JP2011511926A - 試料を固定する/安定化するための方法及び装置 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図2
Description
i)生物材料を提供することと
ii)以下を含む第1の非水性組成物に生物材料を接触させることと
(a1)10〜90体積%のメタノール、及び
(a2)少なくとも1つの追加の添加剤、及び
(a3)任意で酸
iii)99体積%までのエタノールを含む第2の組成物(B)に生物材料を移すこと。
(α1)10〜80体積%未満のメタノールと
(α2)少なくとも1つの追加の添加剤と
(α3)酸
<浸透性の入れ物で固定された組織におけるRNAの安定化>
ラットの肝臓、腎臓及び脾臓を、取り出した直後、厚さ約3mmの薄片に切断した。固定するために、長さ4cm、幅2.7cm及び深さ5mmの浸透性の入れ物に組織試料を配置した。PCT/EP2008/052371の組成物Aに従った固定液250mLで満たされた500mLのビンの中に、組織試料を含有する浸透性の入れ物を完全に浸漬した。固定液は、メタノール、酢酸、1,3−ブタンジオール及びPEG300を含んでいた。2時間後、エタノール(p.a.)及び1,3−ブタンジオールを含む、PCT/EP2008/052371の組成物Bに従った溶液250mLで満たされた別の500mLのビンに浸透性の入れ物中の組織試料を移すことによって固定を終了した。20時間インキュベートした後、浸透性の入れ物中の組織試料を第1の処理工程としての70%エタノールに移した。
<浸透性の入れ物にて固定された組織におけるDNAの安定化>
浸透性の入れ物において、PCT/EP2008/052371に係る組成物A及び組成物Bの試薬にて、実施例1に記載されたように、ラットの肝臓、腎臓、脾臓及び腸の組織試料を安定化し、処理し、パラフィンに包埋した(少々の変更を伴って:組成物Aの試薬300mL及び6時間後の固定の終了)。
<浸透性の入れ物にて固定された組織の組織像の維持>
実施例1で記載したように、浸透性の入れ物において、PCT/EP2008/052371に係る組成物A及び組成物Bの試薬にてラットの肝臓、腎臓、脾臓及び腸の組織試料を固定し、安定化した。その後、試料を処理し、パラフィンに包埋した。実施例1とは対照的に、固定は6時間持続し、PCT/EP2008/052371に係る組成物Bの試薬への移動後30時間で処理を開始した。工程8〜10においてキシレンの代わりにNeoclearを用い、パラフィンによる浸透(表1の工程11と12)において60℃の温度により、表1に記載されたプロトコールに従って、LeciaTP1020機器における処理を行った。
Claims (22)
- 試料に押し込まれる、開口部、特に縁の鋭い開口部を有する浸透性の入れ物(1、2、3)に試料を挿入し、
次いで、このように浸透性の入れ物に挿入された試料の一部を試料の残りから分離し、
このように試料で満たされた入れ物を固定及び/又は安定化剤の中に浸漬し、
試料を固定及び/又は安定化する、試料を固定及び/又は安定化するための方法。 - 前記浸透性の入れ物の全体の高さが、10mmを超えず、好ましくは5mmを超えないことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 10mmを超えて、好ましくは5mmを超えて離れていない、前記入れ物の壁(1)は、ふるい又は格子の形態であるか、あるいは細長い孔が設けられたことを特徴とする前記先行する請求項に記載の方法。
- ポリオール含有組成物が、試料を固定及び/又は安定化するための剤として用いられることを特徴とする前記先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 1〜100重量%の少なくとも1つのポリオールと0〜99重量%の少なくとも1つの添加剤とを含み、2つの提示された成分の合計量が100重量%である組成物が、試料を固定及び/又は安定化するための剤として用いられることを特徴とする前記先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリオールが、ジオール、トリオール、テトラオール、ペンタオール、ヘキサオール、ヘプタオール、オクタオール又はノナオールであることを特徴とする前記二つの先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリオールが、2〜20の炭素原子を有することを特徴とする前記三つの先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリオールが、1,2−エタンジオール、1,2−プロパンジオール、1,3−プロパンジオール、1,2−ブタンジオール、1,3−ブタンジオール、1,4−ブタンジオール、2,3−ブタンジオール、1,2−ペンタンジオール、1,3−ペンタンジオール、1,4−ペンタンジオール、1,5−ペンタンジオール、2,3−ペンタンジオール、2,4−ペンタンジオール、1,2−ヘキサンジオール、1,3−ヘキサンジオール、1,4−ヘキサンジオール、1,5−ヘキサンジオール、1,6−ヘキサンジオール、2,3−ヘキサンジオール、2,4−ヘキサンジオール、2,5−ヘキサンジオール、3,4−ヘキサンジオール、1,2,3−プロパントリオール、1,2,3−ブタントリオール、1,2,4−ブタントリオール、1,2,3−ペンタントリオール、1,2,4−ペンタントリオール、1,2,5−ペンタントリオール、2,3,4−ペンタントリオール、1,2,3−ヘキサントリオール、1,2,4−ヘキサントリオール、1,2,5−ヘキサントリオール、1,2,6−ヘキサントリオール、2,3,4−ヘキサントリオール、2,3,5−ヘキサントリオール、3−メチル−1,3,5−ペンタントリオール、トリメチロールプロパノール、ペンタエリスリトール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールを含む群から選択されることを特徴とする前記四つの先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも二つのポリオールの混合物が、試料を固定及び/又は安定化するための剤として用いられることを特徴とする前記先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 試料を固定及び/又は安定化するための剤は、界面活性剤、核酸又はタンパク質の分解を阻害する阻害剤、粘度調節剤、染料、緩衝液化合物、保存剤、錯化剤、還元剤、細胞の透過性を改善する物質、カオトロピック物質、固定剤、ポリオール以外の溶媒及び/又はこれらの添加剤の少なくとも2つの混合物を含む群から選択される添加剤を含有することを特徴とする前記先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- i)以下を含む第1の非水性組成物(A)に試料を接触させ、
(a1)10〜90体積%のメタノール、及び
(a2)少なくとも1つの追加の添加剤、及び
(a3)任意の酸
ii)99体積%までのエタノールを含む第2の組成物(B)に生物材料を移すこと
によって試料を固定又は安定化することを特徴とする前記先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。 - 前記非水性組成物(A)は、
(α1)10〜80体積%未満のメタノールと、
(α2)少なくとも1つの追加の添加剤と、
(α3)酸と
を含有することを特徴とする前記先行する請求項に記載の方法。 - 組成物(A)の成分(α1)が、メタノールであることを特徴とする前記先行する請求項に記載の方法。
- メタノール成分が、10〜80%未満の範囲、好ましくは約70体積%までの範囲、約60体積%までの範囲、又は約50体積%までの範囲に存在することを特徴とする前記先行する請求項に記載の方法。
- 工程(i)の第1の組成物の添加剤(a2)が、メタノール以外の追加の溶媒であるか、又は界面活性剤、及び核酸若しくはタンパク質の分解を阻害する阻害剤、DEPC、アルキル化剤、アセチル化剤、ハロゲン化剤、ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体、アミノ酸、アミノ酸類縁体、粘度調節剤、染料、緩衝液物質、保存剤、錯化剤、還元剤、酸化剤、細胞の透過性を改善する物質、カオトロピック物質、たとえば、イソチオシアン酸グアニジニウム若しくは塩酸グアニジニウム、又はアニオンとのカオトロピック塩、並びにこれら添加剤のうち少なくとも2〜6の混合物を含む群から選択される添加剤であることを特徴とする前記四つの先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- メタノール以外の溶媒が、好ましくは、一価のアルコール(モノオール)、C2〜C12のポリオール、ケトン、ジメチルスルホキシド、芳香族炭化水素、ハロゲン化炭化水素、エーテル、カルボン酸、カルボキサミド、ニトリル、ニトロアルカン及びエステルを含む群から選択される有機溶媒であって、好適な溶媒は、たとえば、エタノール、1−プロパノール、2−プロパノール、1,3−ブタンジオール、1,4−ブタンジオール、アセトニトリル、アセトン、アニソール、ベンゾニトリル、1−メトキシ−2−プロパノール、キノリン、シクロヘキサノン、ジアセチン、ジクロロメタン、クロロホルム、キシレン、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、トルエン、ジメチルケトン、ジエチルケトン、アジピン酸ジメチル、炭酸ジメチル、亜硫酸ジメチル、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、酢酸メチル、酢酸エチル、安息香酸、安息香酸メチル、安息香酸エチル、エチルベンゼン、ホルムアミド、三酢酸グリセリル、アセト酢酸エチル、アセト酢酸メチル、N,N−ジエチルアセトアミド、N−メチル−N−エチルアセトアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、N,N−ジメチルホルムアミド、N−メチル−N−エチルホルムアミド、N,N−ジエチルホルムアミド、N,N−ジメチルチオホルムアミド、N,N−ジエチルチオホルムアミド、N−メチル−N−エチルチオホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、N−メチル−N−エチルアセトアミド、N,N−ジエチルアセトアミド、ニトロエタン、ニトロメチルトルエン及びリン酸トリエチルの群から選択可能であることを特徴とする前記先行する請求項に記載の方法。
- 工程i)の組成物A及び/又は非水性組成物は、ハロゲン化炭化水素、特に塩素化炭化水素、特にクロロホルム及び/又はトリクロロエタンを含まないことを特徴とする前記六つの先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- C2〜C12のポリオール、ポリエチレングリコール(PEG)及びジエチレングリコールモノエチルエーテルアセテート(DEGMEA)及びクロロホルムが、組成物(A)の追加の添加剤α2として使用され、組成物Aの追加成分は好ましくはクロロホルムではなく、又はPEGは好ましくは常温未満の融点を有することを特徴とする前記七つの先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 成分(α2)及び(a2)が、約50%〜1%(体積/体積)、好ましくは約20体積%であることを特徴とする前記八つの先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 組成物(A)の成分(α3)及び/又は第1の組成物の任意成分(a3)が、有機酸又は無機酸であり、好ましくは弱酸であり、最も好ましくは酢酸又はプロピオン酸であることを特徴とする前記九つの先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 浸透性の入れ物に存在する試料は容器中の組成物Aによって固定され、次いで組成物Bを含有する容器に移されることを特徴とする前記十の先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 10mmを超えない、好ましくは5mmを超えない全体的高さを有する、前記先行する請求項のいずれか1項に記載の方法を実施するための浸透性の入れ物であって、浸透性の入れ物に、好ましくは入れ物の狭い面に位置する縁の鋭い開口部が設けられたことを特徴とする浸透性の入れ物。
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