KR20010023070A - 고품질의 연속적인 재료 처리, 조직 고정-탈수-지방제거-함침 방법 - Google Patents

고품질의 연속적인 재료 처리, 조직 고정-탈수-지방제거-함침 방법 Download PDF

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Abstract

조직의 신속하고 연속적인 흐름 조직학적 처리를 위한 방법 및 장치가 개시된다. 고정, 탈수, 제거 및 함침의 단계는 한 시간 이내에 실시된다. 이를 통하여, 병리학자는 입수 후 곧바로 샘플을 평가할 수 있으며, 아마도 환자가 수술실에 있는 동안에 가능할 것이다. 조직 절편의 두께를 감소시키고, 용액 혼합물로 구성된 비-수용성 용액을 사용하고, 승온에서 교반하면서 용액을 교환하고, 진공압 하에 함침시킴으로써, 신속하고 연속적인 처리가 가능하다. 따라서, 수술 환자에게 직접적인(point-of-care) 수술 병리학이 제공된다.

Description

고품질의 연속적인 재료 처리, 조직 고정-탈수-지방 제거-함침 방법{A HIGH QUALITY, CONTINUOUS THROUGHPUT, TISSUE FIXATION-DEHYDRATION-FAT REMOVAL-IMPREGNATION METHOD}
종래 조직학에서 조직을 준비하기 위해서는, 함침시키기 전에, 고정용 인산-완충 10% 포름알데히드, 탈수용의 일련의 증가된 농도의 에탄올 및 조직에서 탈수 시약을 세척하기 위한 크실렌의 분리된 용액들에서 배양하게 된다. 이러한 공정에 필요한 시간이 보통 8시간 이상이므로, 이러한 분리 단계들-고정, 탈수, 세척 및 함침-을 이런 작업용으로 고안된 자동화된 기계 장치(미국 특허 제3,892,197호, 제4,141,312호 및 제5,049,510호의 예 참고)에서 밤새도록 실시하는 것이 통례이다. 일반적으로, 자동화된 조직 프로세서(TISSUE-TEK)에서 8시간 이상이 필요하고, 하기와 같은 조직 샘플 배치의 처리 공정이 프로그램되어 있다.
단계 용액 농도 설정시간(분) 설정온도 P/V** 교반 용액의 양
1 완충포르말린 10% 50 40℃ On On 2.2-3.2리터
2 완충포르말린 10% 50 40℃ On On 2.2-3.2리터
3 알코올* 80% 50 40℃ On On 2.2-3.2L
4 알코올 95% 50 40℃ On On 2.2-3.2L
5 알코올 95% 50 40℃ On On 2.2-3.2L
6 알코올 100% 50 40℃ On On 2.2-3.2L
7 알코올 100% 50 40℃ On On 2.2-3.2L
8 알코올 100% 50 40℃ On On 2.2-3.2L
9 크실렌 100% 50 40℃ On On 2.2-3.2L
10 크실렌 100% 50 40℃ On On 2.2-3.2L
11 파라핀 50 60℃ On On 4
12 파라핀 50 60℃ On On 4
13 파라핀 50 60℃ On On 4
14 파라핀 50 60℃ On On 4
**-압력/진공싸이클*-대부분의 실험실에서 사용되는 알코올은 90%에틸, 5%메틸 및 5%이소프로필 알코올의 혼합물이다.
이러한 통상의 방법에서, 조직 표본은 하루만에 실험실, 보건소 또는 그외 장소로부터 병리학 실험실로 보내져야 한다; 조직 표본은 밤새 준비되고; 일러야 다음날 즉, 실험실로 표본이 전달된지 거의 24시간 만에, 병리학자가 조직 절편의 현미경 검사를 토대로 진단하게 된다(도 1). 이 경우 병리학자가 외과의에게 도움이 되는 결과를 주는데 최소 하루가 지체되는데다, 필수적인 표본의 배치 공정에 의해서 요구되는 병리학 실험실에서의 작업 흐름 저해와 관련된 문제가 있다. 공정이 자동화된 경우, 밤새 장치를 가동시키는데 따른 안전문제, 장치의 고장 위험와 그에 따른 장치의 모니터 필요성, 시약이 다량으로 사용되어 버려지는 것 등과 관련된 문제가 있다. 더욱이, 이 공정에 사용되는 시약과 관련된 증기 및 독성 물질에 실험자들이 노출되는 것을 막기 위하여 고가의 장비가 필요하다. 또한, 종래의 방법에서 발생하는 다량의 폐용매 및 파라핀 잔여물이 환경을 오염시킨다.
통상의 고정 및 처리공정은 DNA, 특히 RNA 구조에 비가역적인 손상을 가져와 진단 및 조사를 위한 유전자 기술의 적용을 제한한다. 통상적인 조직 처리 공정에 의해서는 역 유전자 분석(retrospective genetic analysis)을 할 수 없으므로, 대부분의 DNA와 특히 RNA분석은 신선한 조직의 긴급 동결과 같이 재료 취급에 있어서 특별한 사전 조치가 필요하다.
파라핀 블록에서 준비된 절편과 비교하여, 동결 절편을 사용할 경우 조직학적 진단에서 여러가지 어려움이 있다: 동결 절편으로부터 준비된 슬라이드 "균일한 품질(로) … 가공처리되지 않고"; "일련의 동일 표본의 절편을 검사하는 것이 기술적으로 더욱 어렵고"; "충분히 얇은 절편을 얻고, 표본의 세부 손상을 피하기 위하여 표본을 자르는데 극도의 주의를 기울여야 하며"; 그리고 "조직 절편을 만들기 위하여 조직이 해동되거나 재동결되면, 심하게 손상되기 때문에", 모든 슬라이드는 "조직이 초기 동결 상태에 있는 동안" 준비되어야 한다(미국 특허 제3,961,097호).
진단을 목적으로 한 조직의 처리공정 및 분석에서 신속한 처리는 항상 관심의 대상이었다. 게다가, 최근에는 의료계의 초점이 조직 처리공정을 포함한 다양한 과정의 비용을 줄이는데 모아지고 있다. 조직 처리공정의 비용은 시간, 준비 및 분석을 위해 필요한 공간, 시약(공정 및 폐기 처리에 필요한 양 모두), 필요한 인원수와 관련되어 있다. 더욱 중요한 것은, 환자들 및 그들의 의사들이 치료가이드로서 병리학자들의 평가 및 진단에 의존한다는 것이다. 조직 처리공정을 완료하는데 필요한 시간을 줄이는 것은 표본을 얻은 시간과 병리학자의 기록이 외과의에게 전달되는 시간 사이에 격게 될 불안을 줄일 수 있다.
다른 이들도 조직 처리공정에 필요한 시간을 줄일 필요성을 인지하고 있으나, 통상의 방법에서 크게 벗어나지 않은 개선만이 이루어지고 있다. 조직 처리공정을 가속하기 위해, 미국 특허 제4,656,047호, 제4,839,194호 및 제 5,244,787호는 마이크로파 에너지를 이용하며; 미국 특허 제3,961,097호 및 제5,089,288호는 초음파 에너지를 사용하며; 미국 특허 제 5,023,187호는 적외선 에너지를 사용한다. 미국 특허 제 5,104,640호는 혈액 스미어를 슬라이드에 부착시키는 고정제, 안정화 시약 및 가용성 시약의 비-수성 조성물을 개시하고 있다. 그러나, 전술한 특허는 고정에서 함침까지 샘플의 연속 처리를 두시간 내에 달성하는 진단용 조직 슬라이드 준비의 전체 공정을 교시하거나 제안하지 않는다. 본 발명은 이러한 처리공정을 제공한다.
발명의 요약
본 발명의 목적은, 조직 처리공정 및 분석에 필요한 시간을 줄이고, 시간, 실험실 설비, 사용 시약의 양 및 필요한 인원수를 줄임으로써 이들의 비용을 줄일 수 있는 조직 처리공정용 조성물과 이를 이용한 장치 및 시스템을 제공하는 것이다. 이로써 현재의 관행에서 수술 중의 환자에 대한 신속한 수술 병리학적 대응으로의 전환이 가능해지며, 수술실 근처에서 병리학자가 직접 (point-of-care) 진단할 수도 있다.
고체 조직의 처리공정 및 분석에 있어서, 조직 슬라이스는 현미경 검사를 위해 4 내지 6 미크론 정도이어야 하지만, 잘라서 얻은 신선한 조직의 가장 얇은 슬라이스가 약 1mm이다(일반적인 슬라이스는 3mm정도). 현미경 검사에서 충분히 얇은 슬라이스를 생산하기 위해서, 예를 들면 마이크로톰으로 절단하여 더 얇은 조직을 얻을 수 있도록 조직을 단단히 할 필요가 있다. 본 발명은 이 조직 경화 공정을 매우 가속화하여, 통상의 밤샘 공정을 총 40분정도가 소요되는 공정으로 전환시킨다. 따라서, 본 발명자들은 병리학 실험실에서 조직을 받은 시점으로부터 2시간 이내에 마이크로톰으로 절단하기에 적합한 함침된 조직 블록을 준비하는 단순하고, 안전하고, 비용이 적게 들고, 신속하고, 신뢰할만한 방법을 개발하였다. 본 방법은 표본의 연속 흐름을 가능하게 하고, 자동화에 적합하며, 유해 가스가 있는 포르말린 및 크실렌이 필요 없고, 조직 처리공정의 표준화가 가능하며, 통상의 방법에서보다 매우 소량의 시약을 필요로 한다. 또한, 본 발명에서는 신선하거나 사전에 이미 고정된 조직을 처리할 수 있다.
본 발명에 의해, 조직 처리공정에 필요한 시간을 줄일 수 있을 뿐만 아니라, 신속한 처리에 따라 종래의 방법에 의해서 손실되었던 조직 구조 및 형상을 보존할 수 있게 되었다.
나아가, 본 발명이 개시한 방법으로 처리된 조직의 연구 결과 통상의 방법에서보다 DNA 및 특히 RNA 추출이 더욱 보호되는 것으로 나타났다. 따라서, 병원 및 그 외 장소에서 얻은 조직을 실험실에서 전달된 직후, 조직학 및 유전학 연구를 위해 처리할 수 있고, 보관된 재료는 장래에 연구 및 그 외 적용에 유용할 수 있다. 종래 기술과 비교하여 개선된 기술에서는 유전 물질의 수율, 기록 보관형 유전 물질의 안정성, 유전 물질의 크기 및 완전도, 및 유전 물질의 화학적 변형의 감소가 기대된다.
본 발명의 목적은 연속적인 처리로 조직학용 조직을 신속하게 공정 처리하기 위한 방법 및 장치를 제공하는 것이다. 여기서 "연속적인 처리"는 미세 시차의 (minutes apart) 부가 샘플로 시스템에 접근하는 것(accessing)을 의미한다. 따라서, 어느 시간에도 공정의 다른 단계에 조식 샘플들이 있게 된다. 바꾸어 말하면, 본 방법에서 표본의 연속적인 재료 처리 및 흐름은 조직 공정의 다양한 단계를 따라 있게 된다. 본 방법과 대조적으로, 통상의 방법에서는 8시간 내지 그 이상이 소요되므로, 현재 배치 공정이 필요하다. 샘플은 자동화된 장치내에 놓여 있고, 이 장치는 전체 장치 싸이클이 완료될 때까지 부가 샘플로 접근할 수 없다. 장치 싸이클의 어떤 단계에서 모든 조직 샘플들은 같은 단계에 있다.
본 발명의 다른 목적은 조직학용 조직의 신속하고 연속적인 흐름 처리공정을 위해 비-수성 시약을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 조직 공정에서 포르말린 및 크실렌과 같은 독성 물질이 필요없도록 하는 것이다.
본 발명의 제 1 실시형태에 따르면, 조직 표본이 고정, 탈수, 지방 제거된다. 사용하기 위한 적합한 혼합물은 고정제 및 탈수 시약, 바람직하게는 케톤 및 알코올을 포함하여 이루어지는 비-수성 용액이며; 알코올 대 케톤의 체적비는 약 1:1 내지 약 3:1 이 가능하다. 조직 표본은 약 25분 이내, 더욱 바람직하게는 약 15분 이내, 더더욱 바람직하게는 5분 이내로 배양된다. 배양은 바람직하게는 약 30℃ 내지 65℃, 더욱 바람직하게는 약 40℃ 내지 55℃, 더더욱 바람직하게는 약 45℃ 내지 50℃에서 한다.
본 발명의 다른 실시형태에서는, 조직 표본이 고정, 탈수, 지방 제거 및 세척된다. 본 발명의 본 실시형태에서 바람직한 용액은 알코올 및 클리어런트이다. 이 공정은 약 5분 이내에 달성될 수 있다.
본 발명의 다른 형태에서, 조직 표본은 클리어런트 및 함침 시약을 포함하여 이루어지는 단일 용액에 세척되고 함침된다. 바람직하게는, 이 공정은 약 5분 이내에 달성될 수 있다. 절단하기 전에, 함침된 조직 표본은 함침 시약에 포매(embed)시킬 수 있다.
고정, 탈수, 및 지방 제거된 조직 표본은 이어 왁스 용액에 함침될 수 있다. 조직 표본의 탈수와 일관되게, 왁스 용액은 물을 가능하면 적게 함유하는 것이 바람직하다. 따라서, 왁스 용액은 함침 전에 왁스를 가열하여 용해된 물을 증발시키고, 감압하여 가스를 제거하여 준비한다. 조직 표본의 함침은 조직 표본으로부터 용매를 제거하고, 왁스 용액을 조직 표본으로 넣기 위해 대기압보다 낮은 압력 및 승온하에서 실시한다. 진공은 확산을 가속화하고, 샘플 내에 존재할 수 있는 용매의 증발 온도를 낮추어 함침 시간을 감소시킬 수 있다. 왁스 용액은 가스를 제거한 파라핀 및/또는 광유를 포함하여 이루어질 수 있다. 조직 표본의 함침은 약 15분 이내; 바람직하게는 약 10분 이내로 완료될 수 있다. 절단하기 전에, 함침된 조직 표본은 함침 시약에 포매되어 조직 블록을 형성할 수 있다.
본 발명의 또다른 실시형태에서는 조직 표본을 고정에서 함침까지 일련의 용액들내에서 처리하며, 이 용액들 중 적어도 일부는 하나 이상의 작업(고정, 탈수, 지방 제거, 및 함침)을 동시에 수행하는 혼합물이다. 혼합물은 고정제, 탈수 시약, 및 지방 용매(예를 들어, 케톤 및 알코올)를 포함할 수 있다. 다른 용액은 고정제, 탈수 시약, 지방 용매, 및 클리어런트(예를 들어, 알코올 및 크실렌)를 포함할 수 있다. 다른 용액은 클리어런트 및 함침 시약(예를 들어, 크실렌 및 파라핀)을 포함할 수 있다. 조직 표본은 다른 사슬길이의 혼합물(예를 들어, 상온에서 액체인 광유 및 고체인 파라핀)을 포함하여 이루어지는 왁스 용액에 함침될 수 있다. 바람직하게는, 혼합물은 둘 이상의 서로 다른 화학물질(예를 들어, 두가지 알코올)을 포함한다.
비-수성 혼합물(예를 들어, 고정제-탈수 시약-지방 용매, 고정제-탈수 시약-지방 용매-클리어런트, 클리어런트-함침 시약), 조직 표본 안에 일하게 가열하기 위한 에너지 공급원으로서 마이크로파 에너지, 및 진공 공급원을 이용한 감압으로 공정 시간을 줄일 수 있다. 조직 표본으로의 용액의 확산 및 화학적 교환은 기계적 교반, 가열, 감압, 또는 이들의 조합으로 촉진할 수 있다.
상기 단계들은 고정 강화제, 계면 활성제, 또는 이들 모두를 공정에 사용되는 용액에 첨가하여 가속할 수 있다. 고정 강화제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 모노- 및 디메틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 폴리비닐 피롤리돈 등이 가능하고; 사용되는 중합체의 평균 분자량은 약 100 내지 약 500, 바람직하게는 약 300 분자량이 가능하다. 계면 활성제는 디메틸 술폭사이드(DMSO), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(예를 들어, TWEEN 80), 소디움 디메틸 술포숙시네이트, 약한 가정 세제 등이 가능하다.
고정제는 케톤(예를 들어, 아세톤, 메틸 에틸 케톤), 알데히드(예를 들어, 아세틸알데히드, 에탄올, 이소프로판올), 아세트산, 납 아세테이트 및 시트르산염, 수은염, 크롬산 및 이의 염, 피크르산, 오스뮴 테트록사이드 등이 가능하다.
조직 표본은 메틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 알코올, 프로필 알코올, 부탄올, 이소부탄올, 에틸 부탄올, 디옥산, 에틸렌 글리콜, 아세톤, 아밀 알코올 등으로 탈수할 수 있다.
지방은 조직 표본으로부터 예를 들어, 아세톤, 클로로포름 또는 크실렌과 같은 유기 용매로 제거할 수 있다.
클리어런트는 크실렌, 리모넨, 벤젠, 톨루엔, 클로로포름, 석유 에테르, 이황화탄소, 사염화탄소, 디옥산, 정향유(clove oil), 삼나무유(cedar oil) 등이 가능하다.
조직 표본은 파라핀, 광유, 비-수용성 왁스, 셀로이딘, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알코올, 아가, 젤라틴, 니트로셀룰로오스, 메타크릴레이트 수지, 에폭시 수지, 그 외 가소성 매질 등에 함침 및/또는 포매될 수 있다.
본 발명의 명세서에 있어서, "조직 표본"은 개시된 방법으로 공정처리할 수 있는 조직의 단편이다. 또한 생물학적 액체(예를 들어, 복수, 혈액, 늑막 삼출물)로부터 단일 세포, 또는 고체 장기의 흡출 또는 신체 강(cavities)의 세척으로부터 얻은 세포 부유물을 지칭할 수 있다. 단일 세포는 처리하기 전에 침강 또는 부력(byouant) 원심 분리로 펠렛을 만들 수 있다.
본 발명의 방법은 특히 세포-세포 접촉, 조직 구성, 장기 구조, 또는 이들의 조합이 보존되어야 하는 조직 표본에 적합하다. 이러한 표본은 가장 작은 치수에서 바람직하게는 약 3mm이내, 더욱 바람직하게는 약 2mm이내, 더더욱 바람직하게는 약 1.5mm이내, 그리고 가장 바람직하게는 약 1mm이내의 조직 슬라이스이다.
조직 표본은 신선하거나, 부분적으로 고정(예를 들어, 2-3시간 동안 10% 포르말린에서 고정)되거나, 고정(예를 들어, 10% 포르말린 또는 그 외 고정제에서 밤샘 고정)된 것일 수 있다. 상기한 발명에 따르면, 고정에서 함침까지 조직 표본 처리공정은 약 2시간 이내, 바람직하게는 약 90분 이내, 더욱 바람직하게는 약 1시간 이내, 더더욱 바람직하게는 약 45분 이내, 그리고 가장 바람직하게는 약 30분 이내가 소요된다. 조직 표본이 고정 또는 부분적으로 고정된 것이면, 이에 따라 공정 시간은 더 줄어들 수 있다. 조직은 수용액 속에서 수술실에서 병리학 실험실로 이동될 수 있다; 이러한 이동 용액은 수성 완충액 및 상기 비-수성 혼합물의 동일 용적량으로 구성될 수 있다.
함침에 이어, 조직 표본은 포매되어 블록을 생성할 수 있다. 조직 표본을 포매하는데 사용된 시약은 함침에 사용한 동일 물질을 사용하는 것이 바람직하나, 다른 함침 시약을 사용할 수도 있다. 블록 조직 표본은 마이크로톰에 올려져 약 1미크론 내지 약 50미크론, 바람직하게는 약 2미크론 내지 약 10미크론의 조직 절편을 생성할 수 있다. 조직 절편은 조직 화학 착색, 항체 결합, in situ 핵산 혼성화/증폭, 또는 이들의 조합을 위해 더욱 처리될 수 있다. 그리고 나서, 조직 표본은 일반적으로 현미경으로 검사되지만, 세포의 특성을 검사하는 다른 기술을 사용하여 공정된 조직 표본을 검사할 수도 있다(예를 들어, 자동화된 세포 계산, 방사능 사진, 핵산의 전기영동).
본 발명은 고정에서 함침까지 신속하고 연속적인 흐름의 현미경 검사용 조직 처리 공정에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 의사가 조직 표본을 입수한 시간부터 병리학자가 조직 절편를 현미경 검사하여 진단한 시간까지 약 24시간이 소요됨을 보이는 흐름도이고,
도 2는 본 발명으로 병리학자의 진단이 조직 표본을 제공한 의사에게 약 2시간 안에 이용될 수 있음을 보여주는 흐름도이고,
도 3은 본 발명에 따라 제공되는 조직 처리 설비의 개략 평면도이고,
도 4는 본 발명의 장치 및 시스템의 일부로서 제공되는 일반적인 셰이커 조를 도시한 것이고,
도 5는 본 발명의 장치 및 시스템의 일부로서 사용하기 위한 마이크로파 오븐의 예를 도시한 것이고,
도 6은 본 발명의 장치 및 시스템의 일부로서 제공되는 파라핀 조의 예를 도시한 것이고,
도 7은 본 발명의 다른 실시형태에 따라 제공되는 마이크로파/함침 유닛의 개략도이고,
도 8은 본 발명의 다른 일반적인 실시형태에 따라 제공되는 슬라이싱 가이드의 개략도이고,
도 9는 본 발명의 다른 실시형태에 따라 제공되는 조직 클램프 및 슬라이싱 어셈블리의 절단면도이고,
도 10은 본 발명의 다른 실시형태에 따라 제공되는 조직 홀더의 개략도이고,
도 11은 작은 조직 샘플을 수용하기 위한 본 발명에 따라 제공되는 조직 카세트의 개략도이고,
도 12는 본 발명의 일 실시형태에 따른 조직 카세트를 구비한 조직 수용 및 이송 단지를 도시한 것이고,
도 13A 내지 13B는 각각 처리 조직 표본에서 얻은 DNA 및 RNA의 아가로우즈 겔 전기영동 결과를 도시한 것이다. 도 13A 에서, 레인 1은 분자량 표준물을 함유하고, 레인 2는 본 발명에 따라 처리된 조직 표본의 희석 시료를 함유하고, 레인 3-4는 본 발명에 따라 처리된 조직 표본의 DNA 시료를 함유하고, 레인 5-6은 통상의 방법에 따라 처리된 조직 표본의 DNA 시료를 함유한다. 도 13B에서, 레인 1, 4 및 6은 블랭크이고, 레인 2-3은 통상의 방법에 따라 처리된 조직 표본으로부터 얻은 시료이고, 레인 5는 본 발명에 따라 처리된 조직 샘플로부터 얻은 RNA 시료를 함유하고, 레인 7은 대조 RNA를 함유한다.
발명의 상세한 설명
신속 및 연속적인 조직의 조직학적 처리 방법 및 장치를 개시한다. 고정, 탈수, 지방 제거 및 함침 단계를 약 두 시간 안에 실시할 수 있다; 이를 통하여, 병리학자는 시료를 얻은 후 단시간, 심지어는 환자가 수술실 또는 회복실에 있는 동안에 이를 평가할 수 있다. 병리학적 진단에 필요한 시간을 단축함으로써 환자의 불안을 줄일 수 있다. 신속, 연속적 처리는, 조직 표본의 두께를 줄이거나, 비-수용성 혼합물 용액을 사용하거나, 승온에서 교반을 통하여 용액을 교환하거나, 조직 및 용액에 마이크로파를 조사하여 균일하게 가열하거나, 진공압하에 함침시키거나, 이들을 조합함로써 가능하다.
함침 전 조직을 만들기 위하여, 고정, 탈수 및 지방 제거가 필요하다. 이러한 단계를 용이하게 하기 위해서는, 조직을 처리 전에 적당한 크기로 자르고, 이 조직 블럭을 보유하며 고정, 탈수, 지방 제거 및 함침용 용액 간에 이동을 쉽게 하는 카세트를 사용한다.
고정하면 조직 표본이 경화되고, 단백질을 가교결합하고 세포 변성을 억제함으로써 세포 형태를 보존할 수 있다. 화학적 고정을 하지 않는다면, 내인성 효소가 대사작용하여 세포를 용해하고, 조직 미세구조가 변형될 것이다. 이러한 고정제로는 케톤, 알데히드, 아세트산, 중금속, 크롬산, 피크르산 또는 오스뮴 테트록사이드가 있다. 고정이 부적절한 경우에는 조직구조의 비연합(disassociation), 조직 절편에 버블, 염색의 불균일 및 저하 , 세포 찌그러짐, 세포질 뭉침, 응축 및 핵 염색질의 구별 모호함과, 적혈구의 자가융해/용혈이 나타날 수 있다.
탈수하면 조직 표본에서 물이 제거되어 경화가 촉진된다. 또한, 조직 표본 내 물을 탈수제로 대체하면, 이어서 탈수제를 함침에 사용되는 재료로 대체하기 용이하다. 이러한 용액 교환은 탈수용 휘발성 용매를 사용하여 촉진된다. 탈수제는 저분자량 알콜, 케톤, 디옥산, 알킬렌 글리콜, 또는 폴리알킬렌 글리콜이 가능하다. 표본을 탈수하지 못하면, 부적절한 함침, 절단시 바람직하지 못한 조각(ribbon) 형성, 조직 절편의 단열(clefts), 구조의 분열, 조직 절편 내 물의 결정 및 염색성 저하가 나타날 수 있다.
지방은 세척 및 함침을 막기 때문에 조직 표본 안의 지방은 용매를 사용하여 제거한다. 지방 제거가 적절하지 못하면, 조직 절편의 인공산물이 스프레딩되고, 조직 절편이 주름잡히고, 염색성이 나빠질 수 있다.
선택적으로, 조직 표본을 세척 한다. 클리어런트는 조직 표본에서 탈수제를 추출하여, 불투명도를 감소시킨다. 클리어런트의 예로는 크실렌, 리모넨, 벤젠, 톨루엔, 클로르포름, 석유 에테르, 이황화탄소, 사염화탄소, 디옥산, 정향유(clove oil), 삼나무유(cedar oil)가 포함된다.
최종적으로, 조직 표본이 적당히 고정 및 탈수되면, 왁스, 셀로이딘, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리비닐 알콜, 아가, 젤라틴, 니트로셀룰로오스, 메타크릴레이트 수지, 에폭시 수지 또는 다른 플라스틱과 같은 시약을 사용하여 경화시킨다. 함침된 표본을 블록 안에 넣어, 마이크로톰 나이프로 10 미크론 이하의 절편으로 만들기 전에, 조직 표본을 경화하여 세포 형태를 적당히 보존해야 한다. 바람직한 함침 재료는 시판 왁스 조성물, 융점이 다른 왁스 혼합물(예를 들어, 액상 광물유 및 고형 파라핀), 초자형질(paraplast), 바이올로이드, 엠베돌, 플라스틱 등이다. 본 명세서에서 파라핀을 예를 들어 선택하여 사용한 것은 저렴하고, 취급이 쉽고, 이런 재료를 사용하여 제공되는 구조가 밀착되어 조각 절단이 용이하기 때문이다.
조직 표본 처리가 불완전한 경우, 마이크로톰 나이프로 절단한 절편은 망가지거나, "파열(exploded)"된다. 포매된 조직 블록이 너무 연하거나 단단하고, 절편의 압착량이 포매 용제와 상이하고, 절편이 무르고, 조직 조각이 형성되지 않거나 구부러지고, 절편이 부서지거나 찢어지고, 적혈구가 용해되고, 세포질이 부서지고, 염색질이 응축되고, 핵인의 호염기성 염색이 일어나고, 세포가 찌그러지고, 인공 산물이 스프레딩되고 모스 이튼 효과(moth-eaten effect)가 나타나는 문제점 중 하나 이상이 생길 경우, 조직 처리는 실패이다.
유리 슬라이드 상의 왁스-함침 절편에서, 왁스는 염색 또는 면역조직화학처리 이전에 용융되어 제거될 수 있다. 조직 절편은 다시 수화한 후, 염료 또는 항체를 사용하여 하기와 같이 분석한다. 염색 완료 또는 조직화학 반응 후, 슬라이드는 커버 글라스를 덮어 현미경으로 관찰할 수 있다. 이와 달리, 염색 또는 항체 장식 표본을 세포 혈구 계산용 기구를 사용하여 검사할 수 있다. 조직 블록은 기록의 목적이나 이후 역 연구를 위하여 보관할 수 있다.
본 발명은 처리 조직으로부터 핵산, DNA 또는 RNA를 얻어 사용할 수 있다. 따라서, 임상 병리학 실험실에서 통상 수집되는 표본으로 유전 연구가 가능하다. 이러한 기술을 결합하면 그 파워가 상당할 것이다. 염색 또는 면역조직화학을 사용하여 하나의 절편을 분석하고, 인접한 절편에서 핵산을 얻어 유전 분석 함으로써, 조직학적 관찰 결과를 유전학과 연계시킬 수 있다. 예를 들어, 같은 절편 중의 병든 영역과 정상인 영역을 비교하여 유전적 차이(예를 들어, 돌연변이, 전사 수준)를 감지할 수 있고, 여러 시점에서 시료를 취하여 유전적 차이를 비교하여 병의 진행과정을 알 수 있고, 1차 암으로부터 전이까지의 유전적 차이의 축척 사항을 따라 종양 진행정도를 평가할 수 있다.
본 발명에서는 여러 특징이 두드러진다. : (a) 처리 전에 조직을 얇게 슬라이싱; (b) 조직 표본의 연속 투입 및 시스템을 통한 연속적 흐름; (c) 용액들(즉, 비수용성 용액들)로부터 물의 제거; (d) 고정, 탈수, 지방 제거, 세척, 및 균일 가열(예를 들어, 마이크로파 에너지)을 통한 조직 함침; (e) 고정-탈수-지방 제거, 고정-탈수-지방 제거-세척, 및 세척-함침용 혼합 용액들; 및 (f) 탈기된 함침 시약을 사용한 감압 하의 조직 함침. 이러한 특징으로 인하여, 본 발명은 단순하고, 실제적이며, 실시가 용이하고, 자동화하여 다루기 쉽다.
헤마토실린-에오신 염색은 조직학 연구에 통상적으로 사용되며, 병리학자들은 비교용 표준물로 생각할 수 있다. 또한, 본 발명은 트리크롬, 레티큘린, 뮤시카르민을 포함하는 다른 염료, 및 Thompson 문헌(Selected Histochemical and Histopathological Methods, C.C. Thomas, Springfield, Illinois, 1996), Sheehan and Hrapchak 문헌(Theory and Practice of Histotechnology, C.V. Mosby, St. Louis, Missouri, 1973) 및 Bancroft and Stevens 문헌(Theory and Practice of Histological Techniques, Churchill Livingstone, New York, New York, 1982)에 기재된 바와 같은 탄성 염료와도 사용할 수 있는 것을 밝혀졌다. 완결에 단지 5분이 소요되는 Fisher Scientific의 신속한 염색 방법도 사용할 수 있지만, 상기 염색 방법은 30분 내지 수 시간 걸려 완결된다.
부검, 생체검사(예를 들어, 내시경 검사) 또는 수술을 통하여 조직을 얻을 수 있다. 암의 수술시, 염색 조직 절편으로부터 병리학적 진단을 제공하는 능력은 수술실에서 환자를 옮기기 전에 사용 가능한 정보를 의사에게 제공할 것이다. 예를 들어, 병리학자가 암이 절제된 조직에만 한정되어 있다고 진단하면, 의사는 치료를 완화하고 주변의 건강한 조직을 남겨둘 수 있을 것이다. 이와 달리, 병리학자가 암이 절제된 기관에만 한정된 것이 아님을 알아내면, 환자가 수술실에 있는 동안에 더욱 적극적으로 수술 치료가 가능할 것이다.
본 발명으로 20,000개 이상의 조직 샘플을 성공적으로 처리하였는데, 뇌, 유방, 암(예를 들어, 창자, 비인강, 유방, 폐, 위), 연골, 심장, 신장, 간, 림프종, 수막종, 태반, 전립선, 흉선, 편도, 배꼽, 자궁)이 포함된다. 석화된 조직(예를 들어, 뼈, 이)은 본 발명으로 처리하기 전에 탈석회화해야 한다. 예를 들어, Stephens Scientific(Allegiance Healthcare Supply, catalog no. 1209-1A)으로부터의 염산/에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액을 사용하여 제조자의 지시사항에 따라 조직을 탈석회화 수 있다.
본 발명으로 처리된 조직 절편은 또한 면역조직화학에 사용할 수 있다. 본 발명은, 고정제를 선택하여 특정 항원의 회복 및 보존을 최적화할 수 있으므로, 항원이 회복 및 보존된 조직 표본을 제공한다. 비-특이 결합 부위를 차단하고, 항원을 특이 항체(예를 들어, 1차 항체)에 결합시키고, 비-결합 항체를 제거한다. 프로브 또는 시그널 발생 잔기로 라벨링하면, 1차 항체를 바로 검출할 수 있으나, 1차 항체에 특이적으로 결합하는 단백질(예를 들어, 2차 항체)에 프로브를 부착시키는 것이 바람직하다. 2차 항원은 1차 항체의 일정한 중쇄 또는 경쇄의 불변부위에 대하여 생성될 수 있다. 이는 항원-항체 컨쥬게이트를 통하여 발생되는 시그널을 증폭하는데, 각각의 1차 항체가 많은 2차 항체들과 결합하기 때문이다. 이와 달리, 비오틴-스트렙타비딘과 같은 다른 특정 상호작용을 통하여 증폭이 일어난다. 적은 체적으로 항체 결합되므로, 비싼 시약을 적게 사용할 수 있고, 고도의 결합율을 유지할 수 있다. 이러한 적은 체적은 가습 챔버에서 인큐베이팅함으로써 적게 증발된다. 시그널 발생 잔기는, 이와 같은 경우가 아니면 조직 내에 존재하지 않는 효소가 바람직하다. 예를 들어, 알칼라인 포스파타아제 및 호오스래디시(horseradish) 퍼옥시다아제를 2차 항체에 부착시키거나, 스트렙타비딘에 컨쥬게이트할 수 있다. 이들 효소에는, 가시적으로 검출이 가능한 색원체(chromogenic), 형광 또는 인광 생성물을 얻을 수 있는 기질을 사용할 수 있다.
항원 염색 패턴은, 대조 염색을 통하여 밝혀진 세포 구조의 배경 하에 항원의 발현을 알아내기 위하여 사용할 수 있다. 항원 발현으로, 세포 또는 조직 형태, 발육상 단계, 종양 전조 마커, 퇴행성 대사 과정 또는 병원균으로 인한 감염을 확인할 수 있다.
항원-항체 결합은, 방사성, 형광 또는 콜로이드 금속 탐침에 오토라디오그라피, 에피플루오로레슨트 분광분석, 또는 전자 현미경을 각각 사용하여 가시화할 수도 있다. 유사한 탐침을 사용하여, in situ 혼성화로 조직 절편 내 핵산을 검출함으로써, 유전적 돌연변이 또는 전사를 확인할 수 있다. 이와 달리, 핵산(DNA 또는 RNA)을 조직 절편으로부터 추출하여, 블로팅으로 즉시 분석하거나, 증폭 후 유전 분석할 수 있다.
돌연변이는 점라인(germline)일 수 있으며, 질환의 유전성 경향을 알아보기 위하여 사용할 수 있다. 돌연변이는 체세포가 될 수 있으며, 질환의 병원론에서 유전적 변형을 결정하기 위하여 사용할수 있다. 질환은 대사성 또는 신경학적 질환, 악성 종양, 발육상 결함이 될 수 있으며, 또는 감염성 물질에 의해 발병될 수 있다. 본 발명으로는 단순한 절차 및 실온 저장을 통하여 유전 분석용 재료가 보존된다.
본 발명은, 통상의 방법으로 처리된 조직보다 평균 분자량이 큰 핵산이 다량 수득되는 조직을 보존할 것으로 예상된다.
본 발명에 따라 제공되는 조직 처리용 시스템의 일예에 의하면, 예를 들어, 단일 조직 처리 유닛 또는 영역에 일련의 조직 처리 스테이션들이 제공된다. 비제한적인 예로서, 적당한 조직 처리 설비가 도 3에 도시되어 있다.
조직 처리 설비 등에서 실시 가능한 처리 제 1 단계는, 경화 및 최종적으로 검사하기에 적당한 조직 샘플을 만드는 것이다. 일반적으로, 관심 대상이 되는 조직의 슬라이스를 만든다. 두께 약 1 내지 3mm의 가능한 한 미세한 슬라이스를 얻는데, 1 내지 2mm가 바람직하다. 처리 시간은 처리 중인 조직 샘플의 크기에 비례한다. 조직 슬라이스를 조직 카세트에 넣어, 바로 다음 처리 단계들을 진행한다. 이어서, 조직 카세트를 본 발명에 따라 제공되는 제 1 용액에 넣는다.
실시예에서, 카세트(10)를 제 1 용액(14)이 담긴 통상의 비커(12)에, 바람직하기는 상기 처리가 실질적으로 연속되는 경우 단독으로, 또는 제한된 수의 다른 유사한 조직 카세트와 함께 넣을 수 있다. 이어서, 도 4에 도시한 바와 같이, 비커(12)를 셰이커 조(16)에 넣고 부드럽게 교반 및 가열한다. 이러한 목적으로, LAB-LINE/DUBNOFF 인큐베이터-셰이커조를 사용하였다. 조직 샘플이 노출되는 수분을 최소화하고, 궁극적으로는 조직 샘플을 탈수하는 것이 목적이므로, 셰이커 조(16) 안에 온도 전도액(18)으로서 물보다는 글리세린을 사용한다. 글리세린을 사용하면, 글리세린이 열 에너지의 효과적인 전도체이고 증발되지 않는다는 장점이 있다. 증발되면 바람직하지 못하게도 조직이 처리되는 환경에 수분이 증가되고, 주기적으로 보충해 주어야 한다. 글리세린을 사용하면 대체도 필요없고, 주변환경에 수분이 증가되지도 않아 가장 바람직하다. 이러한 처리 단계에서, 조직 샘플(카세트(10) 내)를 셰이커 조(18) 안의 제 1 용액에 약 3-15분동안 넣어둔다.
셰이커-조 단계동안 추가 교반하는 것도 바람직하다. 현재, 외부 펌프(A)(도 3)에, 내용물을 버블링한 후 교반하기 위하여 이로부터 용액 비커(12) 또는 다른 리셉터클로 삽입되는 튜브(도시하지 않음)가 제공된다. 폭기 확산 노즐 또는 플레이트를 제공하여, 필요한만큼 또는 바람직한 정도로 용액을 더욱 균일하게 교반한다.
조직 카세트(10) 및 제 1 용액 함유 비커(12)를 위쪽으로 바람직하게 배치하기 위하여, 통상의 셰이커-조를 변형하여 가로 와이어 또는 스테이(20)(예를 들어, 조직 카세트 함유 비커(12)가 배치될 수 있는 5개의 길이방향 채널을 정의하는 4개의 와이어 등)을 제공하였다. 따라서, 예를 들어, 시료 함유 비커(12)는 규칙적으로 셰이커-조(18)에 첨가되어 충분히 처리될 수 있으며, 충분히 처리된 조직 샘플은, 새로운 시료를 셰이커 조의 왼쪽 말단에 첨가하고 충분히 처리된 시료를 이의 오른쪽 말단으로부터 이동시킴으로써, 하기와 같이 더욱 처리하기 위하여 이로부터 차례로 이동될 수 있다.
이어서, 조직 샘플 카세트(10)을 일련의 액체들에 노출시키면서 이와 동시에 교반하고, 마이크로파를 조사한다. 현재 제시된 실시형태에서는, 도 3에 도시된 바와 같이 세 개의 마이크로파 유닛이 제공되어 있으며, 이들은 각각 조직 샘플 함유 카세트가 일정 기간동안 침지되는 다른 용액을 갖는다. 이와 달리, 단일 마이크로파 에너지 공급원이 제공될 수 있다. 그러나, 이러한 경우, 조직 카세트를 수용하도록 각 용액을 연속 배치해야 한다. 단일 조직 샘플에서, 이와 같이 용액을 배치 및 대체하면 조직 처리 사이클 기간이 크게 증가되지 않으나, 다수의 용액을 수용하는 단일 마이크로파를 사용하면, 연이은 시료의 처리 연속성이 방해될 것임을 예상할 수 있다. 실제로, 일련의 마이크로파 유닛이 제공되는 경우, 주어진 조직 샘플이 한 마이크로파로부터 다음 용액을 갖는 다음 마이크로파로 이동될 때, 다음 조직 샘플이 제 1 마이크로파 유닛에 수용될 수 있다. 따라서, 개별 용액 각각을 위하여 하나의 유닛을 제공한다는 의미는, 선행 처리 시료의 마이크로파 처리 단계가 모두 완결되는 동안, 다음 조직 샘플을 보류할 필요가 없다는 의미이다. 그러나, 상기한 연속성이 방해되는 경우, 도시된 세 개의 마이크로파 유닛은 둘 또는 하나로 감소될 수 있는 것으로 이해해야 한다. 유사하게, 인력, 장비, 공간 요건 등의 포텐셜 감소에 대한 처리 연속성의 균형상 필요하거나 바람직하다면 상기 처리에 다른 단계들을 조합할 수 있다. 이러한 더욱 콤팩트한 유닛의 예는 도 7을 참조하여 하기에 더욱 상세히 설명한다.
도 5를 참조로, 조직 처리용 마이크로파 유닛(22)의 예를 도시한다. 마이크로파 조사를 위하여, 현재 Energy Beam Sciences, Inc.제 실험실 마이크로파 오븐을 사용한다. 출원인은 H-2800 및 H-2500의 두개의 마이크로파 프로세서 모델을 사용하였다. 각 모델 또는 다른 유사한 이러한 시스템을 사용할 수 있다. 예로, Pyrex 또는 다른 투명한 마이크로파 액체 리셉터클(24)을 사용하여, 세 개의 마이크로파 유닛에 각각 본 발명에 따라 제공되는 제 2, 제 3 및 제 4 용액을 각각 수용한다(도 3). 온도 탐침(26)을 용액에 넣어, 각 조의 온도가 소정 범위 내에 있도록 한다. 또한, 교반하여 조직 처리를 촉진하기 위하여 폭기한다. 출원인이 사용한 마이크로파 유닛에는 폭기용 튜브(28)이 포함된다. 단일 튜브를 조 내에 삽입할 수 있으나, 더욱 균일하고 완전하게 교반하기 위하여, 가스 튜브(28)와 함께, 확산 플레이트 또는 노즐 헤드(상세히 도시하지 않음)를 교반 버블을 확산시키기 위하여, 예를 들어 용액 전체를 균일하게 교반하기 위하여 용액 리셉터클 직경 중 실질적으로 일부를 가로질러 제공하는 것이 바람직하다. 이러한 확산 플레이트 및 노즐은 공지되어 있으며, 예를 들어 용액 리셉터클의 베이스에 제공될 수 있다.
통상 조직 처리 절차 중 일부로서 파라핀이 탈기된다. 탈기를 통하여 파라핀으로부터 유기 용매가 제거된다. 이러한 방법을 촉진하기 위하여, 그리고 이 시스템에 파라핀을 재사용하기 위하여, 연속 탈기를 제안한다. 이는 640mmHg에서 도포된 Pyrex 32 내에 진공을 유지하여 실시한다.
마이크로파를 조사하는 연속 3 단계 후, 조직 샘플 카세트(들)를 도 6에 도시된 바와 같이 파라핀 조에 넣는다. 현재, 도포된 Pyrex 단지 (32) 안에 세 개의 파라핀 조 스테이션(비커)(30)을 포함하여 이루어지는 파라핀 조가 제공되어 있다. 온도를 조절할 목적으로, Pyrex 단지(32)를 예를 들어 Poly Science 브랜드 수조(34)에 넣는다. 그리이스 등을 리드 및 단지 상의 플랜지 내부 가장자리에 적용함으로써, 리드 및 단지 간에 밀폐 연결이 가능하고, 이어서 리드 내에 제공된 연장 호오스 연결기(36)를 통하여 진공화될 수 있다. 적당한 이러한 Pyrex 브랜드 단지로 Fisher Scientific 제를 사용한다. 출원인은 Model No. 01-092-25를 사용하였다. Pyrex 단지 (32) 안을 진공화하기 위하여, 통상의 압력/진공 펌프(38)를 차례로 커넥터(36)에 연결되어 있는 튜브(40)에 연결한다. 이러한 적당한 전력 작동 펌프로 Fisher Scientific 제를 사용할 수 있으며, 예를 들어 100 psi 맥스를 갖는다. 파라핀 조 단계에서 진동 교반, 초음파를 통하여 교반하는 것이 바람직하며, 폭기를 통하여 교반하는 것도 가능하다.
이어서, 조직 샘플을 포매하여야 한다. 이러한 목적으로, 통상의 Miles/Sakura제, 예를 들어 모델명 4708인 Tissue-Tek 포매 콘솔 시스템(I)(도 3)을 사용한다.
이어서, 포매된 조직 샘플을 마이크로톰(L)(도 3)을 사용하여 통상의 방법으로 절단하고, 부유시켜(M) 배치한다. 출원인은 Leitz 1512 마이크로톰 및 lipshaw Electric Tissue Float Model 375를 사용한다.
슬라이스를 슬라이드 위에 배치한 후, 슬라이드를 가열하여 파라핀을 제거한다. 출원인은 Fisher(K) 제 Isotemp Oven 300 시리즈를 사용하였다(도 3).
이어서, 슬라이드를 염색하였다. 염색 처리를 촉진하기 위하여, 자동 염색기(automated stainer: O)(도 3)를 사용하여 인원수 및 소요 시간을 감소시키도록 제안한다. 불-연속 처리시는 배치 내 슬라이드를 염색하는 Sakura 다양화 염색기 DRS-601를 사용할 수 있다.; 이와 달리, 왁스 제거 단계를 함유하는 Leica 자동 염색기 XL을 사용하여 연속 처리함으로써, 오븐 내에서 별도로 인큐베이션하는 것을 생략할 수 있다. 이어서, 고정 및 염색 조직 샘플은 예를 들어, Tissue-Tek 커버슬리퍼[제조업자 번호 4764(R)]를 사용하여 덮는다(도 3).
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 탈수 및 함침 실시용 시스템은 일련의 개별 유닛들이 될 수 있다. 이와 달리, 상기한 바와 같이, 하나 이상의 단계들을 단일 처리 성분 또는 유닛으로 실시할 수 있다. 상기 논의된 것처럼, 제공되어 있는 유닛 및 각 유닛으로 실시되는 단계들의 수는 처리 유닛의 연속성에 영향을 준다. 따라서, 체적이 적은 환경에서는, 다수의 조직 처리 단계를 실시하기 위한 단일 유닛이 유리하며, 이는 조직 처리 연속성에 크게 영향을 주지 않을 것이다. 체적이 큰 시스템 환경에서는 둘 이상의 유닛인 것이 바람직하다.
조합된 유닛(42)의 예를 도 7에 도시한다. 조합 유닛(42)는 사실상 두 서브유닛; 마이크로파 프로세서 유닛(44) 및 함침기 유닛(46)를 포함한다. 마이크로파 프로세서 유닛(44)는, 용액 A, 용액 B, 용액 C에서 처리되는 조직을 계속적으로 용액에 담그기 위하여 제공되며, 각 경우에 용액을 교반하고, 조직을 마이크로파 에너지에 노출시킨다. 따라서, 도시된 실시형태에서, 예를 들어 하나 이상의 조직 카세트(10)을 넣을 수 있는 하나 이상의 트레이(50)를 수용하기 위한 용기(48)가 제공된다. 용기(48)는 유체를 통하여 조직 탈수용 용액의 각 공급원에 연결되어 있다. 따라서, 일단 조직 카세트(들)를 개별 트레이(들)(50)에 위치시키면, A 용액은 용기(48)로 흐르게 되고, 예를 들어 폭기 튜브(도 7에 도시하지 않음)를 통한 교반과 동시에 마이크로파 에너지가 이에 적용된다. 충분한 시간동안 노출 후, A 용액을 배출하고, 조직 카세트를 B 용액 또는 A 용액 및 B 용액 혼합액으로 플러싱하여 실질적으로 잔류 용액 A를 제거하는 것이 바람직하다. 이어서, B 용액을 용기(48)에 공급하여, 일정 기간동안 다시 마이크로파 에너지를 적용하고 교반한다. B 용액을 적용한 후, B 용액을 이의 저장 용기에 다시 되돌려보내고, 조직 샘플을 C 용액 또는 B 용액 및 C 용액의 혼합액으로 플러싱한다. 이어서, C 용액을 용기(48)에 공급하고, 교반 및 마이크로파를 적용하고, 최종적으로 C 용액을 배출한다. 그리고나서, 조직 샘플의 함침 준비를 한다.
도시된 실시형태에서 어셈블리의 제 2 서브유닛(46)에서 함침을 실시한다. 이를 통하여, 다음 조직 샘플(들)에 마이크로파 에너지가 적용되는동안 함침을 실시할 수 있다. 단일 유닛이 제공되는 경우에는, 마이크로파 처리용 용기를 함침에 사용할 수 있으나, 함침 단계동안에는 마이크로파 에너지를 이에 적용할 수 없다.
제안되어 있는 함침 처리법에 따라, 조직 제조 방법의 최종 단계로서 순차적 파라핀 조를 제공하여 조직 샘플을 함침하기 위하여, 일련의 파라핀 용액(예를 들어 (3) 또는 (4))을 예를 들어, 적당한 용기(54) 내 트레이(52)에 배치된 조직 카세트에 적용한다. 함침기 서브유닛(46)에, 승온으로 조절하여 진공 하에 조직 샘플을 넣는다. 이 단계에서, 자석 교반기, 초음파 또는 공기 버블러를 사용하여 이 조직 샘플을 교반하는 것도 바람직하다.
포매 등의 나머지 슬라이드 준비 단계는 도 3을 참조하여 상기 개략한 바와 같이 실시한다.
본 발명에 따르면, 특히 본 발명에 따르는 일반적인 조직 처리를 쉽게 하기 위하여, 부가적인 특정 기구 및 장치를 사용한다. 이러한 특정하게 고안된 기구 및 장치를 하기 기술한다.
상기한 바와 같이, 고형 조직 샘플을 얇은 슬라이스로 절단하는 것은 매우 어렵다. 한편, 탈수 및 고정 시간을 최소화하기 위해서는, 탈수 처리 전에 조직을 가능한한 얇게 자르는 것이 바람직하다. 슬라이스를 얇게 하기 쉽도록, 본 출원인은 병리학자를 위한 세가지 기구를 제안한다. 그 중 하나는 본 명세서에서 편의상 슬라이싱 가이드(60)로 언급하는 것으로, 도 8에 도시되어 있으며, 두께가 1 내지 2 mm이고, 예를 들어 엄지 손톱(약 1 ㎠) 폭의 커트아우트(64)를 갖는 얇은 금속 플레이트(62) 형태이다. 스탑(66)은 커트아우트 또는 노취(64) 말단에 정의되어, 나이프 또는 블레이드 스탑 역할을 한다. 평평한 표면 또는 다른 절단면으로부터 슬라이싱 가이드(60)를 쉽게 집을 수 있도록, 금속 플레이트(62) 말단의, 절단 노취에서 떨어진 부분에 립(68)이 제공될 수 있다. 얇은 조직 슬라이스를 얻기 위하여, 조직의 큰 단편을 커트아우트 또는 노취(64) 위에 위치시키는데, 이 중 일부가 노취에 놓이도록 한다. 이어서 조직 노출부에 가압하고, 절단 기구를 위치시켜 슬라이싱 가이드 플레이트를 따라 수평으로 움직여, 노취(64) 내 조직을 조직의 나머지에서 잘라낸다. 절단 블레이드와 블레이드 스탑(66)이 만나면 절단 처리가 완료되며, 절단부 상의 조직 덩어리는 치워둔다. 이어서, 슬롯에 있는 나머지 조직을 적단한 조직 카세트에 넣어 탈수 및 함침할 수 있다.
슬라이싱 가이드(60)을 사용하면, 일반적으로 균일한 두께를 가지며 더욱 처리할 수 있는 얇은 조직 슬라이스를 쉽게 만들 수 있음을 알 수 있다.
얇은 조직 슬라이스를 얻기 위한 다른 방법으로, 본 출원인은 도 9에 개략적으로 도시한 바와 같이, 통상의 포오셉(72) 말단에 평평한 플레이트 또는 블록(70)이 제공되도록 제안한다. 이 블록은 포오셉 말단에 영구적 또는 일시적으로 위치시킬 수 있다. 이는 다소 크고 평평한 클램핑면(74)을 제공한다. 절단될 조직은, 클램핑 블록(70) 사이에 위치되고, 날카로운 블레이드가 클램핑 블록들 사이를 지나 조직을 자를 수 있다. 일반적으로 평평한 두 면(74) 중 하나에 가까이 절단함으로써, 일반적으로 두께가 균일한 얇은 조직 슬라이스를 얻을 수 있다. 다소 크고 평평한 면으로 인해 균일한 압력이 가해지므로, 절단 처리동안 조직이 제 자리에 지지되어, 균일한 절단을 통하여 바람직하게 조직의 일체성이 그대로 보존될 수 있다.
절단하는 동안 제자리에 조직을 지지하기 위하여, 도 10에 도시된 세개의 프롱 포크-형 기구(92)를 또한 제안한다. 실시형태에서, 프롱(94)은 서로 약 1 센티미터의 간격을 가지며 각각 날카롭고 뾰족한 팁(96)을 가져, 조직 파괴를 최소화하면서 용이하게 침투할 수 있다. 조직을 기구(92)의 프롱(94)으로 절단 보드에 지지함으로써, 프롱 사이 또는 프롱에 평행으로 절단하여, 적당한 조직 슬라이스를 얻을 수 있다. 도시된 실시형태에서, 기구(92)는, 프롱의 길이가 다양한 표본을 얻을 수 있도록 5-10cm이고, 핸들 길이가 약 8 센티미터이며, 기구 조작이 쉽고 절단동안 잡기 쉽도록 프롱으로부터 약 2-4 센티미터 떨어져 있다. 장 및 담낭과 같은 기관에서 절편을 얻는 경우에 포크-형 기구(92)가 특히 유리한 것으로 밝혀졌다. 실제로, 이러한 표본에 프롱(94)을 사용하면 여러 층의 조직이 절단 처리하는 동안 서로 미끄러지는 것을 막을 수 있다.
출원인은 또한, 조직, 특히 매우 작은 조직 단편, 예를 들어 니들(niddle) 생체검사를 통해 얻어지는 조직 단편을 쉽게 옮기기 위하여, 수술실에서 사용하기 위한 조직 수용 단위 및 카세트를 제공하도록 제안한다. 이러한 생체검사 조직을 예를 들어 적당한 용액 단지에 바로 넣는 경우, 실험실 실험자는 단지로부터 미세한 조직 샘플을 회수하기 어려운 경우가 많으며, 특히 생체검사된 조직을 모두 회수하기 어려운 경우가 많다. 따라서, 도 11 및 도 12에 도시한 바와 같이, 출원인은 이러한 미세 조직 샘플을 바로 수용하기 위하여 수술실에 조직 카세트 (10')를 제공하도록 제안하였다.
이러한 조직 샘플을 조직 카세트 (10')에 담기 위하여, 얇은 생체검사 스폰지 재료(80) 시이트가 제공되는데, 이것은 개방 셀 플라스틱 포옴으로, 이 중 적어도 하나는, 이 안에 다른 생체검사 스폰지와 함께 생체검사된 조직을 수용하기 위한 구획을 제공하기 위하여 정의되는 국부 깊이 오목부(82)를 갖는다. 따라서, 수술실에서, 생체검사된 조직을 생체 검사 스폰지(80) 중 하나의 오목부(82)에 바로 넣고, 조직 카세트(10')를 닫을 수 있다. 처리 실험실로 옮기려는 조직을 그대로 유지하기 위해서는, 조직 카세트(10')를 적당한 용액이 포함된 단지 내에 위치시킨다. 카세트를 쉽게 회수하고 용액에 완전히 잠기도록 하기 위하여, 원형 서포트(88)가 리드(90)에서 돌출되어 있으며, 팁에 조직 카세트(10')의 상보 구조(84)와 연결하기 위한 구조를 갖는 표본 단지(86)가 제공된다. 도 12에는, 상부 표면에 의하여 부착되어 있는 조직 카세트(10')가 도시되어 있다. 그러나, 카세트의 바닥면 또는 경첩 가장자리와 같은 다른 부착점도 가능하다. 또한, 둘 이상의 카세트를 원형 서포트(88)에 부착할 수 있다.
따라서, 안에 생체 검사 조직을 갖는 조직 카세트(10')를 원형 서포트(88)의 원위 말단에 일시적으로 위치시키고, 적당한 용액에 넣어 옮길 수 있다. 조직 처리 실험실에서, 리드(90)를 단지로부터 제거하고, 조직 카세트(10')를 칼럼(88)에서 분리한다. 벨크로형 패스너와 같은 적당한 패스터, 플라스틱 스냅 록, 도브 테일 슬라이드 커넥터 또는 다른 연결 맞물림 구조를 제공하여, 조직 카세트(10')를 서포트 칼럼(88)에 부착시킬 수 있다. 표본 단지(86) 안의 용액은 이송(수용성) 용액 또는 1차(비-수용성) 용액이 가능하다. 수술실에서 사용되는 표본 단지에, 단지 외부에 부착되는 카세트를 제공하여, 조직을 카세트 내에 위치시킨 후 단지 내 용액에 카세트를 침지시키기 위하여 리드를 뒤집는 것이 편리하다.
본 발명은, 실제 병리학, 환자 간호, 생의학 연구 및 교육 분야에서 통상적인 방법에 비하여 많은 장점을 갖는다.
조직 샘플을 입수한 후 약 40분 내지 약 2 시간 내에 현미경 진단이 가능하면, 외과적 방법과 병리학적 평가 간에 신속한(또는 실-시간의) 임상적 상호적용이 가능하다. 이를 통하여, 질병의 진단 결과, 예상 및 치료 계획이 나올 때까지의 환자의 불안을 최소화하거나 없앨 수 있으므로, 환자 간호를 크게 진보시킬 수 있다.
결과적으로, 병리학 실험실에서의 작업 흐름이 전면적으로 바뀔 것이다. 임상 실험실 공간, 병리학적 전문기술, 및 사무 및 기술 직원을 더욱 효과적으로 쓸 수 있을 것이다. 연속적인 작업 흐름으로 인하여 표본을 처리 및 평가하는 병리학자들은 이를 쉽고 간단하게 실시할 수 있고, 표본을 처리 및 평가하기 위하여 필요한 병리학자의 수가 감소될 것이며, 또한 의학적 교육법이 개선되어, 특히 연수 프로그램이 쉽고 간단하게 될 것이다.
소량의 시약을 사용하여 비용이 절감될 것이다. 포름알데히드 및 크실렌이 사용되지 않고, 다른 유해한 화학제를 필요성이 줄어들어, 환경 보호에 도움이 되고, 실험실이 더욱 안전하게 될 것이다.
조직 고정 및 처리 방법이 표준화되어, 다른 실험실에서 얻은 표본을 쉽게 비교할 수 있을 것이다. 포름알데히드 및/또는 장기 처리로 인한 조직학의 인공산물이 제거될 것이다. 따라서, 정상 및 병든 조직의 현미경적 형태를 더욱 정확히 평가할 수 있을 것이다. 유사하게, 항원 회수 및 염색이 개선될 것이다. 유전적 분석에서, 포름알데히드-유도된 DNA 돌연변이가 없어질 것이며, 기록 보존 재료로부터의 핵산 추출이 개선될 것이다. 저장, 고정된 파라핀-포매 조직으로 RNA 연구가 가능하게 되어, 제한 없이 진단 및 연구가 가능하게 된다.
본 명세서에 인용된 모든 문헌, 기사, 출원서 및 특허는 전부 본 명세서에 참조 병합되었다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1
신선하거나 사전에 고정된 조직의 2mm 두께 또는 이보다 얇은 슬라이스는 조직 카세트에 넣고, 다음의 비-수성 제 1용액에 위치시켰다:
40% 이소프로필 알코올,
40% 아세톤,
20% 폴리에틸렌 글리콜(평균 분자량 300), 및
1% 디메틸 술폭사이드(DMSO)(즉, 상기 혼합물의 리터 당 10ml).
조직 샘플은 45℃ 내지 50℃ 글리세린 조에서 15분 동안 배양되었다. 400ml 고정용 용액을 수조 셰이커(5cm/초의 선형 변위)내의 500ml 비이커에 넣었다. 고정 용액의 부가적 교반은 공기 펌프로 버블링하여 제공되었다.
고정, 탈수, 지방 제거, 세척, 및 함침은 조직 표본을 세 개의 다른 용액(상기 제 2, 제 3 및 제 4 용액)을 에너지 빔 사이언스로부터 각 세 개의 마이크로파 오븐에서 연속하여 노출시킴으로써 실시하였다. 70% 이소프로필 알코올 및 30% 폴리에틸렌 글리콜(평균 분자량 300)의 용액 1리터는 1500ml 비이커에 담겨 첫번째 오븐(H2800 모델)에 위치시켰고, 70% 이소프로필 알코올 및 30% 크실렌로 구성된 용액 1리터는 1500ml 비이커에 담겨 두번째 오븐(H2800 모델)에 위치시켰고, 크실렌 1000ml 및 파라핀 300gm의 용액은 1500ml 비이커에 담겨 세번째 오븐(H2500 모델)에 위치시켰다. 이 세 용액에 리터 당 DMSO 10ml를 첨가하였다. 마이크로파로 60℃의 열을 첫번째 오븐에는 15분, 두번째 및 세번째 오븐에는 각각 5분 동안 방사하였다(2초 싸이클로 75% 전력 세팅).
마이크로파 방사 단계를 완료한 후, 파라핀 함침을 계속하기 위하여, 조직 절편을 네 개의 500ml 파라핀으로 채워진 큰 데시케이터 안에 녹은 파라핀이 있는 조에서 배양하고, 75℃ 글리세린 조에 두었다. 조직 절편은 한 파라핀 조에서 다음 조로 3분 간격으로 이동되었고, 총 함침 시간은 12분이었다. 각 3분 간격은 압력이 약 640mm.Of Hg을 가리킬 때의 시간으로부터 측정되었다. 이 단계 동안 교반하지 않았다.
실시예 2
새로 만들어거나 고정되어 있는 조직 절편(약 1mm 두께)의 고정, 탈수, 지방 제거, 및 파라핀 함침은, 이 조직 절편을 하기한 연속적인 네 단계에 노출시킴으로써 40분 만에 달성되었다.
단계 1.
이 실시예에서 제 1 용액은 다음과 같이 구성한다:
60% 이소프로필 알코올,
10% 아세톤,
30% 폴리에틸렌 글리콜(평균 분자량 300), 및
총 체적의 약 1% 농도로 첨가된 디메틸 술폭사이드(DMSO). 조직 카세트에 든 60개의 조직 샘플을 고정시키려면 이 용액 1리터면 충분하다. 이 샘플들은 제 1 용액을 포함한 일련의 세개의 조에서 각각 5분 동안 55℃로 시판 조직 마이크로파 프로세서(H2500 또는 H2800, 에너지 빔 사이언스)에서 배양되었다(총 배양 시간은 15분); 용액을 버블링으로 교반하여 용액 교환을 촉진하였다.
단계 2.
샘플은 60℃에서 70% 이소프로필 알코올, 30% 아세톤, 및 약 1% 농도로 첨가된 DMSO의 용액 속에서 배양되었다. 샘플들은 이 용액을 함유한 두 비이커에서 각각 시판 조직 마이크로파 프로세서(H2800, 에너지 빔 사이언스)에서 5분 동안 가열하고(총 10분 배양), 버블링으로 교반하였다.
단계 3.
마이크로파 조사에 이어, 60℃ 또는 70℃ 글리세린 조에 놓아둔 큰 데시케이터에 위치한 25% 광유 및 75%의 용융 파라핀 왁스 용액에 5분 동안 200mm.Hg의 진공 하에서 배양하여 함침을 시작하였다. 실시예 1에 기재한 바와 같이 파라핀은 사용하기 전에 가스가 제거되었다.
단계 4.
75℃ 글리세린 조에 놓아둔 큰 데시케이터 안에 위치한 네 개의 용융 파라핀 조에서 배양하여 함침을 완료하였다. 조직 절편은 3분 간격으로 한 파라핀 조에서 다음 조로 이동되어, 총 12분동안 함침시켰다. 압력이 약 640mmHg가 되는 시간을 위해 각각 3분 간격으로 측정되었다.
이 실시예에서, 각각의 이소프로필 알코올 및 아세톤에 색 반응 지시약 원료 용액(1000ml 이소프로필 알코올에 10gm 메틸렌 블루)가 첨가되었다. 조직 절편은 푸른빛을 얻어 함침 및 취급시 취급하기 용이하다; 또한 조직 표본의 청색을 관찰하여 조직 표본의 투과성을 모니터할 수 있다.
실시예 3
새로 만들거나 고정되어 있는 조직 절편(약 1 내지 2mm 두께 이하)의 고정, 탈수, 지방 제거, 및 파라핀 함침은 하기한 바에 따라 65분 동안에 달성되었다.
단계 1.
이 실시예에서 제 1 용액은 다음과 같이 구성한다:
40% 이소프로필 알코올,
40% 아세톤,
20% 폴리에틸렌 글리콜(평균 분자량 300),
총 체적의 약 0.5%의 농도로 첨가된 빙초산, 및
총 체적의 약 1% 농도로 첨가된 디메틸 술폭사이드(DMSO). 조직 카세트에 든 60개의 조직 샘플을 고정시키려면 이 용액 1리터면 충분하다. 이 샘플들은 제 1 용액이 들어 있는 1500ml 비이커에서 15분 동안 65℃로 시판 조직 마이크로파 프로세서(H2500 또는 H2800, 에너지 빔 사이언스)에서 배양되었다; 용액을 버블링으로 교반하여 용액 교환을 촉진하였다.
단계 2.
샘플은 55% 이소프로필 알코올, 25% 아세톤, 10% 폴리에틸렌 글리콜(평균 분자량 300), 10% 저점성 광유, 총 체적의 약 0.5% 농도로 첨가된 빙초산, 및 약 1% 농도로 첨가된 DMSO의 용액 속에서 배양된다. 샘플은 용액이 들어 있는 1500ml 비이커에서 15분 동안 65℃로 시판 조직 마이크로파 프로세서(H2500 또는 H2800, 에너지 빔 사이언스)에서 가열되고, 버블링으로 교반된다.
단계 3.
샘플은 55% 이소프로필 알코올, 25% 아세톤, 20% 저점성 광유, 총 체적의 약 0.5% 농도로 첨가된 빙초산 및 총 체적의 약 1% 농도로 첨가된 DMSO의 용액에서 배양된다. 샘플은 용액이 들어 있는 1500ml 비이커에서 5분 동안 65℃로 시판 조직 마이크로파 프로세서(H2800, 에너지 빔 사이언스)에서 가열되고, 버블링으로 교반된다.
단계 4.
마이크로파 조사에 이어, 60℃ 글리세린 조에 놓아둔 큰 데시케이터에 위치한 30% 저점성 광유 및 70% 용융 파라핀의 왁스 용액을 갖는 두 개의 조에서 각 조에 대해 5분 동안 200mmHg의 진공 하에서 배양하여 함침을 시작하였다.
단계 5.
글리세린 조에 놓아둔 큰 데시케이터 안에 위치한 네 개의 용융 파라핀 조에서, 각각에 대해 5분 동안 약 75℃ 내지 80℃, 약 640mmHg의 감압 하에 배양하여 함침을 완료한다. 조직 절편은 5분 간격으로 한 파라핀 조에서 다음 조로 이동되어, 총 20분동안 함침하였다. 약 640mmHg가 되는 시간을 위해 각각의 5분 간격으로 압력이 측정되었다.
실시예 4: 조직 절편 내 항원 검사
마이크로톰 위에서 파라핀 절편을 3미크론 두께로 절단하여 수조에 넣고, 유리 슬라이드 위에 띄운다. 파라핀을 슬라이드를 30분간 58℃ 오븐, 또는 바람직하기는 약 18시간 또는 밤새 37℃ 오븐에서 녹인다. 그리고 나서, 10분 동안 크실렌 조에서 왁스를 제거한다. 슬라이드는 각각 1분 동안 감소하는 에탄올 용액(순수 에탄올 두 조, 95% 두 조, 90% 한 조)에서 재수화시켰고, 2분 동안 수도물에 담궈 헹구었다.
내인성 퍼옥시다아제는 6% 과산화수소(H2O2) 및 에탄올, 또는 140ml 메탄올을 포함하는 6% H2O235ml 용액으로 블록으로 만들어 15분 동안 배양하였다. 슬라이드는 2분간 수도물 및 2분간 PBS에 담궈 헹구고 나서 건조하였다.
슬라이드는 습기찬 챔버로 옮겨졌고, 정상 말 혈청(NHS)은 블록에 첨가되었다(10분간). 과량의 정상 말 혈청은 슬라이드에서 따라내고, 특이 제 1 항체를 상온에서 습기찬 챔버내 조직 절편 위에서 30분 동안 배양하였다. 슬라이드는 스퀴즈 병을 사용하여 앞뒤로 움직여 PBS로 플러싱하고, 2분간 PBS 조에 담그고, 과량의 PBS는 각 슬라이드에서 건조시켰다. 링킹 용액(제 2항체 도는 비오티닐화 항-래빗 또는 항-마우스로도 알려진)이 각각의 조직 절편에 첨가되었고, 습기찬 챔버에서 25분 동안 배양되었다. 슬라이드는 스퀴즈 병을 사용하여 앞뒤로 움직여 PBS로 플러싱하고, 2분간 PBS 조에 담그고, 과량의 PBS는 각 슬라이드에서 건조시켰다.
제조업자의 지침에 따라 신호를 전개하였다(Vector 실험실). ABC용액을 조직 절편에 첨가하여, 습기찬 챔버에서 25분 동안 배양하였다. 슬라이드는 스퀴즈 병에서 PBS로 플러싱하고, 2분간 PBS 조내 랙에 담궜다. 사용하여 앞뒤로 움직여 PBS로 플러싱하였다. 랙은 DAB 색원체 조에 6분 동안 담그고 나서, 흐르는 물에 담궈 4분간 부드럽게 세척하였다. 조직 절편은 15초 내지 90초 동안 헤마톡실린으로 대조염색하였다. 염색 시간은 헤마톡실린의 숙성에 달려 있다. 슬라이드는 흐르는 물에 3분간 세척하여 과량의 대조염색제를 제거하였고, 85% 내지 100% 알코올 조에서 탈수하였고, 크실렌으로 세척하였고(각각 약 10초), 커버 글라스로 덮었다.
프로제스테론 수용체, 인자 Ⅷ-관련 항원, CD-31, CD-68, 세포케라틴-7, 크로모그라닌, 및 평활근 항원에 대해 우수한 활성이 나타났는데, 항원 보존성이 개선되었기 때문으로 보인다.
시약 목록# 공급원
현미경 슬라이드-스노우 코팅 X-TRA 00206 서지패스
엘리트 ABC Kit(표준) PK-6100 벡터 랩
비오티닐화 항-마우스 IgG(H＆L) BA-2000 벡터 랩
비오티닐화 항-마우스 IgM(H＆L) BA-2020 벡터 랩
비오티닐화 항-마우스/항-래빗 IgG(H＆L) BA-6000 벡터 랩
표준 말 혈청(NHS) S-2000 벡터 랩
디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드 K3466 (주)DAKO
인산칼륨(1염기) 7100-500NY Baxter사이언티픽
인산나트륨(2염기) 7917-2.5NY Baxter사이언티픽
염화나트륨(AR결정) 7581-2.5NY Baxter사이언티픽
30%과산화수소 5240-500NY Baxter사이언티픽
크실렌 8644-20NY Baster사이언티픽
해리스 헤마톡실린 S-7735-3 Baster사이언티픽
메틸 알코올 3016-20NY Baster사이언티픽
95% 알코올 플로리다 디스틸러스
순수 에틸 알코올 플로리다 디스틸러스
항체, 희석액 및 배양 시간
래빗(R) 마이크로파(M) 30'배양
마우스(MigG) 트립신(T) 45'배양
마우스(MigG) 프로테아제(P) 90'배양
염소(G) 패스트 그린(Fast Green)(FG)
약자 항체 특정 방법 배양 시간 링크 용액
(ACTH)(AACT)(AAT)(ADENO)(AFP)(AEI/3)(ALA)(ACTIN)(APP-A4)(ASPE)(AR) 부신피질자극 호르몬알파-1 항카이모트립신알파-1 항트립신아데노바이러스(Adenoviurs)알파 페토프로테인시토케라틴알파 락트알부민액틴 근육항-알즈하이머 전구 단백질 A4아스페르질루스안드로젠 수용체 1:20001:500001:20001:10001:25001:200(M)1:6001:2001:500(M)1:5001:20(M)(FG) 30'30'30'30'30'45'30'30'45'30'45' RRRMIgGRMIgGRMIgGMIgGRMIgG
(BCA)(bcl-2)(BerEp4)(B72.3)(BLA36) B-세포항-인간 온코프로테인인간 상피성 항원TAG72 종양-관련 당단백질72B 림프구 항원 1:2001:100(M)1:251:1001:100 30'45'30'30'30' MIgGMIgGMIgGMIgGMIgG
(CMV)(CHRG)(CALC)(CEA)(CERb'B2) 시토메갈로바이러스크로모그라닌칼시토닌배발암(Carcinoembryonic) 항원c-erbB-2 종양유전자 Mabl 1:50(P)1:501:20001:60001:1500 30'30'30'30'90' MIgGMIgGRRR
항체, 희석액 및 배양시간
약자 항체 특정 방법 배양시간 링킹 용액
(CATH)(CAM 5.2)(CK 7)(CK 20)(COLL Ⅳ)(CA 125)(CD 30) 카텝신 D시토케라틴시토케라틴시토케라틴교원질 Ⅳ항-인간 CA 125(MⅡ)항-인간 Ki-1 항원(BER-H2) 1:2000(M)1:500(M)1:200(M)1:25(M)1:25(P)1:20(M)1:200(M) 45'45'45'45'30'45'45' RRMIgGMIgGMIgGMIgGMIgG
(ER) 에스트로겐 수용체 1:50(M)(FG) 45' MIgM
(FVⅢ)(FSH)(5 HT)(FXⅢ) Von Willebrand 인자여포 자극 호르몬세로토닌항-응고 인자 1:50(P)1:30001:501:1200 30'30'30'30' MIgMRMIgMR
(GAST)(GFAP)(GLUC)(GH)(GCDFP)(GRP) 가스트린신경교 원섬유 산성 단백질글루카곤성장 호르몬거대 방광 질병 유체 단백질가스트린-방출 펩티드 1:20001:15001:100001:50001:2501:1000 30'30'30'30'30'30' MIgMRRRMIgMR
(HMWK)(Hbcore)(HBsAg)(HSVⅠ)(HSVⅡ)(HCG)(HPL) 고분자량 케라틴(34βE12)간염 B 핵 항원간염 B 표면 항원허피스 단일 형태 Ⅰ허피스 단일 형태 Ⅱ인간 융모막 생식선 자극 호르몬인간 태반 최유물질 1:101:50001:1001:101:101:500001:100000 45'30'30'30'30'30'30' MIgMRMIgMRRRR
항체, 희석액 및 배양 시간
약자 항체 특정 방법 배양시간 링킹 용액
(HIST)(H.Pyl)(β-HCG)(IgA)(IgG)(IgAs)(IgM)(INS) 히스토플라즈마헬리오박테르 필로리β-인간 융모막 생식선 자극 호르몬알파 중연쇄감마 중연쇄IgA의 분비말MU중연쇄 IgM인슐린 1:10001:500(M)1:100001:4001:10001:2001:10001:100 30'45'30'30'30'30'30'30' RRRRRRRR
(Ki-67)(K)(KERATIN) 핵 항원 MIB-1카파 경쇄AEI/3 CAM 1:50(M)(FG)1:200(M)1:50/1:500(M) 45'45'45' MIgGMIgGMIgG
(LCA)(Leu M1)(Leu 7)(Lectin)(Anti-Lectin)(LEA135) 백혈구 보통 항원백혈구 Ml 항원백혈구 7 항원렉틴항-렉틴 항원항-인간 내강 상피성 항원 1:501:200(M)1:50(M)1:40001:100001:50 30'45'45'NHS대신 사용30'30' MIgGMIgMMIgMGMIgG
(LH)(L)(LMK-8)(LIP-AS 105) 황체 형성 호르몬람다 경쇄저분자량 케라틴리파제 1:30001:6000(M)1:25(M)1:400 30'45'45'30' RMIgGMIgGMIgG
(MCA)(MUR)(MYOGL)(MAPH) 골수양성 조직구 항원(MAC 387)무라미다제미오글로빈대식세포 1:400(M)1:20001:50001:50 45'30'30'30' MIgGRRMIgG
항체, 희석액 및 배양시간
약자 항체 특정 방법 배양시간 링킹 용액
(MTLT)(MEL)(MAK6)(MBP)(MESO)(MAST-C)(MPO)(MGN)(NB)(N-FIL)(NSE) 금속티오닌흑색종 HMB 45항-시토케라틴미엘린중피 항원비만 세포마이엘로퍼록시다제마이오제닌(Myogenin)신경아세포종N-필라멘트(2F11)뉴론 특이 에놀라제 1:501:501:50(T)1:5001:5001:2000(T)1:50001:151:2001:2501:4000(M) 30'30'90'30'30'30'30'45'90'30'45' MigGMigGMigGRMigMMigGRMigGMigGMigGMigG
(PAMYL)(PCP)(PLAP)(PPP)(PTH)(PROL)(PAPH)(PML)(SV40)(PR)(PR 1A6)(PSA)(PCNA)(PS2)(P53) 췌장 아밀라아제뉴모시스티스 카리니태반 알칼리성 포스파타제췌장 폴리펩티드부갑상선 호르몬황체자극호르몬전립선염 포스파타제진행성 다소성 뇌질환프로제스테론 수용체프로제스테론 수용체전립선 특이 항원증식 세포 핵PS2 단백질p53 항원 1:201:251:8001:30001:250(M)1:5001:40001:100001:100(M)1:50(M)1:7501:100(M)(FG)1:10001:50(M)(FG) 30'30'30'30'45'30'30'30'45'45'30'45'45'45 MigGMigMRR(RAT)RRRRMigGRMigGRMIgG
항체, 희석액 및 배양 시간
약자 항체 특정 방법 배양시간 링킹 용액
(S100A)(S100)(SOMAT)(SYNAP)(SMA)(SR-1) S100A 단백질S100 단백질성장억제 호르몬시냅토파이신(Synaptophysin)평활근 액틴근절 액틴 1:30001:20001:30001:800(M)1:1001:100 30'30'30'45'30'30' RRRRMIgGMIgG
(TESTOS)(TGB)(TP-103)(TM)(TSH)(TCA)(TOXO) 테스토스테론타이로글로불린트레포네마혈전모둘린(Thrombomodulin)갑상선 자극 호르몬T-세포 항원톡소플라즈마 1:2501:200001:50(T)1:501:20001:800(M)1:1000 30'30'30'30'30'45'30' RRMIgGMIgGRMIgGR
(UBT) 유비퀴틴 1:250 30' R
(VIP)(VIM)(VZV) 혈관작용 장 단백질비멘틴(Vimentin)Variecella-Zoster 바이러스 1:15001:800(M)1:100 30'45'30' RMIgGMIgG
(WSKER) 광스펙트럼 케라틴 1:500 30' R
실시예 5: 처리된 조직 절편으로부터 DNA 추출
두 개의 6미크론 조직 절편을 1.5㎖ 마이크로퓨즈 튜브에 위치시키고, 800㎕ 크실렌을 첨가하여 보텍싱으로 혼합하고, 400㎕ 순수 에탄올을 첨가하여 보텍싱으로 혼합하고, 고속 마이크로퓨즈에서 튜브를 5분 동안 원심 분리하고, 상청액을 따라내었다. 펠렛에 800㎕ 순수 에탄올을 첨가하여 보텍싱으로 혼합하였다.
상기와 같이 원심 분리한 후, 상청액을 따라내고, 세제/단백질 가수 분해 효소 K 용액(1% NP40 또는 트리톤 X-100, 2.5㎎/ml 단백질 가수 분해 효소 K 2.4㎕)100㎕을 펠렛에 첨가하고, 한 시간동안 55℃에서 배양하였다. 단백질 가수 분해 효소 K는 10분 동안 95℃에서 배양하여 불활성화하였다. 5분 동안 마이크로퓨즈에서 원심 분리한 후 DNA를 함유한 상청액을 얻는다. 이 물질은 PCR을 위해 준비하였다. 추가로 서던 블로팅하려는 경우 이를 침전 및/또는 추출해야 한다. 제한 분석을 위해 충분한 DNA를 얻으려면 더 많은 절편이 필요하다.
도 13A는 본 발명(실시예 1) 및 통상의 조직 처리(제조업자의 지침에 따라 사용된 조직-Tek VIP 조직 프로세서 Miles-Sakura)에 따라 준비한 샘플 간에 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 증폭된 DNA의 양과 질을 비교하여 나타낸 것이다.
실시예 6: 처리된 조직 절편으로부터의 RNA 추출
일회용 블레이드를 사용하여 파라핀 블록에서 10개의 절편(각각 7㎛)을 절단하였다. 이 블록은 본 발명 및 도 5에 기재된 바와 같은 일반적인 조직 처리를 통하여 제조하였다. 이들을 50ml Falcon 튜브에 넣어, 20ml의 크실렌을 사용하여 파라핀을 제거한 후, 남은 조직을 30분동안 순수한 알콜로 2회 세척하였다. 이 조직을, 4M 구아니디늄 티오시아네이트, 25mM Na 시트레이트 pH 7.0, 0.5% N-라우릴사르코신 및 0.1M 2-메르캅토에탄올을 함유하는 용액에 0.5g/ml로 현탁시켰다. 이 용액을 보텍싱(vortexing)하여 혼합하고, 18 내지 22 게이지 시린지 니들을 통과시켜 DNA를 절단하였다.
몇개의 5ml 원심분리 튜브(Sorvall)에서, RNA-함유 용액을 주의깊게 5.7M CsCl 2.8ml에 층지게 하고, Beckman L8-53 초원심분리기에서 14시간동안 18℃, 35,000rpm으로 SW55Ti 로터로 원심분리하여 RNA를 침전시켰다. 상부를 주의깊게 제거하여 튜브 바닥의 RNA 펠렛을 남겼다. 펠렛을 리보뉴클레아제가 없는 물로 재현탁시키고, 에펜도르프 튜브를 14,000 rpm에서 10분간 회전시켰다. RNA 함유 상청액을 얻어, UV흡광도를 측정하였다. 흡광 계수 1 OD280/cm는 40㎍/ml RNA이고, OD260/OD280비는 약 1.8 내지 약 2.0이 되어야 한다. 총 45㎍의 RNA를 본 발명에 따라 제조한 조직 표본으로부터 추출하였고, 통상적으로 처리한 조직 표본에서는 RNA가 전혀 검출되지 않았다(도 13B).
본 발명은 현재 실질적이고 바람직한 실시형태로 생각되는 것과 관련지어 기재하였으나, 본 발명이 개시된 실시 형태에만 한정되는 것은 아니며, 특허청구범위의 정신 및 범위에 속하는 다양한 변형 및 이에 상당하는 배치가 가능한 것으로 이해해야 한다.
따라서, 본 발명의 변형된 내용은, 본 발명의 실시형태에서 벗어난 것이 아니라 당업자에게 자명한 것이며, 이러한 변형된 내용이 하기 특허청구범위의 범주에 속하는 것으로 이해해야 한다.

Claims (39)

  1. (a) 조직 표본을 고정하는 단계,
    (b) 조직 표본을 탈수하는 단계,
    (c) 조직 표본으로부터 지방을 제거하는 단계, 및
    (d) 조직 표본을 함침시키는 단계
    를 포함하여 이루어지며, 조직 표본이 비-수성 용액들에서 고정, 탈수, 지방 제거되고, 이에 의하여 조직 표본이 조직학용으로 두 시간 이내에 준비되는, 조직학용 조직 표본 준비 방법.
  2. 제 1항에 있어서. 제 1 용액에서 비-수성 용액들 중의 하나 이상이 고정제 및 탈수 시약을 포함하여 이루어지는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 제 1 용액이 알코올 대 케톤의 체적비가 1 내지 3을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 제 1 용액이 폴리에틸렌 글리콜을 더욱 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 제 1 용액이 계면 활성제을 더욱 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 계면 활성제가 디메틸 술폭사이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 비-수성 용액들 중의 하나 이상이 아세톤, 이소프로필 알코올 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하여 이루어지는 제 1 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 2항에 있어서, 조직 표본이 제 1 용액에 25분 이내로 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 조직 표본을 세척하는 단계를 더욱 포함하여 이루어지는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 조직 표본이 비-수성 용액들에서 고정, 탈수, 지방 제거, 및 세척되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 비-수성 용액들 중의 하나 이상이 클리어런트를 포함하여 이루어지는 제 2 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 클리어런트가 크실렌인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 10항에 있어서, 상기 비-수성 용액들 중의 하나 이상이 이소프로필 알코올 및 크실렌을 포함하여 이루어지는 제 3 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 9항에 있어서, 조직 표본이 제 4 용액인 비-수성 용액들 중의 하나 이상에서 세척 및 함침되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 제 4 용액이 클리어런트 및 함침 시약을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 클리어런트가 크실렌인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 함침 시약이 파라핀인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 13항에 있어서, 상기 조직 표본이 10분 이내에 세척되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1항에 있어서, 상기 조직 표본이 왁스 용액에 함침되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 왁스 용액이 가스가 제거된 파라핀을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 왁스 용액이 낮은 점성의 광유를 더욱 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 19항에 있어서, 상기 조직 표본이 대기압보다 낮은 압력하에서 왁스에 함침되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 19항에 있어서, 상기 조직 표본이 15분 이내로 왁스에 함침되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1항에 있어서, 상기 조직 표본이 조직학용으로 90분 이내에 준비되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1항에 있어서, 상기 조직 표본이 조직학용으로 1시간 이내에 준비되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 1항에 있어서, 상기 조직 표본이 조직학용으로 45분 이내에 준비되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 1항에 있어서, 상기 조직 표본이 3mm 이하의 두께를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 1항에 있어서, 상기 조직 표본이 1-2mm의 두께를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 20항에 있어서, 상기 조직 표본이 약 640mm.Hg의 음압에서 실질적으로 유지되는 파라핀에 함침되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 클리어런트 및 가스가 제거된 파라핀을 포함하는 용액에서 조직 표본이 배양되는 단계를 포함하여 이루어지는 조직 표본의 세척 및 함침 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 상기 클리어런트가 크실렌인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 30항에 있어서, 가스가 제거된 파라핀에서 조직 표본을 포매하는 단계를 더욱 포함하여 이루어지는 방법.
  33. 낮은 점성의 광유 및 가스가 제거된 파라핀을 포함하는 용액에서 조직 표본이 배양되는 단계를 포함하여 이루어지는 왁스 내에서 조직 표본의 함침 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 조직 표본이 대기압보다 낮은 압력에서 왁스에 함침되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 33항에 있어서, 가스가 제거된 파라핀에서 조직 표본을 포매하는 단계를더욱 포함하여 이루어지는 방법.
  36. 제 33항에 있어서, 상기 조직 표본이 약 15분 이내에 함침되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 33항에 있어서, 상기 조직 표본이 약 640mm.Hg의 음압에서 실질적으로 유지되는 파라핀에 함침되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. (a) 각 세트가 하나 이상의 조직 표본을 포함하는 다수의 조직 표본 세트를 제공하는 단계;
    (b) 상기 다수의 조직 표본 세트의 첫번째 세트의 조직 표본을 고정하는 단계;
    (c) 상기 첫번째 조직 표본 세트를 탈수하는 단계;
    (d) 상기 첫번째 조직 표본 세트로부터 지방을 제거하는 단계; 및
    (e) 상기 첫번째 조직 표본 세트를 함침하는 단계;
    (f) 선행 세트에 대한 상기 (e)단계를 완료하기 전에 각 조직 세포 세트에 대한 상기 (b)단계를 시작하여, 상기 다수의 조직 표본이 모두 처리될 때까지 각각의 부가의 조직 표본 세트에 대해 (b)-(e)단계를 반복하는 단계
    를 포함하여 이루어지는 조직학용 다수의 조직 표본을 실질적으로 연속하여 연달아 처리하는 방법으로서, 각각의 조직 표본 세트가 조직학용으로 실질적으로 두 시간 이내에 준비되는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 38항에 있어서, 상기 조직 표본이 비-수성 용액들에서 고정, 탈수, 지방 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
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