DE19725968A1

DE19725968A1 - Gefrierschnitte von physikalisch stabilisierten Probeexzisionen

Info

Publication number: DE19725968A1
Application number: DE1997125968
Authority: DE
Inventors: Werner Dr Med Schubert
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-06-19
Filing date: 1997-06-19
Publication date: 1997-11-20

Description

Die Stabilisation beinhaltet nach neuerer Definition Marani E., Schubert W., daß in einer zunächst frischen Probeexzision bei ihrer Verfestigung praktisch alle originären Substanzen zur Strukturerhaltung für die Histologie-Mikroskopie erhalten bleiben. Solche Forderungen können mit der oft angewandten Gewebsformalinfixierung, zumal Wässerungen anzuschließen sind, nicht erfüllt werden. Auch wechselnd starke Quellungen ver stoßen gegen die im Präparat zu fordernde Isomorphie. Bei der Paraffinschnittherstellung gehen u. a. das originäre Zell-Kernwasser wie auch die ebenfalls raummäßig nicht unbedeutenden Lipide durch aggressive Chemikalien verloren. Beeinträchtigungen auch neuer hinzugekommener Methoden wie die Histochemie mit nicht selten labiler Partialanfärbung sind bei solchen substanzgeminderten Präparaten die Folge. Entsprechend ist von Artefakten in Paraffin schnitten oft die Rede gewesen. Die Praxis der histologischen Laboratorien stützt sich dennoch vor allem auf Paraffinschnitte. Druckschriften: Frederic Roulet, Methoden der Pathologischen Histo logie, Wien Springer-Verlag, 1948. Auf Seite 51 beschreibt er, wenn auch unzulänglich, die Kochmethode, in Verwendung von dem toxischen Formalin und ohne Hinweis auf erforderlichen Abkühlungs prozeß der aus der kochend heißen Fixierungsflüssigkeit herausge nommenen Probeexzision. Patentschrift DE 34 33 133 C2 Verfahren zur Schnellfixierung von Organen und Geweben, Patent Schubert, W. mit Vergleichsbildern histologischer Schnitte vom gleichen Lymphknoten nach Heißwasserdenaturierung/Stabilisation und herkömmliche Formalinfixierung (Quellungserscheinungen).

ME.Boon and L.P.Kok Microwave Cookbook of Pathology, Coulomb Press Leyden, Leiden 1987. Darin auch auf S. 71 Marani E. et al. 1987 über Stabilisation unfixierten Gewebes. Offenlegungsschrift DE 39 09 038 A1 (18.3.89) Wärmedenaturierung für frische Probeexzisionen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, mit Gefrierschnitten, die von stabilisierten Gewebsblöcken hergestellt wurden, histo logische Ergänzungen zu geben

a) mit atoxisch und rasch herstellbaren Gefrierschnitten für Basis diagnosen wie Fibrome, Polypen, Hautveränderungen
b) mit parallel-zusätzlichen Gefrierschnitten für Kontrollen bei hochverantwortlichen pathologisch-anatomischen Begutachtungen wie beispielsweise Mammacarcinom, Nierenkrebs.

Diese Aufgabe wird durch die kennzeichnenden Merkmale des Patent anspruches 1 gelöst. Weitere Darlegungen sind den Unteran sprüchen, der Beschreibung sowie der Zeichnung zu entnehmen.

Beispiel für die ubiquitär und leicht durchführbare atoxische physikalische Stabilisation einer möglichst frischen Probeexzision und die dadurch begünstigte Herstellung von mit Haematoxylin gefärbten substanzreichen Gefrierschnitten (Arbeitsschritte):

1. Vorbereitung eines Wasserbades, vorzugsweise aus einem modernem Elektrokocher bestehend mit einem Thermostat, darin bis (automatisch) zum Siedepunkt aufheizbares Brunnenwasser, in welches in Kapseln oder im Sieb (bei feinen Gewebsteilen auch unter Sicht) die ver schiedenen Probeexzisionen, ggf. ein Organ über Sekunden oder meist wenige Minuten, ohne Formalin, eingetaucht werden.
2. Abkühlen der durch Hitzeeinwirkung mit Gleichmaß verfestigten, stabilisierten Probeexzisionen PE in bereit gestelltem kaltem Wasser.
3. Zuschneiden, aservieren u. a.
4. Vorzugsweise Gefrierschnittherstellung auf leistungsfähigem Mikrotom mit Messerkühlung und Streckplatte, möglichst neuem Messer. Gewebsschnitte sollten dabei nicht austrocknen.
5. Der mit dem Objektträger vom gekühlten Messer abgenommene Schnitt/Schnitte ist unverzüglich zur Färbung vor allem mit dem wäßrigen Haematoxylin nach P.Mayer, etwa 1-2 Minuten; zu bedecken.
6. Durch Aufträufeln von Brunnenwasser, welches auch zumindest erwärmt sein kann, bläuen und differenzieren.
7. Einschluß des vergleichsweise substanzreichen mikroskopischen Gewebspräparates, zugleich Schnellschnitt in Karion oder beispiels weise Glyzerin.

An Hand solcher Gefrierschnitte von physikalisch stabilisierten verschiedenen Einsendungen sind am eigenen Institut nun schon über 10 Jahre zahlreiche pathologisch-anatomischen Diagnosen er bracht worden.

Vorteile

Hoch ist der Effekt gegen das Formalin im Labor einzuschätzen mit dem Siedepunkt des Formaldehyds von bereits -16°C, so daß die ätzende, chronisch schädigende Ausdunstung, die selbst Mauern durch dringt, vermieden wird. Das im histologischen Labor meist ver wendete 10%ige Formalin führt in der Regel zu Gewebs-Zellquellung und somit zu Zellvergrößerungen, wobei bekannt ist, daß Tumorzellen oft vergrößert sind. Auch dieser Effekt entfällt. Eine Wässerung, die nach Formalinfixierung üblich ist und zumindest zu einem unberechenbaren Substanzverlust in der PE führt, ist nach der beschriebenen Methode ebenfalls nicht erforderlich. Für den eigent lichen Schnellschnitt, auf den der Chirurg wartet, ist die Formalin fixierung zu langsam und wie dargelegt toxisch. Das beschriebene neue Stabilisationsverfahren in heißem Wasser mit gesteuert einge tauchter PE erreicht die immer gleichartige Gewebsverfestigung in Sekunden bis wenige Minuten. Die Abkühlung der heißen PE darf auch vom Mitarbeiter nicht vergessen werden. Diese rasche sozusagen in tensive Gewebsverfestigung/Stabilisation bedarf für kurze Zeit der Konzentration, Hinwendung auf die Einsendung bzw. die Probeexzision. Der Siedepunkt des Wassers schützt zwar vor Schädigung des Gewebes, aber nur so lange, wie die PE im Wasser ist. Besonders an kleinen PE, die nicht sofort in kaltes Wasser eingetaucht werden, kommt es zur raschen Wasserverdunstung mit erst mikroskopisch erkennbaren Kernauslöschungen.

Der abgekühlte Gewebsblock nun mit Stabilisationseigenschaft und relativ reichlicher originärer Substanz - strukturerhaltend - kann verschiedenen Zwecken zugeführt werden, verfestigte Organe sind insbesondere zuzuschneiden. Aservate können zurückgelegt werden. Hauptanliegen sind nun die möglichst ebenfalls nach dem Prinzip der Stabilisation herzustellenden Gefrierschnitte. Die vom gekühlten Messer mit Objektträgern abgenommenen Gefrier schnitte sollten zu keiner Zeit austrocknen. Die Färbung hat vorzugsweise mit dem bewährten Haematoxylin nach P.Mayer zu erfolgen mit Bläuen in üblicher Weise durch Wasserzugabe und Differenzieren ggf. mit heißem Wasser. Der Einschluß des mikroskopischen Präparates wurde in Karion, später wieder in Glyzerin unter nicht zu kleinem Deckglas vorgenommen.

Die Zahl der Arbeitsschritte für solche Gefrierschnitte ist wesent lich geringer als bei der Paraffinschnittherstellung, was für die Effizienz des beschriebenen Verfahrens spricht. Die Ent sorgung im Labor anfallender toxischer Substanzen wie Formalin, Xylol u. a. entfällt, da diese bei der Gefrierschnittanfertigung nicht erforderlich sind.

Die Feyrter-Einschlußfärbung dient ebenfalls der Stabilisation.

Die Fig. 1 zeigt eine bewährte Wärmeenergieeinbringung zur Stabilisation von frischen Probeexzisionen. Auch Nachfixierungen von Probeexzisionen sind in dieser Weise möglich zur "Uniformierung" des strukturmäßig vor allem vom Eiweiß bestimmten Gewebes. Kleine PE sind in der Regel in 10-20 Sekunden in kochend heißem Wasser, im Sieb flottierend, verfestigt; rascher vorbereiteter Abkühlungs effekt ist nun erforderlich. Eine 1 ccm große PE bedarf etwa 2 Minuten bis zur reproduzierend gleichmäßigen Verfestigung/Sta bilisation bei 100°C. Wärmedenaturierungen beginnen bereits ab 60°C. Der durchschnittliche Verfestigungsgrad ist dann aber geringer, was die Schneidefähigkeit auf dem Gefriermikrotom beeinträchtigen kann. Vibratoren sind zugleich für solche Stabilisationen des möglichst frischen Gewebes eingesetzt worden.

Claims

1. Gefrierschnitte von physikalisch stabilisierten Probeexzisionen, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Minuten ohne Formalin/Wässerung mit gleichmaß von frischen Probeexzisionen in heißem Wasser, insbesondere in Nutzung des Siedepunktes, ggf. in hyperbarem Wasserdampf durch gesteuerte Mikrowelleneinwirkung auf das Gewebe hergestellt werden, daß die Stabilisation der frischen Probeexzisionen mit Gleichmaß der Gewebs-Zellverfestigung zur Substanz- und Strukturerhaltung dient.

2. Gefrierschnitte von physikalisch stabilisierten Probeexzisionen nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Stabilisation frischer Probeexzisionen im hyperbaren Wasserdampf das originäre Zell- und Kern-Gewebswasser von den Mikrowellen zur Gewebsverfestigung/Stabilisation aufgeheizt wird.

3. Gefrierschnitte von physikalisch stabilisierten Probeexzisionen nach Patentanspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Mikrowellenaufheizung der Körper-Gewebszellen sowie deren Kerne/Organellen Schrumpfungen entfallen, die die mikrosko pische Untersuchung stören.

4. Gefrierschnitte von physikalisch stabilisierten Probeexzisionen nach Patentanspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß bei dem Stabilisationsverfahren von frischen Probeexzisionen zur Herstellung von Gewebsschnitten keine fremden Substanzen wie Formalin, Xylol u. a. in das zu untersuchende Gewebe, Zellaus striche und anderes hineingelangen.

5. Gefrierschnitte von physikalisch stabilisierten Probeexzisionen nach Patentanspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß solche nach Stabilisation des Ausgangsgewebes PE gewonnenen Gefrierschnitte der Kontrolle von zugehörigen mikroskopischen Paraffinschnitten dienen, um sichere/abgesicherte pathologisch-ana tomische Diagnosen wie beispielsweise Mammacarcinom der Frau zu erhalten.

6. Gefrierschnitte von physikalisch stabilisierten Probeexzi sionen nach Patentanspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß für Isotonie, Isomorphie, Substanz-und Strukturerhaltung im frischen Gewebe bzw. Körperzellen und in deren Kerne, Organellen die frischen Probeexzisionen in angepaßt schmale Reagenzgläser eingebracht werden und auf diese Reagenzgläser mit Inhalt die nach Temperatur und Zeit gesteuerte Aufheiz flüssigkeit wie Wasser (mit oberer Begrenzung Siedepunkt) einwirkt.

7. Gefrierschnitte von physikalisch stabilisierten Probeexzi sionen nach Patentanspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß eine oder zugehörig mehrere Exzisionen möglichst frischen Gewebes im Reagenzglas bei diesem Verfahren von Flüssigkeit wie Brunnenwasser, Milch oder anderes bedeckt sind für

a) Wärmeeinleitung in die Exzisionen,
b)zur Verhinderung des Verlustes von originärem Zell- und Kernwasser.

8. Gefrierschnitte von physikalisch stabilisierten Probeexzi sionen nach Patentanspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet,
daß die mit Inhalt erhitzten Reagenzgläser nach Verfestigung der Probeexzisionen in kaltes Wasser zur Abkühlung eingebracht werden, wodurch die Festlegung der originären Substanzen im Gewebe/in den Körperzellen mit deren Strukturen auch für die Gefrierschnitte, die Mikroskopie, somit für die Vorteile erbrin gende Stabilisation erreicht ist.

9. Gefrierschnitte von physikalisch stabilisierten Probeexzisio nen nach Patentanspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß die Stabilisation im Reagenzglas nach Überschichtung eben mit der großmolekularen wäßrig aussehenden Pufferlösung Tris-(Hydroximethyl-Aminome than) bei gesteuerter Hitzeeinwirkung durchgeführt wird.