(如果合适的话)的组合物最高装填至装填高度h。设计成网孔或筛网形式的浸液助器3与盖子2相连。样品5在浸入浸液助器3之前位于组合物的表面，在闭合盖子2时样品浸入组合物中，在该方法中，容器1闭合时浸液助器3穿过容器1最高到高度h’。当盖子2拧紧时，安装在浸液助器3上的混合器件的导流叶片4混合该组合物。由图1a就1b可以看出，可将混合器件的导流叶片4设计成不同形状。图1a和1b显示了4个导流叶片4，但原则上还可能利用少于4个或多于4个导流叶片4，只要混合器件围绕轴L的旋转能确保容器1中的组合物充分混合。根据图2，导流叶片4还可安装在浸液助器4以下，而如图3所示，导流叶片4也可以是浸液助器3的一个组件。此时，浸液助器3可具有，例如一个或多个放射状延伸(即垂直于轴L)的突出物，这些突出物可设计成，例如小的叶片形状。如图3所示，本发明特别优选导流叶片4尽可能接近生物学样品5，因为这样能确保组合物紧邻样品而尽可能彻底地混合，从而使得所述组合物特别均匀地渗入样品5。图3所示的装置还可装有轮盘6，借助该轮盘即使关闭且不移动盖子2也能转动混合器件的导流叶片4。
图4显示了其中浸液助器3装有样品接收器的装置，由US 2003/0087423A1可以知晓。此处，装有样品接收器的浸液助器3还可设计成具有倾斜侧板(因此从上面看呈梯形的轮廓)，因而这些倾斜的侧板在浸液助器绕轴L转动时起到导流叶片4的作用(参见图4b)。
图5显示了本发明第二种装置的一种实施方式。该装置用上述组合物最高装填至装填高度h，钢球7位于容器1的内部。当该装置绕轴L’倾斜时，钢球以图5所示箭头的方向移动，从而混合了所述组合物。
实施例
1.按照本发明处理的样品的组织学分析
取出器官后，立即用1ml表1所详述的各种组合物处理大鼠肝脏组织，25℃培养箱中保存1天。保存后，将组织片从溶液中取出，转移入塑料盒中，按照常规方法在一系列浓度递增的乙醇和二甲苯中温育并包埋在石蜡中。利用切片机制备石蜡包埋组织切片，通过常规方法用苏木精-曙红染色载玻片上的这些切片。利用光学显微镜观察染色的组织切片。结果总结于表1：
表1
| 组合物 | 结果 |
| 1，2，3-丙三醇 | 维持形态 |
| 1，2，6-己三醇 | 维持形态 |
| 3-甲基-1，3，5-戊三醇 | 维持形态 |
| 25％1，2，3-丙三醇+75％1，2，6-己三醇 | 维持形态 |
| 75％二甘醇+25％1，2，6-己三醇 | 维持形态 |
| 75％3-甲基-1，3，5-戊三醇+25％1，2，3-丙三醇 | 维持形态 |
| 75％1，2，6-己三醇+25％3-甲基-1，3，5-戊三醇 | 维持形态 |
| 75％1，2-丙二醇+25％1，2，6-己三醇 | 维持形态 |
| 50％三乙二醇+50％1，2，6-己三醇 | 维持形态 |
| 75％三乙二醇+25％1，5-戊二醇 | 维持形态 |
| 75％1，2，6-己三醇+25％1，5-戊二醇 | 维持形态 |
| 50％三乙二醇+50％2，4-戊二醇 | 维持形态 |
| 50％二甘醇+50％1，3-戊二醇 | 维持形态 |
| 二甘醇 | 维持形态 |
| 三乙二醇 | 维持形态 |
| 1，3-丙二醇 | 维持形态 |
| 25％DMSO+75％1，2，6-己三醇 | 维持形态 |
| 50％DMSO+50％1，5-戊二醇 | 维持形态 |
| 75％DMSO+25％2，4-戊二醇 | 维持形态 |
由表1可以看出，本发明方法在室温条件下能稳定新鲜的组织样品，对如此稳定的样品还可进行组织学分析。
1a.1，2，3-丙三醇和3-甲基-1，3，5-戊三醇处理样品的组织学分析
对于该实验，制备由25％1，2，3-丙三醇和75％3-甲基-1，3，5-戊三醇及饱和低聚甲醛水溶液(交叉活化添加剂(cross-activating additive))构成的组合物。为制备最终的组合物，将以体积计90％的三醇混合物与以体积计10％的低聚甲醛溶液混合。
取出器官后立即用如此制备的最终组合物处理大鼠肝脏和肌肉组织，室温下(18-25℃)保存1天。保存后，将组织片从溶液中取出，转移入塑料盒中，按照常规方法在一系列浓度递增的乙醇和二甲苯中温育并包埋在石蜡中。利用切片机制备石蜡包埋组织样品的切片，通过常规方法用苏木精-曙红染色载玻片上的这些切片。利用光学显微镜观察染色的组织切片。
明显可以看出该稳定溶液能固定组织，而如此处理的组织适合于组织研究。
2.按照本发明处理的保存样品的RNA分析
取出器官后，立即用1ml各种不同的溶液(参见表2)处理大鼠肝脏组织，室温下保存最长28天，用冰箱于4-8℃保存最长3个月。保存后，分离保存样品的RNA。
为分离RNA，保存后将组织从溶液中取出，每10mg组织加入350μl市售可得的异硫氰酸胍缓冲液，例如德国希尔敦市恰根公司的RLT缓冲液。利用球磨机，例如恰根公司的组织裂解仪(TissueLyzer)(2×2分钟，20Hz，5mm钢球)匀浆样品，在该方法中以现有技术已知的方式用异硫氰酸胍缓冲液裂解细胞并使释放的蛋白质变性。然后以14000rpm离心裂解液3分钟。取上清液350μl，其代表10mg组织。向这些样品中加入1倍体积(350μl)的70％乙醇，通过反复抽吸或旋振混合样品约5秒。然后将裂解液施加于市售可得的含二氧化硅膜的自旋柱(spin column)，例如恰根公司的Rnesay柱，离心(1分钟，10000×g)使之穿过膜。RNA维持与膜结合，然后用第一种市售可得的含异硫氰酸胍的洗涤缓冲液，例如恰根公司的缓冲液RW1洗涤。为了酶解除去结合的任何总DNA，随后将用合适缓冲液配制的DNA酶I施加于该柱，室温下温育15分钟以降解结合的DNA。然后用第一种市售可得的含异硫氰酸胍的洗涤缓冲液，例如恰根公司的缓冲液RW1再次洗涤样品，随后用含Tris或含Tris和醇的第二种洗涤缓冲液，例如恰根公司的缓冲液RPE洗涤。此处，通过离心(1分钟，10000×g)使各种洗涤缓冲液穿过膜。以较小体积的含Tris或含Tris和醇的第二种洗涤缓冲液重复此洗涤步骤，在该方法中离心(2分钟，最高转速，本例中是20000×g)使膜同时干燥。对于洗脱，将40μl不含RNA酶的水加到膜上使纯化的RNA与膜分离。在10-30℃的温度下温育1分钟后，通过离心(1分钟，10000×g)使洗脱液穿过膜，重复此洗脱步骤完成洗脱。
用水稀释后，通过光度计检测260nm波长的吸光度来测定分离的RNA总量。通过光度计检测260nm吸光度与280nm吸光度的比值来测定如此获得的RNA含量。分离步骤的结果见表2。
从表2可以看出，采用本发明方法能在室温稳定新鲜的生物学样品，从这些样品中可以分离足够量的RNA，即使保存长达3个月后，仍可通过260nm吸光度与280nm吸光度的比值表征该RNA的含量。
表2
2a.按照本发明处理的样品的RNA分析
为研究含添加剂的组合物稳定RNA的特性，如实施例1所述制备了含不同量低聚甲醛的组合物(参见表2a)。取出器官后，立即用1.5ml的各种最终组合物处理大鼠肝脏组织，室温下保存3天。然后按照实施例2所述方法分离RNA。各例研究三份样品。
用水稀释后，通过光度计检测260nm波长的吸光度来测定分离的RNA总量。通过光度计检测260nm吸光度与280nm吸光度的比值来测定如此获得的RNA含量。分离步骤的结果见表2a。给出了各例所研究的三份样品的平均值。此外，用溴化乙锭染色琼脂糖凝胶分析分离的RNA。为此，用1％的甲醛琼脂糖-MOPS凝胶分离，例如10μl洗出液。结果见图8c。
表2a
| 编号 | 组合物：含量以体积％计的25％ 含量以体积％计1，2，3-丙三醇和75％3-甲 的低聚甲醛饱和基-1，3，5-戊三醇的混合物 溶液 | OD260/280 | RNA产量/μg |
| 1 | 以体积计99％ 以体积计1％ | 2.3 | 48.3 |
| 2 | 以体积计96％ 以体积计4％ | 2.2 | 31.3 |
| 3 | 以体积计90％ 以体积计10％ | 2.3 | 45.8 |
结果显示尽管混合有交联添加剂(低聚甲醛)，但本发明的组合物出乎意料地分离到质量和产量非常好的RNA。因此，本发明方法不仅能维持样品的形态，还能稳定分子成分，例如核酸。
2b.按照本发明处理的样品长期保存后的RNA分析
取出器官后，立即用1ml的组合物a)25％3-甲基-1，2，5-戊三醇和75％1，2，6-己三醇处理大鼠肝脏组织，用冰箱于4-8℃保存最长12个月。同样，用1ml组合物b)25％1，2，3-丙三醇和75％3-甲基-1，2，5-戊三醇处理大鼠肾脏组织并保存。
表2b：
| 编号 | 保存时间 |
| 1 | 7天 |
| 2 | 14天 |
| 3 | 21天 |
| 4 | 28天 |
| 5 | 2个月 |
| 6 | 3个月 |
| 7 | 4个月 |
| 8 | 5个月 |
| 9 | 6个月 |
| 10 | 9个月 |
| 11 | 12个月 |
在表2b所述的时间点，采用实施例2所述方法分离保存在组合物a)和b)中的样品的RNA。
用溴化乙锭染色琼脂糖凝胶分析分离的RNA。为此，制备例如0.1％甲醛琼脂糖-MOPS凝胶。图9a显示了用组合物a)处理样品的结果，图9b显示了用组合物b)处理样品的结果。
两幅图均明确显示本发明方法能将RNA保存甚至非常长的时期，而无需冷冻。
3.按照本发明方法处理的保存样品的DNA分析
取出器官后，立即用1ml各种不同的溶液(参见表3)处理大鼠肺组织，25℃保存6天。保存后，分离保存样品的DNA。
为分离DNA，保存后将组织从溶液中取出，每10mg组织加入180μl恰根公司的缓冲液ALT。利用球磨机，例如恰根公司的组织裂解仪(45秒，25Hz，利用5m钢球)匀浆样品。加入40μl蛋白酶K溶液(恰根公司)后，55℃振荡温育裂解液1小时。温育后，加入220μl市售可得的含盐酸胍的裂解缓冲液，例如恰根公司的缓冲液AL，旋振混合样品。与220μl 100％的乙醇混合后，将样品施加于含二氧化硅膜的自旋柱(恰根公司的QIAamp迷你自旋柱)，离心(10,000rpm)1分钟使裂解液穿过膜。DNA维持与膜结合，首先用第一种市售可得的含盐酸胍的洗涤缓冲液，例如恰根公司的缓冲液AW1洗涤，随后用含酒精的第二种洗涤缓冲液，例如恰根公司的缓冲液AW2洗涤。在该方法中，通过离心(1分钟，10000×g或3分钟，14000×g)使洗涤缓冲液穿过膜。施加60μl AE洗脱缓冲液(恰根公司)洗脱DNA。温育1分钟后，通过离心(1分钟，10000×g)使洗脱缓冲液穿过膜，重复洗脱。
用水稀释后，通过光度计检测260nm波长的吸光度来测定分离的DNA总量。通过光度计检测260nm吸光度与280nm吸光度比值来测定如此获得的RNA含量。分离步骤的结果见表3。
表3
| 试剂 | 260nm/280nm | 产量 |
| 1，2，6-己三醇 | 1.9 | 30.9 |
| 3-甲基-1，3，5-戊三醇 | 1.9 | 21.1 |
| 25％1，2，3-丙三醇/75％1，2，6-己三醇 | 1.9 | 24.6 |
| 75％1，2，3-丙三醇/25％3-甲基-1，3，5-戊三醇 | 1.9 | 21.7 |
| 25％1，2，3-丙三醇/75％3-甲基-1，3，5-戊三醇 | 2.0 | 26.9 |
| 75％1，2，6-己三醇/25％3-甲基-1，3，5-戊三醇 | 1.9 | 14.7 |
| 50％1，2，6-己三醇/50％3-甲基-1，3，5-戊三醇 | 1.9 | 19.4 |
从表3可以看出，即使在室温下保存6天，本发明的稳定方法也能在稳定的样品中分离得到质量和产量良好的DNA，因此，本发明的稳定方法适用于稳定RNA(实施例2)和稳定DNA。
4.按照本发明处理的保存样品的蛋白质分析
取出器官后，立即用1ml各种不同的三醇(参见表4)处理大鼠肝脏组织，在培养箱中于25℃保存2天和7天。保存后，制备保存样品的蛋白质提取物。取出大鼠的肝脏组织后，将其直接冷冻在液氮中，然后于-80℃保存用作对照。
为制备蛋白质提取物，保存后将组织从稳定组合物中取出，每10mg组织加入400μl常规提取缓冲液，在本例中是8M脲、100mM磷酸二氢钠和10mM Tris，pH 8.0的组合物，利用球磨机，例如恰根公司的组织裂解仪匀浆样品。以可能的最高转速(例如，约20000×g)离心得到的裂解液15秒以沉淀未溶解的成分。取出蛋白上清液，采用Bradford试验测定蛋白质浓度。通过常规方法用SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离各3μg蛋白质，采用考马斯染色法染色凝胶中的蛋白质(参见图6)。与对照相比，保存期间染色的蛋白质条带的模式未改变。蛋白质维持稳定，没有任何降解。
按照生产商的使用说明书，用半干印迹设备将施加了相同样品的第二份SDS-聚丙烯酰胺凝胶印迹到硝酸纤维素膜上。按照现有技术用奶粉饱和该膜，按照生产商的使用说明书使膜与ERK2-特异性抗体，例如恰根公司的Taq100抗体杂交，并进行免疫检测。结果示于图6。
从图6可以看出，即使在室温下保存7天后，处理样品中的蛋白质与处理前一样仍维持完整并未降解，分离的产量良好。因此，本发明的稳定方法适合于稳定核酸(参见实施例2和3)和稳定蛋白质。
表4
| 泳道 | 组合物 |
| 1 | 1，2，4-丁三醇 |
| 2 | 3-甲基-1，3，5-戊三醇 |
| 3 | 75％1，2，3-丙三醇+25％1，2，6-己三醇 |
| 4 | 1，2，6-己三醇 |
| Co | 对照 |
5.按照本发明处理的保存样品的蛋白质分析
取出器官后，立即用1ml各种不同的三醇(参见表5)处理大鼠肝脏组织，在冰箱中于4-8℃保存2天。取出器官后组织立即冷冻在液氮中，-80℃冷冻保存用作阳性对照。
保存后，将组织从稳定溶液中取出，每10mg组织加入400μl恰根公司的“液相芯片广谱Ser/Thr-激酶(LiquiChip Broad-Range Ser/Thr-Kinase)”手册所述的提取缓冲液。利用球磨机，例如恰根公司的组织裂解仪(5分钟时期，30Hz，利用5mm钢球)匀浆样品，然后用台式离心机(bench top centrifuge)以14000rpm离心3分钟。取出上清液，用提取缓冲液作1∶10稀释。按照生产商的使用说明书，使用恰根公司的“液相芯片广谱Ser/Thr-激酶”试剂盒，用相应的设备(液相芯片读数计(LiquiChip Reader))检测如此获得的样品的激酶活性。未加蛋白质的生产商试验缓冲液1用作阴性对照。各样品的制备和检测按一式两份进行。
图7显示了用各激酶底物(HH：组蛋白H1，MBP：髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein))检测的荧光均值(MFI＝中等荧光强度)结果。
这些结果显示，按照本发明方法处理并按照本发明方法保存生物学样品后，从中分离的蛋白质仍能显示它们的活性。因此，所示稳定剂也适用于依赖天然和活性蛋白质的下游分析。
表5
| 样品 | 组合物 |
| 1 | 1，2，3-丙三醇 |
| 2 | 1，2，6-己三醇 |
| 3 | 3-甲基-1，3，5-戊三醇 |
| 4 | 75％1，2，3-丙三醇+25％1，2，6-己三醇 |
| 5 | 50％1，2，3-丙三醇+50％1，2，6-己三醇 |
| 6 | 25％1，2，3-丙三醇+75％1，2，6-己三醇 |
| 7 | 75％1，2，3-丙三醇+25％3-甲基-1，3，5-戊三醇 |
| 8 | 50％1，2，3-丙三醇+50％3-甲基-1，3，5-戊三醇 |
| 9 | 25％1，2，3-丙三醇+75％3-甲基-1，3，5-戊三醇 |
| 10 | 75％1，2，6-己三醇+25％3-甲基-1，3，5-戊三醇 |
| 11 | 50％1，2，6-己三醇+50％3-甲基-1，3，5-戊三醇 |
| 12 | 25％1，2，6-己三醇+75％3-甲基-1，3，5-戊三醇 |
| 13 | 冷冻的(液氮中) |
| 14 | 阴性对照 |
5a.按照本发明处理的样品经长期保存后的蛋白质分析
取出器官后，立即各自用1.5ml的25％3-甲基-1，2，5-戊三醇(penantriol)和75％1，2，6-己三醇的组合物处理大鼠肝脏组织，在培养箱中于25℃或在冰箱中于2-8℃保存最长6个月。在表5a所示的各时间点制备保存样品的蛋白质提取物。
表5a)：
| 编号 | 保存时间 |
| 1 | 7天 |
| 2 | 14天 |
| 3 | 21天 |
| 4 | 28天 |
| 5 | 2个月 |
| 6 | 3个月 |
| 7 | 4个月 |
| 8 | 5个月 |
| 9 | 6个月 |
为制备蛋白质提取物，保存后将组织从稳定组合物中取出，每10mg组织加入400μl常规提取缓冲液，在本例中是恰根公司的哺乳动物裂解缓冲液，利用球磨机，例如恰根公司的组织裂解仪匀浆样品。以可能的最高转速(例如，约20000×g)离心得到的裂解液15秒以沉淀不溶解的成分。取出蛋白上清液，采用BCA试验(例如皮尔斯公司(Pierce)的)测定蛋白质浓度。
通过常规方法用SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离各3μg蛋白质，按照生产商的使用说明书，用半干印迹设备将凝胶印迹到硝酸纤维素膜上。按照现有技术用奶粉饱和该膜，按照生产商的使用说明书使膜与肌动蛋白-特异性抗体和ERK2-特异性抗体，例如恰根公司的Taq100抗体杂交，并进行免疫检测。图9显示了用ERK2-特异性抗体的结果，图9c显示了用肌动蛋白-特异性抗体的结果。
从图9c和9d可以看出，无需冷冻，并且甚至在高温，例如室温下也可能将稳定样品中的蛋白质长时间保存。
5b.通过ELISA技术分析按照本发明处理的样品中的蛋白质
取出器官后，立即各自用1.5ml的25％3-甲基-1，2，5-戊三醇(penantriol)和75％1，2，6-己三醇的组合物处理大鼠肝脏组织，在培养箱中于25℃保存7天。取出器官后组织样品立即冷冻在液氮中，-80℃冷冻保存用作对照。保存后，制备蛋白质提取物。
为制备蛋白质提取物，保存后将组织从稳定组合物中取出，每10mg组织加入200μl常规提取缓冲液，在本例中是恰根公司的哺乳动物裂解缓冲液，利用球磨机，例如恰根公司的组织裂解仪匀浆样品。以可能的最高转速(例如，约20000×g)离心得到的裂解液15秒以沉淀不溶解的成分。取出蛋白上清液，采用BCA试验(例如皮尔斯公司的)测定蛋白质浓度。将裂解液按浓度2.5mg/ml标准化，用20μl该稀释裂解液分析。按照生产商(恰根公司)的使用说明书，用GADPH和TBP的“液相芯片细胞信号转导检测试剂盒(LiquiChipCell Signaling Detection Kits)”和匹配的“核心试剂盒(Core Kit)”在相应的工作站(液相芯片工作站(Liquichip Workstation))上进行该分析。
用不含组织的纯缓冲液样品测定背景。从样品数据中扣除背景。各样品的制备和检测按一式三份进行。
表5b为检测的荧光均值(MFI＝中等荧光强度)，显示了各蛋白质(GADPH、TBP)的检测结果。
表5b：
| GAPDH | TBP | |
| 对照N2 | 1274 | 103 |
| 7天，25℃ | 1446 | 100 |
这些结果明确证明，按照本发明方法稳定和保存生物学样品后，仍可通过ELISA方法分析这些样品的蛋白质。即使在25℃保存7天后仍能检测到与对照相当的蛋白质含量。
6.按照本发明处理并在高温下保存的样品的RNA分析
取出器官后，立即各自用1ml的1，2，4-丁三醇(1)、3-甲基-1，3，5-戊三醇(2)、1，2，6-己三醇(3)和75％1，2，3-丙三醇与25％1，2，6-己三醇的混合物(4)处理大鼠肾脏组织，在培养箱中于40℃保存1天或50℃保存2小时。
或者，取出器官后，各自用1ml 1，2，4-丁三醇(1)或3-甲基-1，3，5-戊三醇(2)处理大鼠肺组织，在冰箱中于4-8℃保存1天。取出用于分离RNA(a)的一部分样品后，将该组织样品于40℃在溶液中保存1小时。随后，取出另一部分样品(b)，用其分离RNA。然后，将溶液中剩余的组织样品在冰箱中于4-8℃再保存1小时，在培养箱中于40℃保存1小时。4轮循环后，利用最后一次40℃温育后的剩余样品分离RNA(c)。
保存后，如实施例2所述分离保存样品的RNA。
用溴化乙锭染色琼脂糖凝胶上分析分离的RNA。为此，制备例如1.0％甲醛琼脂糖-MOPS凝胶。40℃保存的结果示于图8，50℃保存的结果示于图8a。在4℃和40℃之间交替保存的结果示于图8b。
从图8、8a和8b可以看出，即使在40℃或50℃的温度下保存，也可从按照本发明稳定的样品中分离足够量的完整RNA。
7.按照本发明用不同多元醇处理的样品的RNA分析
取出器官后，立即各自用1ml的1，2，3，4，5-戊五醇(饱和水溶液)(1)、1，2，3，4，5，6-己六醇(4.72M，水配制)(2)或1，2，3-丙三醇(3)处理大鼠脾脏组织，在培养箱中于25℃保存1天或在冰箱中于4-8℃保存3天。
保存后，如实施例2所述从保存的样品分离RNA。
用溴化乙锭染色琼脂糖凝胶分析分离的RNA。为此，制备例如1.0％甲醛琼脂糖-MOPS凝胶。结果示于图9。
从图9可以看出，利用五元醇或六元醇也可稳定生物学样品。
8.按照本发明方法处理分离的蛋白质
利用恰根公司的纯化逆转录酶，“奥姆尼斯可利普特”证明该稳定剂适合于稳定分离的蛋白质。
用10倍体积的表6所示各种稳定剂各处理5μg纯化的酶。将这些混合物在冰箱中于4-8℃保存过夜。为从稳定剂中回收酶，按照生产商恰根公司的使用说明书，利用“拜尔斯普林特(Biosprint)”设备进行基于镍-NTA-亲和结合的自动纯化。纯化前，用生产商的试验缓冲液将所有样品的总体积补充至1ml，各用50μg磁珠悬液。使用的第一种对照是生产商的保存缓冲液配制的5μg奥姆尼斯可利普特，以相同的条件保存(样品6)，第二种对照是以前未保存在稳定溶液中的5μg奥姆尼斯可利普特，只经过简单的纯化(样品7)。此外，实验所用的1μl逆转录酶在PCR中直接用作阳性对照，即不经保存和/或纯化(样品8)。
表6
随后用纯化的酶作PCR检测逆转录的酶活性。为此，借助传统的Bradford反应检测纯化后的蛋白质浓度(结果见表6)，用DTT(恰根公司)以RT保存缓冲液透析纯化的酶。各2μl的透析蛋白质组分用于逆转录。为进行逆转录，制备所有反应的反应混合物，包括2μl 10倍浓度的逆转录酶缓冲液、10mM dNTP混合物、2μM寡聚-dT15(恰根公司的奥姆尼斯可利普特试剂盒(Omniscript kit))、每次反应用75ng Hela细胞的总RNA，用蒸馏水将每次反应的总体积补充至18μl。将该混合物分配在各反应容器中，每例加入2μl各自的奥姆尼斯可利普特组分。37℃进行逆转录1小时。加水而不是逆转录酶用作阴性对照(样品9)。
在随后的PCR中扩增人β-肌动蛋白的1.6kb片段转录物。为此，制备所有反应的反应混合物，包括2μl 10-倍浓度的PCR缓冲液、4M dNTP混合物、0.4μl 25mM氯化镁溶液，各引物0.8ml、4μl 5-倍浓度的Q溶液和0.25ml Taq-DNA聚合酶(恰根公司的PCR试剂盒)，用蒸馏水将每次反应的总体积补充至19μl。将该混合物分配在各反应容器中，各加入1μl先制备的cDNA。使用的非模板对照是水而不是cDNA(NTC样品)。如下所示进行扩增：93℃、5分钟；各30轮的93℃30秒，55℃30秒，72℃90秒；然后1轮72℃5分钟。各反应按一式两份进行。
扩增后，将各10μl PCR反应物施加于琼脂糖-TAE凝胶，120V分离1小时。所用的分子量大小标记物是英杰公司(Invitrogen)的“低分子量DNA梯(Low DNA Mass Ladder)”。结果示于图10和10a。
从图10可以看出，本发明方法还适用于保存和再纯化分离的蛋白质而不会明显影响蛋白质的活性。
9.按照本发明方法处理的样品的RNA分析
取出器官后，立即用1ml表7所示各种组合物处理大鼠脾脏组织，25℃保存7天。然后，按照实施例2所述的方法分离这些样品的RNA。
在下游分析中通过PCR分析测定如此分离的RNA的性能。利用从脾脏组织分离并冷冻于-80℃的RNA作为对照。
为测定分离的RNA的性能，按照生产商的使用说明书，利用总体积为25μl的各10ng总RNA与实时RT-PCR的合适主混合物(mastermix)，例如恰根公司的昆泰克探针RT-PCR试剂盒(Quantitect Probe RT-PCR kit)，以及可商品化购得的试验引物和样品，例如ABI公司的。可利用合适的实时扩增设备，例如ABI公司的7700设备进行扩增。扩增各按一式两份进行。求出所得ct值的平均值，测定标准偏差。可利用ct值来相对定量测定所用RNA的转录物水平。结果示于表7。
表7
从表7可以看出，可从本发明处理的样品中分离的RNA仍非常适合于下游分析。
10.按照本发明处理的冷冻样品的RNA分析
取出器官后，立即将大鼠肝脏组织冷冻在液氮中，然后保存在液氮中。然后将这些样品各20-50mg与1ml的表8所示各种组合物温育，4-8℃保存3天。然后如实施例2所述分离如此预处理的样品的RNA。结果示于表8。
从表8可以看出，本发明方法不仅适用于稳定新鲜的生物学样品，还适用于制备冷冻样品以供分析生物分子。
表8.
| 组合物 | RNA量[μg] |
| 1，3-丙二醇 | 55.5 |
| 1，4-丁二醇 | 55.2 |
| 1，3-丁二醇 | 53.1 |
| 二丙二醇 | 60.8 |
| 三甘醇 | 65.6 |
| 50％三甘醇+50％1，3-丙二醇 | 51.1 |
| 1，2，6-己三醇 | 46.7 |
| 1，2，3-丙三醇 | 49.3 |
| 1，7-庚二醇 | 53.5 |
| 1，5-戊二醇 | 48.3 |
| 1，6-己二醇 | 51.7 |
| 2，4-戊二醇 | 45.4 |
| 2-乙基-2-(羟甲基)-1，3-丙二醇 | 50.3 |
| 3-烯丙氧基-12-丙二醇 | 40.4 |
| 顺-2-丁烯-1，4-二醇 | 35.0 |
11.按照本发明方法处理的样品的诱导分析
从生物体采集生物学样品触发了细胞中的应激反应。基因表达分布模式立即开始变化，首先是RNA降解，然后还诱导了新转录物的合成。因此，必须按照本发明处理生物学样品不仅是防止降解，而且可防止诱导新转录物合成。为检测按照本发明处理样品是否能立即防止诱导新转录物合成，取出器官后，立即用由25％3-甲基-1，3，5-戊三醇和75％1，2，6-己三醇构成的1ml组合物处理大鼠肺组织，并在25℃保存2小时、4小时和24小时。用PBS处理并相同保存的组织样品，和取出器官后立即冷冻在液氮中并在-80℃保存的组织样品用作对照。然后按照实施例2所述的方法分离RNA。
为进一步分析所分离的RNA，按照生产商的使用说明书，利用总体积为25μl的10ng总RNA与实时RT-PCR的合适主混合物，例如恰根公司的昆泰克SYBR绿RT-PCR试剂盒(Quantitect SYBRGreen RT-PCR kit)。可利用合适的实时扩增设备，例如ABI公司的7700设备进行扩增。扩增各按照一式两份进行。求出所得ct值的平均值，测定标准偏差。可利用ct值来相对定量测定所用RNA的转录物水平。为此，在有GAPDH存在下，不仅扩增各样品中的靶转录物，而且扩增各样品中并非应激所诱导的转录物作为内源性对照。待测试的转录物量与对照转录物的检测量有关，借助Δ-Δ-ct方法(仪器生产商ABI公司所述的计算方法)测定与冷冻在液氮中的对照相比，待测试的转录物量的变化。立即冷冻在液氮中阻止了转录物的任何诱导或降解，因此该样品代表参比样品(第0时)。用数学和图表方法测定样品保存在PBS或本发明组合物期间转录物量的变化。保存在PBS中明显诱导了c-fos基因转录，因此c-fos转录物的量显著增加。然而，按照本发明处理样品成功地抑制了这种诱导。
Claims (25)
1.一种稳定生物学样品的方法，所述方法包括以下方法步骤：
i)提供生物学样品，和
ii)使所述生物学样品与包含以下组分的组合物接触：
(α1)以重量计，1％到最多100％的至少一种多元醇，和
(α2)以重量计，0-99％的至少一种添加剂，所述添加剂选自：一元醇、酮、二甲基亚砜、芳族烃、卤化的烃、醚、羧酸、羧酰胺、腈、硝基烷和酯，
其中，以重量计，组分(α1)和(α2)的总量为100％。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物学样品是冷冻的生物学样品。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物学样品是未冷冻的生物学样品。
4.如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述多元醇是二醇、三醇、四醇、五醇、六醇、七醇、八醇或九醇。
5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述多元醇是二醇或三醇。
6.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述多元醇具有2-20个碳原子。
7.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述多元醇选自：1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、1，4-丁二醇、2，3-丁二醇、1，2-戊二醇、1，3-戊二醇、1，4-戊二醇、1，5-戊二醇、2，3-戊二醇、2，4-戊二醇、1，2-己二醇、1，3-己二醇、1，4-己二醇、1，5-己二醇、1，6-己二醇、2，3-己二醇、2，4-己二醇、2，5-己二醇、3，4-己二醇、1，2，3-丙三醇、1，2，3-丁三醇、1，2，4-丁三醇、1，2，3-戊三醇、1，2，4-戊三醇、1，2，5-戊三醇、2，3，4-戊三醇、1，2，3-己三醇、1，2，4-己三醇、1，2，5-己三醇、1，2，6-己三醇、2，3，4-己三醇、2，3，5-己三醇、3-甲基-1，3，5-戊三醇、三羟甲基丙醇、季戊四醇、二甘醇、二丙二醇、三甘醇、三丙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇。
8.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述组合物包含至少两种多元醇的混合物。
9.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，在-80℃至+80℃的温度范围使所述生物学样品与所述组合物接触。
10.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，在0至+80℃的温度范围使所述生物学样品与所述组合物接触。
11.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，除方法步骤i)和ii)以外，所述方法还包括以下方法步骤：
iii)将与所述组合物接触的生物学样品保存在-80℃至+80℃的温度范围内。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，将与所述组合物接触的生物学样品保存0℃至+80℃的温度范围内。
13.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物学样品包括：生物体，分离的细胞，细胞器，组织，组织片段，组织切片，体液，天然且任选分离的蛋白质，合成或修饰的蛋白质，天然且任选分离的核酸，合成或修饰的核酸，脂质，碳水化合物，代谢产物和代谢物，污迹，自来水，食物样品，环境样品，法医学样品。
14.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物学样品包括：细菌，真菌或真菌的部分，病毒，植物或植物的部分，粪便。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述病毒选自：类病毒或朊病毒。
16.一种分析生物学样品的方法，除了权利要求1所述的方法步骤i)和ii)以及权利要求11所述的方法步骤iii)以外，所述方法还包括以下方法步骤：
iv)组织学分析与所述组合物接触的生物学样品，或分析与所述组合物接触的生物学样品中的生物分子或获自所述生物学样品的生物分子。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法步骤iv)包括组织学分析和生物分子的分析。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法步骤iv)包括分析蛋白质与分析核酸。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述方法步骤iv)包括分析蛋白质与分析核酸。
20.如权利要求16-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物学样品包括：生物体，分离的细胞，组织，组织片段，组织切片，体液，天然且任选分离的蛋白质，合成或修饰的蛋白质，天然且任选分离的核酸，合成或修饰的核酸，脂质，碳水化合物，代谢产物和代谢物，污迹，自来水，食物样品，环境样品，法医学样品。
21.如权利要求16-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物学样品包括：细菌，真菌或真菌的部分，病毒，植物或植物的部分，粪便。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述病毒选自：类病毒或朊病毒。
23.一种试剂盒，其装有
(a)如权利要求1和4-9中任一项所述的组合物，和
(b)分析生物学样品中或获自生物学样品的生物分子或分析生物学样品形态的试剂。
24.如权利要求1和4-9中任一项所述组合物在处理生物学样品中的用途。
25.如权利要求1和4-9中任一项所述组合物在如权利要求1-3中任一项所述方法中的用途。
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