CN105571918B - 一种用于生物活性物质精确定量检测的样品前处理方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于生物活性物质精确定量检测的样品前处理方法，其特征在于主要包括如下步骤：1）样品管准备；2）样品管第一次计重；3）样品管预冷；4）半定量取样；5）精细研磨；6）样品管二次计重；7）微量配平；8）震荡提取、离心、过滤、分析。本发明不仅大大简化了实验操作过程，提高了工作效率，而且该方法对于环境要求低，可以在任何室温进行操作，不影响实验结果，实验结果一致性强，结果稳定性高。

Description

一种用于生物活性物质精确定量检测的样品前处理方法
技术领域
本发明涉及一种生物活性物质精确定量检测的样品前处理方法，具体地说，是对植物组织中具有生物活性的物质进行定量检测的精确前处理技术。该方法可以用于生物样品的定量检测前处理、精确定量提取等技术领域。
背景技术
生物活性物质极易变质，通常保存在-70℃以下超低温冰箱中，其转运和处理过程一般也对环境温度要求极高，通常在液氮或干冰等极低温的环境中进行。因此，其样品的准确定量成为其前处理过程的瓶颈步骤，传统方法中，通常在低温称量室中以0℃冰块作为预冷介质快速称量定量，并加入固定体积的萃取试剂进行萃取。
传统方法缺点在于：
1）由于生物样品很容易受环境温度变化而变质，因此全部过程中要求样品在低温环境中不融化不变质，所以对称量室环境温度要求高；
2）称量过程不可能在极低的样品保存温度中进行，不得不将样品转移至室温可控的天平中进行，即称量过程中样品由-70℃以下转移至0℃，极易发生质变，因此操作失误风险较大；
3）样品称量过程需要对样品进行绝对定量，因此需要反复添加和减量样品，同时还要保持样品在低温环境中不融化变质，因此称量效率低；
4）采用精确定量样品质量及和萃取溶剂的方法确保料液比的恒定，因此，对样品称量过程中的准确度具有较高的要求，称量误差对实验结果具有重要影响，可能导致实验结果可重复性不高；
5）由于以上原因，操作过程对操作员技术熟练程度要求极高。
因此，采用传统方法前处理样品往往所得结果技术重复间差异较大，很难达到理想效果。可见，当前所采用的方法对于生物活性物质的精确定量运用具有较大缺陷，急需更加有效的定量前处理技术。
发明内容
针对背景技术中存在的技术缺陷，本发明的目的是提供一种生物活性物质精确定量检测的样品前处理方法，以解决现有技术存在的样品质变的风险，克服了现有技术中环境要求高、技术水平要求高、效率低、技术重复间重复性低等缺陷。
实现本发明所采用的技术方案如下：
一种用于生物活性物质精确定量检测的样品前处理方法，其特征在于主要包括如下步骤：
1）样品管准备：在编好号的离心管中加入提取试剂和钢珠，盖好盖子；
2）样品管第一次计重：对加入提取试剂和钢珠的离心管进行称重并记录；
3）样品管预冷：将以上装入提取试剂和钢珠的离心管放入-20℃预冷30min；
4）半定量取样：使用微量药匙取固定体积样品小心装入预冷后的样品管中；
5）精细研磨：将球磨仪适配器放入-20℃预冷30min，将样品管装入球磨仪适配器中，采用微量球磨仪进行研磨，研磨频率为30Hz，时间为30s；
6）样品管二次计重：对加入样品的样品管二次称重，并记录重量，与样品管第一次计重取差值即为样品净重；
7）微量配平：按照样品净重及固定料液比计算所需提取试剂的体积，并使用微量加液器配平每管样品的料液比；
8）震荡提取、离心、过滤、分析：根据实验要求采用超声浸提、离心、并过滤后进行分析。
作为优选，离心管规格为2mL离心管，加入的钢珠直径为5mm，每个离心管加入2粒；提取试剂加入量为0.5ml。
本发明所设计的微量药匙由取样器和手柄构成，所述的取样器为中空圆筒状，上端开口，其侧壁上部设有开口槽，取样器的下底面设有具内螺纹的调节孔；取样器的侧壁上设有刻度；所述的手柄由圆形的定量片和与之固定连接的调节杆组成，定量片位于取样器的腔体内，调节杆靠近的定量片的一端设有与调节孔相配合的调节螺纹，调节杆另一端穿过调节孔并伸出到取样器的外侧。作为优选，定量取样器的内径为3 mm，长度为25 mm，调节杆的直径为3 mm ，长度为100 mm，开口槽的开口宽度为取样器周长的1/6，定量片的直径为3 mm；定量调节螺纹的外径等于调节孔的内径，为2 mm。
上述的一种用于生物活性物质精确定量检测的样品前处理方法在提取茶树新梢组织的代谢组学分析前处理上的应用，此时提取试剂为80%甲醇（重量）和1%甲酸（重量）的混合液。
上述的一种用于生物活性物质精确定量检测的样品前处理方法在茶树新梢组织的儿茶素组分分析前处理上的应用，此时提取试剂为80%（重量）甲醇和1%（重量）甲酸的混合液。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1）改变传统方法中精确定量样品质量及和萃取溶剂的方法，采用以样品质量调节萃取溶剂用量来稳定料液比的提取思路，降低了传统实验中对绝对量的要求而改为相对量的恒定，因此简化了实验操作过程，提高了工作效率；2）该方法对于环境要求低，不需要在极低的环境温度中进行，可以在任何室温进行操作，不影响实验结果；3）步骤简单，可操作性强，降低了传统称量过程中反复添加和减量造成的样品质变风险。因此实验结果一致性强，结果稳定性高；
说明书附图
图1为微量药匙的结构示意图；
图2为取样器的结构示意图；
图3为手柄的结构示意图；
图中：1-取样器；2-手柄， 3-开口槽、4-调节孔；5-刻度；6-定量片；7-调节杆；8-调节螺纹。
具体实施方式
实施例1茶树新梢组织的代谢组学分析前处理。
采收茶树1芽2叶新鲜组织，立即放入液氮中灭活；使用研钵将新鲜组织研磨成粉末；在编好号的2mL离心管中加入提取试剂(0.5mL80%甲醇+1%甲酸)和2粒直径为5mm的钢珠，盖好盖子；对每个编号的离心管（已加入提取试剂和钢珠）进行称重并记录，即样品管第一次计重；然后将以上编号并装入提取试剂和钢珠的离心管放入-20℃预冷30min；将球磨仪适配器放入-20℃预冷30 min；
使用微量药匙取100 mg左右样品小心装入预冷后的样品管中；将样品管装入球磨仪适配器中，采用微量球磨仪30 Hz，研磨30 s；对加入样品的样品管二次称重，并记录重量，与样品管第一次计重取差值即为样品净重；按照样品净重及固定料液比100mg：1mL提取试剂的比例计算所需提取试剂的体积，并使用微量加液器配平每管样品的料液比；
超声波提取10min、12000r/min离心10min、0.22μm微孔膜过滤、UPLC-Q-TOF分析。
实施例2茶树新梢组织的儿茶素组分分析前处理
在编好号的2mL离心管中加入提取试剂(0.5mL80%甲醇+1%甲酸)和2粒直径为5mm的钢珠，盖好盖子；对每个编号的离心管（已加入提取试剂和钢珠）进行称重并记录，即样品管第一次计重；然后将以上编号并装入提取试剂和钢珠的离心管放入-20℃预冷30min；使用微量药匙取100 mg左右样品小心装入预冷后的样品管中；将球磨仪适配器放入-20℃预冷30 min，将样品管装入球磨仪适配器中，采用微量球磨仪30 Hz，研磨30 s；对加入样品的样品管二次称重，并记录重量，与样品管第一次计重取差值即为样品净重；按照样品净重及固定料液比100mg：1mL提取试剂的比例计算所需提取试剂的体积，并使用微量加液器配平每管样品的料液比；超声波提取10min、12000r/min离心10min、0.22μm微孔膜过滤、HPLC分析。
实施例3 微量药匙的设计
微量药匙由取样器1和手柄2构成，取样器1为中空圆筒状，空腔即为样品仓，用于盛装样品，取样器1的上端开口，其侧壁上部设有长条形的开口槽3，方便观察样品仓中所盛装样品的情况；取样器的下底面的中央设有具内螺纹的调节孔4。手柄2由圆形的定量片6和与定量片6固定连接的调节杆7组成，调节杆7靠近的定量片6的一端设有与调节孔4相配合的调节螺纹8，使用时，将调节杆7从取样器1开口端插入，并穿过调节孔4，此时，定量片6位于取样器1的腔体内，调节杆7远离定量片6的一端穿过调节孔4并伸出到取样器1的外侧。为了实现半定量取样，在取样器1的侧壁上设有刻度5，将定量片6调节到相应的刻度位置时，即量取所相应体积的样品。作为优选，该微量半定量取样装置的规格最好设计为如下：取样器1的内径为3 mm，长度为25 mm，调节杆7的直径为2 mm ，长度为100 mm，开口槽3的开口宽度为取样器周长的1/6，定量片6的直径为3 mm；定量调节螺纹7的外径等于调节孔4的内径，为2 mm。
使用时，一只手捏住取样器1的外侧，另一只手转动手柄2的调节杆7，调节样品仓大小至相应刻度。持调节杆7舀取样品粉末，使得药匙储样槽中全部装满样品，小心倒入天平中的称量纸上，称量计重，重复称量下一个样品。

Claims (9)

1.一种用于生物活性物质精确定量检测的样品前处理方法，其特征在于主要包括如下步骤：
1）样品管准备：在编好号的离心管中加入提取试剂和钢珠，盖好盖子；
2）样品管第一次计重：对加入提取试剂和钢珠的离心管进行称重并记录；
3）样品管预冷：将以上装入提取试剂和钢珠的离心管放入-20℃预冷30min；
4）半定量取样：使用微量药匙取固定体积样品小心装入预冷后的样品管中；
5）精细研磨：将球磨仪适配器放入-20℃预冷30min，将样品管装入球磨仪适配器中，采用微量球磨仪进行研磨，研磨频率为30Hz，时间为30s；
6）样品管二次计重：对加入样品的样品管二次称重，并记录重量，与样品管第一次计重取差值即为样品净重；
7）微量配平：按照样品净重及固定料液比计算所需提取试剂的体积，并使用微量加液器配平每管样品的料液比；
8）震荡提取、离心、过滤、分析：根据实验要求采用超声浸提、离心、并过滤后进行分析。
2.根据权利要求1所述的一种用于生物活性物质精确定量检测的样品前处理方法，其特征在于：所述的离心管规格为2mL离心管，加入的钢珠直径为5mm，每个离心管加入2粒。
3.根据权利要求1所述的一种用于生物活性物质精确定量检测的样品前处理方法，其特征在于：步骤1）中提取试剂加入量为0.5ml。
4.根据权利要求1所述的一种用于生物活性物质精确定量检测的样品前处理方法，其特征在于：步骤4）中的微量药匙由取样器（1）和手柄（2）构成，所述的取样器（1）为中空圆筒状，上端开口，其侧壁上部设有开口槽（3），取样器的下底面设有具内螺纹的调节孔（4）；取样器（1）的侧壁上设有刻度（5）；所述的手柄（2）由圆形的定量片（6）和与之固定连接的调节杆（7）组成，定量片（6）位于取样器（1）的腔体内，调节杆（7）靠近的定量片（6）的一端设有与调节孔（4）相配合的调节螺纹（8），调节杆（7）另一端穿过调节孔（4）并伸出到取样器（1）的外侧。
5.根据权利要求4所述的一种用于生物活性物质精确定量检测的样品前处理方法，所述取样器（1）的内径为3 mm，长度为25 mm，调节杆（7）的直径为2 mm ，长度为100 mm，开口槽（3）的开口宽度为取样器周长的1/6，定量片（6）的直径为3 mm；调节螺纹（8）的外径等于调节孔（4）的内径，为2 mm。
6.根据权利要求1至5中任意一项所述的一种用于生物活性物质精确定量检测的样品前处理方法在提取茶树新梢组织的代谢组学分析前处理上的应用。
7.根据权利要求1至5中任意一项所述的一种用于生物活性物质精确定量检测的样品前处理方法在茶树新梢组织的儿茶素组分分析前处理上的应用。
8.根据权利要求6所述的一种用于生物活性物质精确定量检测的样品前处理方法在提取茶树新梢组织的代谢组学分析前处理上的应用，其特征在于提取试剂为80%（重量）甲醇和1%（重量）甲酸的混合液。
9.根据权利要求7所述的一种用于生物活性物质精确定量检测的样品前处理方法在茶树新梢组织的儿茶素组分分析前处理上的应用，其特征在于提取试剂为80%（重量）甲醇和1%（重量）甲酸的混合液。
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