DE4019182A1 - Verfahren zum impraegnieren von gewebeproben in paraffin - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Imprägnieren bzw. Durchtränken von Gewebeproben mit Paraffin gemäß Oberbegriff Patentanspruch 1.

Verfahren dieser Art sind bekannt und werden im industriel­ len, insbes. aber auch im medizinischen Bereich dazu verwen­ det, um Gewebeproben nach ihrer Fixierung, Entwässerung und Durchtränkung mit Paraffin in Paraffinblöcke einzubetten und auf diese Weise für eine anschließende mikroskopische Untersuchung (Histologie) vorzubereiten. Von den in Paraffin­ blöcken eingebettenen Gewebeproben können dann feinste Schnitte hergestellt und unter einem Mikroskop untersucht werden. Unter "Gewebeproben" sind im Sinne der Erfindung Gewebeproben ganz allgemein, d.h. menschliche, tierische oder pflanzliche Gewebeproben zu verstehen.

Bei einem bekannten Verfahren (DE-OS 80 47 417) werden die Gewebeproben, welche mit einem geeigneten Fixiermitttel (z.B. Isopropyl-Alkohol) fixiert und anschließend über Isopropyl- Alkohol (Isopropanol) entwässert wurden, ohne die Verwendung eines Zwischenmediums (z.B. Xylol) mit Paraffin imprägniert und anschließend auch in Paraffin eingebettet. Das Imprägnie­ ren im Paraffin erfolgte dabei bei Umgebungsdruck und bei einer Betriebstemperatur etwas höher als der Schmelzpunkt des Paraffin bei Umgebungstemperatur liegt. Bei den üblicherweise verwendeten Paraffinen, und insbes. auch bei den mit Kunst­ stoff veredelten Paraffinen liegt dieser Schmelzpunkt etwa zwischen 50 und 58°C. Für das Tränken der Gewebeproben sind diese in dem flüssigen Paraffin ein- bzw. untergetaucht, d.h. von dem flüssigen Paraffin umgeben, wobei der Austausch des im Gewebe der Gewebeproben enthaltenen Isopropyl-Alkohols gegen Paraffin durch Lösen des Isopropyl-Alkohols im Paraffin erfolgt, und zwar derart, daß im Laufe der Behandlungs- bzw. Imprägnationszeit auch im Gewebe der Gewebeproben die Konzentration des Paraffins in der "Isopropyl-Alkohol- Paraffin-Lösung" zunimmt. Bei diesem bekannten Verfahren ist es nicht, oder nur über eine sehr lange Imprägnationszeit möglich, den Isopropyl-Alkohol im Gewebe der Gewebeproben vollständig bzw. in dem für die Qualität der Paraffin-Einbet­ tung und damit auch für die Qualität der Gewebeschnitte erforderlichen Maße durch Paraffin zu ersetzen.

Neben langen Imprägnationszeiten ist es bei dem bekannten Verfahren u.a. auch nachteilig, daß eine erhebliche Ver­ schmutzung des Paraffins durch Isopropyl-Alkohol erfolgt, was entweder zusätzliche, aufwendige Maßnahmen für die Reinigung des Paraffins oder aber (wegen des erforderlichen Paraffin­ austausches) einen erhöhten Verbrauch an Paraffin bedeutet.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Imprägnieren bzw. Durchtränken von Gewebeproben mit Paraffin aufzuzeigen, welches die vorgenannten Nachteile vermeidet und u.a. ein schnelles und wirtschaftliches Imprägnieren und auch Ein­ betten von Gewebeproben in Paraffin ermöglicht.

Zur Lösung dieser Aufgabe ist ein Verfahren erfindungsgemäß entsprechend dem kennzeichnenden Teil des Patentanspruches 1 ausgebildet.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat gegenüber bekannten Verfahren u.a. den Vorteil, daß wesentlich kürzere Impräg­ nations-Zeiten erreichbar sind, d.h. beispielsweise bei Gewebeproben kleinerer Dicke Imprägnationszeiten, die in der Größenordnung von 20-30 Minuten liegt, so daß mit dem erfindungsgemäßen Verfahren "Paraffin-Schnellschnitte" möglich sind, die beispielsweise noch während einer laufenden Operation eine mikroskopische Untersuchung und Diagnostik einer Gewebeprobe und damit aufgrund dieser Untersuchung während der Operation entsprechende operative Schritte ermöglichen. Das erfindungsgemäße Verfahren hat weiterhin den Vorteil, daß eine Verschmutzung des Paraffins mit Isopro­ pyl-Alkohol und damit ein Austausch von Paraffin vermieden werden, so daß sich das erfindungsgemäße Verfahren auch durch eine hohe Wirtschaftlichkeit auszeichnet.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich durch die Beaufschlagung des Arbeitsraumes mit dem Vakuum auch eine Reduzierung der Betriebstemperatur unter die Schmelztem­ peratur erreichen, die Paraffin bei Umgebungsdruck aufweist. Hierdurch ist es möglich, Gewebeproben bei sehr niedrigen Temperaturen mit Paraffin zu durchtränken, so daß auch temperatur-flüchtige Stoffe in den Gewebeproben erhalten bleiben und bei den nachfolgenden Untersuchungen nachgewiesen werden können, deren Nachweis bei dem bekannten Verfahren nicht möglich war.

Neben einer schnellen, optimalen Durchtränkung erschließt das erfindungsgemäße Verfahren sowie auch neue Möglichkeiten für die Diagnostik.

Beispielsweise werden dem erfindunsgemäßen Verfahren die Betriebstemperatur, die Ultraschall-Behandlung sowie der reduzierte Druck im Arbeitsraum, der beispielsweise in der Größenordnung von 100 mbar liegt, über die gesamte Impräg­ nationszeit konstant aufrechterhalten.

Die Verwendung des Isopropylalkohols hat auch den besonderen Vorteil, daß dieser Alkohol zwar im evakuierten Arbeitsraum durch Sieden aus der jeweiligen Gewebeprobe entweicht, dieses Entweichen jedoch so langsam erfolgt, daß das Paraffin genügend Zeit für ein Eindringen in die Gewebeprobe hat und somit eine optimale Durchtränkung der Gewebeprobe mit Paraffin erzielt wird, und zwar insbesondere auch bei solchen Gewebeproben, wie beispielsweise Fettgeweben, bei denen das Durchtränken mit Paraffin eine besonders sorgfältige Vor­ gehensweise erfordert. Die optimale Durchtränkung wird noch dadurch unterstützt, daß während des Durchtränkens bzw. während der Dauer der Behandlung der Gewebeprobe der Druck wenigstens einmal über den Druck des Vakuums erhöht und anschließend wieder auf den Druck des Vakuums abgesenkt wird. Die Erhöhung erfolgt dabei vorzugsweise auf Atmosphärendruck. Die Gesamtzeit, während der ein erhöhter Druck vorliegt, beträgt vorzugsweise 30-40% der Behandlungsdauer. Bei der Druckänderung wird vorzugsweise die Einwirkung des Ultra­ schalls auf das Gewebe aufrechterhalten.

Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteran­ sprüche.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Figur, die in schematischer Darstellung und im Schnitt eine Imprägnier­ kammer bzw. ein Arbeitsgefäß zeigt, näher erläutert.

In der Figur ist 1 ein Arbeitsgefäß, welches wannen- oder topfartig mit einem geschlossenen Boden und einer geschlos­ senen Umfangswand ausgebildet ist und mit seinem Innenraum 2 die Behandlungs- bzw. Imprägnierkammer für Gewebeproben 3 bildet, von denen jeweils eine Gewebeprobe 3 in einer Kassette 4 angeordnet ist, wie sie üblicherweise bei Impräg­ nieren bzw. Einbetten von Gewebeproben im Paraffin verwendet werden. Jede Kassette 4 ist kästchenartig mit einem ver­ schließbaren Deckel ausgeführt und sowohl an ihren Boden als auch an dem Deckel siebartig ausgebildet, so daß das in den Innenraum 2 des Arbeitsgefäßes 1 eingebrachte Behandlungs­ medium durch den siebartigen Boden bzw. den siebartigen Deckel jeder Kassette 4 auf die in dieser angeordneten Gewebeprobe 3 einwirken kann.

Das Arbeitsgefäß 1 ist zumindest teilweise von Mitteln 5 umschlossen, die eine Beheizung des Innenraumes 2 derart ermöglichen, daß die Temperatur dieses Innenraumes 2 und damit auch eines dort eingebrachten Behandlungsmediums auf einer vorgegebenen bzw. eingestellten Temperatur möglichst konstant gehalten wird. Die Mittel 15 beispielsweise ein Wasserbad, welches mit einer entsprechenden, regelbaren Heizeinrichtung beheizt wird, oder aber bevorzugt ein temperaturgeregelter Raum, d.h. ein Raum, der von einer Luftströmung mit geregelter Temperatur durchströmt wird und somit auch eine Kühlung zuläßt.

Am Arbeitsgefäß 1 ist wenigstens ein Ultraschall-Erzeuger 6 vorgesehen, der als elektromechanischer Wandler ausgebildet ist und von einem nicht dargestellten elektrischen Generator mit einer im Ultraschallbereich liegenden Frequenz, d.h. mit ener Frequenz beispielsweise im Bereich zwischen 35 und 50 KHz angesteuert wird und insbesondere das in den Innenraum 2 eingebrachte Behandlungsmedium sowie vor allem auch die dortigen Gewebeproben 3 mit einer entsprechenden Ultraschall-Energie beaufschlagen. Die Leistung des Ultra­ schall-Generators 6 liegt in der Größenordnung von 100 Watt oder mehreren 100 Watt, und zwar abhängig von der Größe des Arbeitsgefäßes 1, und zwar beispielsweise zwischen 120 Watt bei einem kleineren Arbeitsgefäß und bei 1,2 Kilowatt bei einem größeren Arbeitsgefäß.

An der Oberseite ist das dort an sich offene Arbeitsgefäß 1 durch einen Deckel 7 luft- und vakuumdicht verschließbar. Ebenso wie das Arbeitsgefäß 1 kann auch dieser Deckel 7 die unterschiedlichsten Ausbildungen aufweisen, wie sie dem Fachmann an sich bekannt sind.

Das Einbringen des jeweiligen Behandlungsmediums in den Innenraum erfolgt bis zu einer Füllhöhe F in der Form, daß im Innenraum 2 über dem Spiegel 8 des Behandlungsmediums, und zwar zwischen diesen Spiegel und dem Deckel 7 ein Luftraum verbleibt. Im Bereich d;eses Luftraumes ist in genügendem Abstand vom Spiegel 8 ein Anschluß 9 vorgesehen, der über eine Leitung 10 mit einem Waschtank oder Filter 11 ständig verbunden bzw. verbindbar ist. Der Ausgang des Filters 11 ist an eine Vakuumpumpe 12 angeschlossen.

Bei der dargestellten Ausführungsform ist das Arbeitsgefäß 1 das Reaktionsgefäß eines sogenannten Einkammer-Einbetters (Einkammersystem), d.h. die gesamte Vorbehandlung der Gewebeproben 3 und deren Durchtränkung in Paraffin erfolgt ausschließlich in dem Arbeitsgefäß 1. Hierfür sind diesem Arbeitsgefäß Tanks 13 bis 17 zugeordnet, in denen die verschiedenen Behandlungsmedien auf einer jeweils vorgege­ benen Temperatur bereitgehalten werden, und zwar im Tank 13 eine Fixierflüssigkeit (z.B. Isopropyl-Alkohol) zum Fixieren der Gewebeproben 3 (beispielsweise bei einer Temperatur von 40°C), im Tank 14 70%iger Isopropyl-Alkohol, in den Tanks 15 und 16 jeweils 100%iger Isopropyl-Alkohol und im Tank 17 flüssiges Paraffin, wobei die Tanks 14 bis 17 etwa auf gleicher Temperatur gehalten sind, und zwar auf einer Temperatur von z.B. ca. 58°C, die bei dieser Ausführung der Betriebstemperatur entspricht und für den flüssigen Zustand des Paraffins im Tank 17 erforderlich ist. Die Temperatur der Tanks 14-17 liegt auf jeden Fall wesentlich niedriger als der Siedepunkt (ca. 82,8°C) des Isopropyl-Alkohols (Isopro­ panol) bei Normal- bzw. Atmosphärendruck.

Durch ein entsprechendes, nicht dargestelltes Verbindungs­ leitungssystem sowie Pump- und/oder Ventilsystem ist es möglich, die einzelnen, in den Tanks 18 bis 17 bereitstehen­ den Behandlungsmedien jeweils in den Innenraum 2 des Arbeits­ gefäßes einzubringen und aus diesem Innenraum 2 wieder in den zugehörigen Tank 13-17 abzulassen.

Für das Durchtränken der Gewebeproben 8 mit dem Paraffin aus dem Tank 17 erfolgt zunächst eine Fixierung und Entwässerung dieser Gewebeproben, worauf anschließend ohne ein zwischen­ medium das Imprägnieren bzw. Durchtränken mit Paraffin durchgeführt werden kann. Im einzelnen werden nach dem Einbringen der die Gewebeproben 3 aufweisenden Kassetten 8 in den Innenraum 2 und nach dem Verschließen dieses Innenraumes durch den Deckel 7 folgende Verfahrensschritte durchgeführt.

Zunächst wird aus dem Tank 13 das Fixiermittel, welches beispielsweise ebenfalls Isopropyl-Alkohol oder aber ein anderes, geeignetes Fixiermittel ist, in den Innenraum 2 eingebracht, und zwar bis zu der vorgegebenen Füllhöhe F. Durch die Ultraschall-Energie des Ultraschall-Erzeugers 6 erhöht sich die Temperatur des Fixiermittels auf die Be­ triebstemperatur, die beispielsweise in der Größenordnung von 58°C liegt. Nach dem Fixieren der Gewebeproben 3 wird das Fixiermittel wieder in den Tank 13 abgelassen.

Anschließend wird der Innenraum 2 aus dem Tank 14 mit Isopropyl-Alkohol gefüllt, und zwar wiederum bis zur Füllhöhe F. Dieser Isopropyl-Alkohol weist durch die Temperatur, auf der die Tanks 14-17 gehalten werden, bereits die Betriebs­ temperatur auf. Zur Förderung der mit dieser Füllung aus 70%igem Isopropyl-Alkohol durchgeführten Teilentwässerung erfolgt wieder eine Beaufschlagung des Behandlungsmediums und der Gewebeproben 3 mit Ultraschall. Nachdem die Teilentwäs­ serung der Gewebeproben erreicht und auch das Fixiermittel ausgewaschen ist, wird der 70%ige Isopropyl-Alkohol in den Tank 14 zurückgeführt.

Mit dem 100%igen Isopropyl-Alkohol aus dem Tank 15 erfolgt dann eine weitere Entwässerung und Entfettung der Gewebe­ proben 3, und zwar wiederum bei einer Beaufschlagung mit Ultraschall. Nach dem Rückführen dieser Füllung in den Tank 15 erfolgt schließlich durch entsprechende Füllung des Innenraumes 2 mit dem Isopropyl-Alkohol aus dem Tank 16 das endgültige Entwässern und Entfetten der Gewebeproben 3, und zwar ebenfalls bei Ultraschall-Beaufschlagung.

Nach dem Rückführen dieser letzten Füllung aus Isopropyl- Alkohol in den Tank 16 wird das Durchtränken der Gewebeproben 3 mit dem Paraffin eingeleitet. Hierfür wird flüssiges Paraffin aus dem Tank 17 in den Innenraum 2 bis zur Füllhöhe F eingebracht. Bei durch den Deckel 7 vakuumdicht verschlos­ senem Arbeitsgefäß wird dann mittels der Vakuumpumpe 12 der Druck im Innenraum 2 soweit abgesenkt, daß er etwa in der Größenordnung von 100 mbar liegt, also im Innenraum 2 ein Vakuum hoher Qualität erreicht und über die für das Tränken der Gewebeproben benötigte Zeit aufrechterhalten wird, und zwar bei gleichzeitiger Beaufschlagung des flüssigen Paraf­ fins und der Gewebeproben 3 mit Ultraschall-Energie. Durch die Absenkung des Druckes im Innenraum 2 des Arbeitsgefäßes 1, die (Absenkung) bevorzugt möglichst abrupt erfolgt, wird bei Betriebstemperatur der Siedepunkt des Isopropyl-Alkohols überschritten, so daß der, in den Gewebeproben noch vor­ handene Isopropyl-Alkohol, dessen Siedetemperatur bei Normaldruck bei ca. 82,8°C liegt, verdampft, aus den Gewebeproben durch das diese Gewebeproben 3 umschließende flüssige Paraffin austritt und über den Anschluß 9 abgeführt wird. Der von dem verdampften Isopropyl-Alkohol in den Gewebeproben 3 freigegebene Raum wird sofort mit flüssigem Paraffin besetzt, und zwar ohne daß es zu einem Lösen von Isopropyl-Alkohol in Paraffin kommt. Mit diesem Verfahren ist es möglich, eine Paraffin-Einbettung bzw. -Durchtränkung von Gewebeproben in sehr kurzer Zeit durchzuführen. Bei scheiben­ förmigen Gewebeproben mit einer Dicke von etwa 2 mm sind Imprägnationszeiten von nur 20 bis 30 Minuten erreichbar. Auch bei Gewebeproben größerer Dicke, beispielsweise mit einer Dicke zwischen 3-4 mm sind Imprägnationszeiten zu erreichen, die lediglich im Bereich zwischen 1 und 1 1/2 Stunden liegen.

Die mit dem beschriebenen Verfahren mögliche Paraffin-Impräg­ nation von Gewebeproben entspricht trotz der gegenüber herkömmlichen Verfahren erzielten extremen Verkürzung der Imprägnationszeiten höchsten Qualitätsansprüchen. Insbeson­ dere ist es mit dem vorbeschriebenen Verfahren auch möglich, lufthaltige Gewebe, z.B. Lungengewebe vollständig entlüftet, d.h. ohne Einschluß von Luft in Paraffin zu imprägnieren, so daß dann auch aus solchen Geweben optimale Schnitte für mikroskopische Untersuchungen (Histologie) hergestellt werden können.

Erklärbar sind die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielbaren kurzen Imprägnationszeiten nur dadurch, daß durch die Verdampfung des Isopropyl-Alkohols in Kombination mit der Ultraschall-Behandlung in den Gewebeproben ein vorübergehen­ der Unterdruck entsteht, der das Eindringen der relativ großen Paraffinmoleküle in das Gewebe fördert. Entscheidend ist hierbei auch, daß durch die Ultraschall-Beaufschlagung das Verdampfen des Isopropyl-Alkohols sofort dann einsetzt, wenn beim Absenken des Drucks im Innenraum 2 der Siedepunkt des Isopropyl-Alkohols erreicht ist.

Die Betriebstemperatur, die Ultraschall-Beaufschlagung sowie das Vakuum werden über die gesamte, jeweils benötigte Imprägnationszeit aufrechterhalten.

Ein wesentlicher Vorteil des vorbeschriebenen Verfahrens besteht auch noch darin, daß Isopropyl-Alkohol nicht in das Paraffin gelangt, so daß nach dem Durchtränken der Gewebe­ proben 3 das Paraffin aus dem Innenraum 2 wieder in den Tank 17 abgelassen werden kann. Im Gegensatz zu bekannten Ver­ fahren sind somit auch kein weiterer Tank zur Aufnahme von durch Isopropyl-Alkohol verunreinigtem Paraffin sowie auch keine besondere Maßnahmen zur Paraffin-Rückgewinnung erfor­ derlich.

Im Tank 17 muß lediglich das für die Paraffin-Imprägnation der Gewebeproben 3 verbrauchte Paraffin ersetzt werden, womit sich das beschriebene Verfahren auch durch eine hohe Wirt­ schaftlichkeit auszeichnet.

Nach dem Durchtränken mit Paraffin werden die Gewebeproben 3 in üblicher Weise in einem Paraffinblock eingegossen.

Selbstverständlich ist das vorbeschriebene Verfahren nicht nur in einem Einkammersystem, sondern auch in einem Mehr­ kammersystem möglich, bei dem für die einzelnen Arbeitsgänge mehrere Arbeitsstationen mit jeweils einer Kammer vorgesehen sind und die Gewebeproben 3 bzw. die Kassetten 4 von Arbeits­ station zu Arbeitsstation weitergereicht werden. An einer dieser Arbeitsstationen erfolgt dann im Anschluß an eine vorausgegangene Behandlung der Gewebeproben 3 mit Isopropyl- Alkohol das Durchtränken der Gewebeproben 3 mit Paraffin in der vorbeschriebenen Weise.

Claims (12)

1. Verfahren zum Imprägnieren von Gewebeproben mit Paraffin, bei dem (Verfahren) die jeweilige Gewebeprobe mit einem Fixiermittel fixiert, unter Verwendung von Alkohol entwässert und anschließend in einem Arbeitsraum bei einer vorgegebenen Betriebstemperatur durch Plazieren in flüssigem Paraffin mit diesem durchtränkt wird, und zwar nach einer vorausgehenden Behandlung in Isopropyl-Alko­ hol, wobei die Betriebstemperatur niedriger ist als die Siedetemperatur des Isopropyl-Alkohols bei Normal- bzw. Atmosphärendruck, jedoch so gewählt ist, um das Paraffin zumindest im Arbeitsraum im flüssigen Zustand zu halten, dadurch gekennzeichnet, daß das Durchtränken der Gewebe­ probe (3) in einem geschlossenen, evakuierten Arbeitsraum (2) unter Einwirkung von Ultraschall auf die Gewebeprobe (3) sowie auf das diese Gewebeprobe (3) umschließende flüssige Paraffin erfolgt, und daß das Vakuum im Arbeits­ raum (2) so gewählt ist, daß bei dem im Arbeitsraum (2) herrschenden Druck der Siedepunkt des Isopropyl-Alkohols gleich der Betriebstemperatur ist, vorzugsweise jedoch unterhalb der Betriebstemperatur liegt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ultraschall-Behandlung über die gesamte, für das Imprägnieren der Gewebeprobe (3) benötigte Zeit konstant aufrecht erhalten wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß über die gesamte, für das Imprägnieren benötigte Imprägnationszeit die Betriebstemperatur und/oder der Unterdruck im Arbeitsraum (2) konstant gehalten werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer Gewebeprobe von 2 mm Dicke eine Imprägnationszeit von etwa 20-30 Minuten gewählt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer Gewebeprobe von etwa 3-4 mm Dicke eine Imprägnationszeit von 1-1,5 Stunden gewählt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die Betriebstemperatur im Bereich zwischen etwa 52-60°C liegt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Ultraschall-Frequenz im Bereich zwischen etwa 35-50 KHz liegt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, gekennzeichnet durch Verwendung einer Ultraschall-Leistung im Bereich zwischen 120 und 1200 Watt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß der Druck im Arbeitsraum (2) etwa 100 mbar beträgt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennze;chnet, daß während des Durchtränkens bzw. während der Dauer der Behandlung der Gewebeprobe (3) der Druck im Arbeitsraum (2) wenigstens einmal über den Vakuumdruck erhöht und anschließend wieder auf den Vakuumdruck reduziert wird, wobei vorzugsweise die Gesamtzeit der Behandlung der Gewebeprobe mit dem erhöhten Druck etwa 30-40% der Behandlungsdauer beträgt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Druckerhöhung auf Atmosphärendruck erfolgt.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Druckänderung bei Aufrechterhaltung der Einwirkung des Ultraschalls auf die Gewebeprobe (3) erfolgt.