DE816288C - Fluessigkeit zum Behandeln von histologischem Gewebe bei der Praeparation fuer mikroskopische Untersuchungen - Google Patents

Description

• Flüssigkeit zum Behandeln von histologischem Gewebe Bei der Präparation für mikroskopische Untersuchungen Die Erfindung betriffft die Präparation von histologischen Gewebeteilen für mikroskopische Untersuchungen.
• 1 )ie Gewebepraparierung zum Zwecke der mikroskopischen Untersuchung erfordert eine Keihe von Behandlungen des Gewebes vor dem Schneiden der Scheil)eiI aus dein Gewebestück zur Färbung und zum. Anbringen der Schiiitte auf den Objektträgern.
• Insbesondere ist es l) ei der Präparierung von Gewebe erforderlicll, tlie Gewebestücke nacheinander iii eine Reihe von flüssigen Mitteln für bestimmte Zeitabschnitte einzutauchen, und zwar zum Fixieren des Gewebes, zum Auswaschen des Fixiermittels, zum Entwässern des Gewebes, welches gewöhnlich durch Eintauchen dessell en nacheinander in alkohole oder andere Entwässerungsmittel erfolgt, dann zur Behandlung des Gewebes mit einem Klärungsmittel uid schließlich hierauf zur Einverleibung eines Einbettungsmittels in das Gewebe, wie z. B. von Paraffin, Kollodium o. dgl. nachdem das Gewebe so behandelt ist, wird es in Scheiben von der gewünschten Dicke geschnitten. Das Paraffin oder ein anderes Einbettungsmittel wird dann aus diesen Scheiben oder Schnitten in üblicher Weise durch ein Lösungsmittel entfernt. wonach die Schnitte auf die Träger gebracht und dann gefärht werden.
• Die vorliegende Erfindung befaßt sich nun mit der Entwässerung von Gewebe nach seiner Fixierung und der Hauptzweck ist dabei, bestimmte Nachteile auszuschalten, welche den früher bekannten Alethoden zur Entwässerung, sowie auch den hierbei verwendeten Entwässerungsmitteln, anhafteten.
• Die Erfindung befaßt sich nun auch mit der Behandlung von Gewebe zum Zwecke der Entfernung von Paraffin oder anderen Einbettungsmitteln aus den Schnitteii und weiterhin zum Zwecke der Färbung der deparaffinierten Schnitte oder Objektträger, wie sie gewöhnlich genannt werden, wobei unter diesem Gesichtspunkt in erster Linie verschiedene Nachteile der früheren Methoden und auch der Stoffe, welche zur Entfernung von Paraffin aus den Gewebeschnitten und im Verlaufe der Färbebehandlung verwandt wurden, beseitigt werden.
• Alkohol, Äthyl- oder NIethylalkohol, ist zur Zeit das geschätzte Lösungs- und Entwässerungsmittel in der histologischen Technik. Er wurde allein und auch in Kombination mit verschiedenen anderen Reagenzien, wie z. B. Aceton, Chloroform und verschiedenen Kohlenwasserstoffen, verwendet. In keinem Falle war jedoch seine Anwendung vollkommen zufriedenstellend. Physikalisch betrachtet ist er sehr entzündlich, außerordentlich flüchtig und er ist in einem Grade hygroskopisch, daß eine Selbstverdünnung erfolgt. Als Entwässerungsmittel und in Bedingungen seiner Wirkung auf Gewebe hat er stets eine wesentliche Schrumpfung, Verlagerung und Härtung des Gewebes verursacht, falls dasselbe ihm für einen zu langen Zeitraum ausgesetzt wurde.
• Beim Färben machten die erwähnten physikalischen Eigenschaften sich als Nachteil bemerkbar und zusätzlich noch, daß er in vielen Fällen den Farbstoff, welcher mit dem Gewebe verbunden war, abzog, tl. h. er wirkte als Entfärbe- und Differenziermittel.
• Bei der Entwässerung von Gewebe gilt die Praxis, um die Schrumpfung und Verlagerung des Gewebes herahzusetzen, das Gewebe zuerst in verdünnten Alkohol einzutauchen und dann nacheinander in Alkohol von steigender Stärke, wobei die letzte Eintauchung in reinem oder absolutem Alkohol erfolgt.
• Trotz aller dieser Vorsichtsmaßnahmen wurde jedoch die Schrumpfung und Verlagerung des Gewebes nicht in einem solchen Maße ausgeschaltet, wie es erforderlich ist, um erwünschte Ergebnisse bei der Präparierung von Schnitten zu erzielen.
• Die erwähnten und noch weitere Beanstandungen und Nachteile bei der Verwendung von Alkoholen und anderen Reagenzien, welche bisher als Entnässerungs- und Lösungsmittel in der histologischen Technik verwendet wurden, werden durch die vorliegende Erfindung, welche dieses in erster Linie erstrebt, ausgeschaltet.
• Im besonderen bezweckt die Erfindung, ein Entwässerungs- und Lösungsmittel zu schaffen, welches 1. eine Verlagerung des Gewebes ausschaltet oder zum größten Teil verringert, 2. nicht leicht verdampft, 3. nicht merkbar hygroskopisch ist, 4. unentzündlich ist und 5. nicht giftig ist.
• Die Nichtgiftigkeit des Entwässerungs- und Lösungsmittels der vorliegenden Erfindung ist ein zusätzlicher Vorteil, welcher Nachteile und Anstände ausschaltet, welche bei der Verwendung solcher Stoffe wie Methylalkohol und Dioxan bei der Gewebebehandlung auftreten.
• Das flüssige Mittel, welches gemäß der Erfindung zum Entwäsern der rohen Gewebestücke als auch bei der Behandlung der Schnitte auf den Objektträgern verwendet wird, besteht aus Diäthylenglykolmonoäthylätheracetat, CH3COOCH2CH2OCH2 CH2OC2H5, welches aus Gründen der Einfachheit im folgenden als Lösungsmittel F bezeichnet wird.
• Dasselbe ist ein bekanntes und handelsüblich verfügbares Erzeugnis. Es hat ein spezifisches Gewicht von 1,0114, einen Siedepunkt von 217.7° und ist vollkommen löslich in Wasser. Es ist nicht entzündlich, im wesentlichen unhygroskopisch und nicht giftig. Infolge seiner volsltändigen Mischbarkeit mit Wasser entwässert es Gewebe durch Ersatz des darin befindlichen \\7assers, NN im Gegensatz zu der wasserextrahierenden Wirkung von Alliollol, so daß keine Schrumpfung und Verlagerung des Gewebes auftritt, wie dies hei der Benutzung von alkohol als Entwässerungsmittel der Fall ist.
• Bei der Verwendung als Entwässerungsmittel für Gewebe enthält zweckmäßig das Lösungsmittel einen Stoff, welcher das Eindringen der Entxvässerungsflüssigkeit in das Gewebe begünstigt. Ein derartiger Zusatzstoff ist vorzugsweise Isopropanol. obwohl auch andere Alkohole (Nlethyl- oder Athylalkohol) verwendet werden können. isopro)anol ist vorzuziehen, da es weniger hvgroskopisch ist als die anderen Alkohole. I)as Mengenverhältnis von Lösungsmittel F und Isopropanol hZw. anderen Verdünnungsmitteln kann in \erhiiltnisl7liißih weiten Grenzen schwanken, z. B. von 2 Teilen Isopropanol und 6 Teilen Lösungsmittel F bis zu gleichen SIengen Propanol und Lösungsmittel F. ohne daß jedoch hierdurch eine Beschränkung ausgesprochen werden soll. Die bevorzugt zur ,\nwendung kommende Zusammensetzung nach der Erfindung besteht aus 6 Teilen Lösungsmittel F und 4 Teilen Isopropanol. Zur Vereinfachung wird diese Zusammensetzung nachstehend als Lösungsmittel FS bezeichnet.
• Bei der Anwendung des oben beschriebenenflüssigen Mittels, Lösungsmittel ES, zur Entwässerung von rohen Gewebestücken nach der Fixierung und dem anschließenden Waschen werden die Gewebestücke nacheinander in einer Serie von getrennten Bechern oder Behältern, welche dasselbe enthalten, eingetaucvht, so daß das Gewebe während der Entwässerung wiederholt in frische Eösung kommt. Die vorteilhafte Eintauchzeit in jeden Brecher mit Lösungsmittel F beträgt ungefähr 1 Stunde, wobei vorzugsweise fünf von solchen Eintauchungen von je I Stunde nacheinander erfolgen. Nach der fünften Periode werden die Gewebestücke in eine Flüssigkeit aus gleichen Teilen Löser ES und Butylacetat eingetaucht, wobei diese Eintauchung vorzugsweise in zwei getretluten Behältern unmittelbar nacheinander erfolgt und nohei jede Eintauchzeit in jedem Behälter etwa 1 Stunde heträgt. Nach der erwähnten zweiten Eintauchperiode wird das Gewebe für I Stunde in einen Becher, welcher nur Butylacetat enthält, eingetaucht. {)anach wird das Cewebe in Paraffin eingetaucht, um es schneidfähig zu machen und die erhaltenen Schnitte auf die Objektträger entsprechend der beckannten Praxis aufbringen zu können. Das aufeinanderfolgende Eintauchen wird vorzugsweise selbsttätig durch Verwendung eines automatischen Eintauchapparates, wie er in der amerikanischen 1>atentschrift 2341198 von Edwin C. NVeiskopf heschrieben ist, durchgeführt.
• Die Behandlung des Gewebes mit Butylacetat, zunächst in der Flüssigkeit, welche Lösungsmitel FS enthält, und dann in Butylacetat allein, bezweckt das Klären des Gewebes, d. h. die Entfernung des Lösungsmittels ES daraus, so daß Paraffin einverleiht werden kann, da Paraffin leichter in Butylacetat löslich ist als mit dem Lösungsmittel FS und daher wieder leichter durch Butylacetat entfernt werden kann. Es wurde auch gefunden, daß die Klärungswirkung von Butylacetat verbessert wird, wenn es zuerst dem Lösungsmittel FS bei den letzten zwei Eintauchungen zugegeben ist, wie oben beschrieben wurde. Butylacetat ist als Klärmittel vorzuziehen, weil es eine ausgezeichnete Klärwirkung besitzt und weiterhin, weil das Gewebe hierbei nicht gehärtet wird.
• Nachdem die rohen Stücke entwässert und mit Paraffin getränkt sind, wird das Gewebe in dünne Scheiben geschnitten, wozu gewöhnlich ein Mikrotom henutzt wird. Diese dünnen Schnitte werden dann auf die Objektträger aufgebracht. Diese aufgeklebten Schnitte, welche im allgemeinen kurz als Objektträger bezeichnet werden, werden dann zur Entfernung des Paraffins behandelt und anschließend gefärbt. Die Entfernung des Paraffins erfolgt gewöhnlich durch Eintauchen der Objektträger in Nylol, während die Färbung in üblicher Weise mittels Hämatoxylin- und Eosinfärbemittel für das hasophile bzw. das acidophile Material des Gewebes erfolgt.
• Das Verfahren zur Entfernung des Paraffins und zum Fällen der Schnitte wird ehenfalls zweckmäßig unter Verwendung des oben erwähnten autoniatischen Eintauchapparates durchgeführt. Das Verfahren beginnt dabei mit Schnitten, welche noch das Paraffin enthalten. Die Becher sind in Stellungen, entsprechend der folgenden Tabelle, an-

  Stellung

  der Gewebebehandlungsflüssigkeit Zeit

  Maschine

  I Xylol 2 Min.

  2 0,250/0 Jod in Lösungsmittel FS 2 Min.

  3 Lösungsmittel FS 2 Min.

  4 Destilliertes Wasser 2 Min.

  5 Haematoxylin IO Min.

  6 Destilliertes Wasser 4 Min.

  7 Lithiumcarbonat O, OI normal 2 Min.

  8 Destilliertes Wasser 2 Min.

  9 Eosinlösung 5 Min.

  IO Lösungsmittel FS 5 Min.

  II - Lösungsmittel FS 5 Min.

  I2 Lösungsmittel FS 5 Min.

  geordnet und enthalten die angegegebenen Flüssigkeiten; die Objektträger werden in diese Flüssigkeiten während der angegebenen Zeitspannen in Minuten eingetaucht.
• Nach Behandlung an der I2. Stelle werden die Schnitte entfernt und in einen Becher mit Xylol während 2 bis 5 Minuten gebracht, worauf dann die Objektträger in üblicher Weise fertiggestellt werden.
• In der oben angeführten Tabelle ist Jod als Zusatz in den Becher des Lösungsmittels FS in der Stellung 2 angegeben.
• Hierzu ist zu bemerken, daß die Verwendung von Jod vorteilhaft ist, wenn ein Fixiermittel vom Typ Zenker (2, 5 g Kaliumbichromat, 1 g Natriumsulfat, 5 g Sublimat, 5 ccm Eisessig, IOO ccm Wasser) verwendet wurde.
• Bei der Entfernung des Paraffins aus den Schnitten und bei der Färbebehandlung kann Isopropanol oder ein anderer Alkohol entfallen, so daß in diesen Fällen das flüssige ;Mittel aus dem Lösungsmittel F, d. h. Diäthylenglykolmonoäthyläteracetat, besteht, welches dann in den Bechern an Stelle des Lösers FS in den Stellungen der obigen Tabelle vorgesehen wird.

Claims (6)

1. PATENTANSPRÜCHE: I. Flüssigkeit zum Behandeln von histologischem Gewebe bei der Präparation für mikroskopische Untersuchungen, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlungsflüssigkeit als wesentlichen Bestandteil Diäthylenglykolmonoäthylätheracetat enthält.
2. 2. Flüssigkeit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigkeit noch einen kleineren Anteil Isopropanol enthält.
3. 3. Flüssigkeit nach Anspruch I und 2, gekennzeichnet durch Gehalte in einem Mengenverhältnis von etwa 2 bis 6 Teilen Isopropanol auf etwa 6 Teile Diäthylenglykolmonoäthylätheracetat.
4. 4. Flüssigkeit nach Anspruch I bis 3, gekennzeichnet durch Gehalte in einem Verhältnis von etwa 4 Teilen Isopropanol auf etwa 6 Teile Diäthylenglykolmonoäthylätheracetat.
5. 5. Flüssigkeit nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigkeit noch einen kleineren Anteil an Äthylalkohol oder Methylalkohol aufweist.
6. 6. Flüssigkeit nach Anspruch I und 5, gekennzeichnet durch Gehalte von etwa 2 bis 6 Teilen an Methylalkohol bzw. Athylalkohol oder ein Gemisch beider Alkohole auf etwa 6 Teile Diäthylenglykolmonoäthylätheracetat.