DE19945621A1

DE19945621A1 - Geräteanordnung zur Präparation und Analyse von Gewebe für mirkoskopische Untersuchungen

Info

Publication number: DE19945621A1
Application number: DE1999145621
Authority: DE
Inventors: Aurel Popa
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-09-23
Filing date: 1999-09-23
Publication date: 2001-04-05
Also published as: WO2001022052A1; EP1218719A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Geräteanordnung für Zellen bzw. Gewebe von Lebewesen, die zytologisch, histologisch oder immunologisch untersucht werden sollen. Besonders geeignet ist die Geräteanordnung für immunhistochemische Detektion von Proteinen und von mRNA. DOLLAR A Aufgabe der Erfindung ist es, eine Geräteanordnung ohne komplizierte Mechanik zu entwickeln, welche die Behandlung einer großen Zahl von frei schwimmenden Gewebeschnitten mit verschiedenen Reagenzien ermöglicht und dabei eine Gleichbehandlung sichert. DOLLAR A Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass mindestens zwei Behälter (1) für die Aufnahme von Gewebeschnitten (2) zueinander offen, zur Umgebung flüssigkeitsdicht verbindbar und im Behälter die Gewebeschnitte (2) voneinander durch Abstandsmittel (3) gehalten und frei umströmbar sind. Die Behälter (1) besitzen einen Anschluß für die Zu- und Ableitung von Reagenzien und stehen über Pumpe (4) und Ventile (5) mit Vorratsbehältern (6) für die Reagenzien in Verbindung, so dass diese im Kreislauf oder mit einfacher Durchströmung in beliebiger Folge fahrbar sind.

Description

Die Erfindung betrifft eine Geräteanordnung für Zellen bzw. Gewebe von Lebewesen, die zytologisch, histologisch oder immunnologisch untersucht werden sollen. Besonders geeignet ist das Geräteanordnung für immunhistochemische Detektion von Proteinen und von mRNA. Für die mikroskopische Bewertung der Gewebe ist die entsprechende Vorbehandlung eine wesentliche Voraussetzung. Lebende Zellen und Gewebe werden nach dem Absterben zunächst autolytisch-fermentativ, danach bakteriell zersetzt. Für die Untersuchung ihrer Strukturen ist deshalb eine Behandlung nötig, die diese Zersetzung unterbindet. Diese Fixierung soll lebende Strukturen weitgehend lebensähn lich erhalten, damit sie real beurteilt werden können. Je nach Untersuchungsziel sind nach der Herstellung des Gewebe schnittes weitere Behandlungen erforderlich, wie Waschen, Färben, mit Antikörper inkubieren u. a. Bei der anschließen den mikroskopische Untersuchung ist es erforderlich, den Gewebeschnitt auf einem Objektträger zu plazieren.

Stand der Technik

Für kleine Mengen von zu untersuchenden Gewebeschnitten werden diese von Hand in einem Behälter gelegt und frei schwimmend gewaschen. Nach der Entnahme erfolgt eine einzelne Ablage der Gewebeschnitte, überwiegend auf einen Glasträger. Anschließend werden mittels Pipette die Reagenzien zugeführt. Diese Behandlung ist nicht nur aufwendig, sondern beeinflußt auch die Qualität subjektiv.

Für eine größere Zahl von Untersuchungen werden spezielle Vorrichtungen verwendet. In der DE OS 3 13 127 ist eine Vorrichtung zum Färben von biologischen Proben vorgeschlagen, bei der der Gewebeschnitt auf einem Mikroskopprobenträger in ein Behälter eingebracht und dadurch mit Färbeflüssigkeit kontaktiert wird. Zufuhr und Entnahme erfolgen von Hand, weitere Behandlungen sind an dieser Vorrichtung nicht mög lich.

Es sind auch vollautomatische Anlagen bekannt (DE PS 36 34 976). Diese bestehen aus einem Gehäuse mit mehreren Behältern mit den entsprechenden Reagenzien und einer Präpa rathalter-Transportvorrichtung. Diese taucht die Objekträger mit den Gewebeschnitten in die Behälter, wobei die Zeitdauer und Reihenfolge durch eine Steuerung vorgegeben wird.

Alle bekannte Vorrichtungen benutzen einen Objektträger, dieser ermöglicht die erforderliche Handhabung der Proben. Die Vorrichtungen sind aber durch die Transport bzw. Greif elemente entsprechend aufwendig. Da die Proben nacheinander behandelt werden, ist auch hier die Gewährleistung gleicher Behandlungsbedingungen nicht vollständig gegeben.

Aufgabe der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, eine Geräteanordnung ohne komplizierte Mechanik zu entwickeln, welche die Behandlung einer großen Zahl von frei schwimmenden Gewebeschnitten mit verschiedenen Reagenzien ermöglicht und dabei eine Gleichbe handlung sichert.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die Merkmale gemäß Anspruch 1 gelöst.

Die Erfindung geht von dem bekannten Prinzip ab, dass die Gewebeschnitte den einzelnen Reagenzien zugeführt werden. Der Erfindungsgedanke besteht darin, die Reagenzien in Chargen von Gewebeschnitten zu leiten. Dafür wird eine Geräteanord nung vorgeschlagen, die eine freie Lagerung der Gewebeschnit te und die beliebige Zuführung von Reagenzien ermöglicht. In weiterer Ausgestaltung der Erfindung werden kombinierbare Behälter für unterschiedliche Chargengrößen und netzförmige Abstandshalterungen vorgeschlagen. Die Netze ermöglichen nicht nur eine Handhabung und Abstandshalterung der Gewebe schnitte, sondern bewirken auch eine Benetzung und Umspülung der Oberfläche. Für spezielle Behandlungen ist weiterhin vorgesehen, die gesamte Geräteanordnung, Teile davon oder nur die Reagenzien zu temperieren. Das kann eine Kühlung, z. B. bei Antikörperlösungen oder Erwärmung sein.

Mit dieser Erfindung können wesentlich mehr Gewebeschnitte in kürzerer Zeit bei verringertem Aufwand behandelt werden. Besonders bei mehrfachen Behandlungsschritten werden die jeweils erforderlichen unterschiedlichen Bedingungen optimal eingehalten. Außerdem ist eine gleiche Behandlung der Gewebe schnitte je Charge gewährleistet, was besonders bei verglei chenden Untersuchungen wesentlich ist.

Beispiele

Nachfolgend soll die Geräteanordnung an einem Beispiel und zwei Anwendungen erläutert werden.

In der Figur ist die Geräteanordnung im Prinzip dargestellt. Mehrere zylindermantelförmige Behälter (1) sind übereinander zu einer Waschsäule verschraubt. Die Behälter (1) besitzen am Umfang je ein Innen bzw. Außengewinde und gegebenenfalls eine Dichtung. Sie sind aus entsprechendem Kunststoff, z. B. Poly ethylen gefertigt. Der oberste und unterste Behälter (1) hat jeweils einen Abschlußboden und Schlauchanschlüsse.

In den Behältern (1) befinden sich waagerecht, auf Nylonnet zen (3) liegend, die Gewebeschnitte (2).

Die Waschsäule ist über Schläuche, einem Zweiwegeventil (5) und einem Dreiwegeventil (5) mit einer Pumpe(4) und Vorratsbe hältern (6) für Reagenzflüssigkeiten verbunden. Eine nicht dargestellte Ablaufsteuerung steuert die Ventile (5) und Pumpe (4) in vorgegebener Folge. Durch die Geräteanordnung ist eine Spülung mit Auffangen der gebrauchten Waschflüssigkeit, und eine Kreislaufführung von Reagenzflüssigkeiten möglich. Durch weitere Ventile (5) und Vorratsbehältern (6) kann diese entsprechend der Erfordernisse erweitert werden.

Funktion in der Immunchemie

Zur Durchführung der Immunhistochemie werden die Gewebe schnitte (2) (Dicke 25 µm, Größe 10 mm) in die Behälter (1) gelegt, wobei zwischen die einzelnen Gewebeschnitte (2) je weils ein Nylonnetz (3) mit einem Durchmesser von 31 mm gelegt wird. Nach jeder Beschickung wird ein weiterer Behälter (1) aufgeschraubt und zum Abschluß ein Behälter (1) mit Abschluß boden und Schlauchanschlüsse. Nun wird mit Waschlösung gewa schen (V 1 zu, V2 auf = Waschen), mit Fixierlösung behandelt (V 1 auf, V2 zu = Zirkulation), gewaschen, mit Blockierungslö sung über Nacht bei 4°C inkubiert (Zirkulation), gewaschen und über Nacht bei 4°C mit Antikörperlösung inkubiert (Zirku lation), gewaschen und über Nacht bei 4°C einer zweiten Antikörperlösung inkubiert (Zirkulation), gewaschen und 4 Stunden bei 4°C mit einer Verstärkerlösung inkubiert (Zirku lation), gewaschen und 5-25 Minuten mit einer Färbelösung gefärbt (Zirkulation), gewaschen, mit Fixierungslösung behan delt (Zirkulation), gewaschen und am Schluß aus der Waschsäu le genommen und auf Objekträger gebracht.

Funktion bei In situ Hybridisierung

Zur Durchführung der In situ Hybridisierung werden die Gewe beschnitte (2), (Dicke 60 µm, Größe 10 mm) in die Waschsäule gelegt (zwischen die einzelnen Gewebeschnitte (2) wird jeweils ein Nylonnetz (3) mit einem Durchmesser von 31 mm gelegt) und mit Waschlösung gewaschen (V 1 zu, V2 auf = Waschen), mit Fixierungslösung behandelt (V 1 auf, V2 zu = Zirkulation), gewaschen, mit Blockierungslösung 1 Stunde bei 65°C inkubiert (Zirkulation) und 6 Stunden mit einer Hybridisierungslösung inkubiert (Zirkulation), danach werden die Schnitte mehrmals bei 65°C gewaschen (Waschen mit darauffolgender Zirkulation), mit Fixierungslösung behandelt (Zirkulation), gewaschen, mit Fixierungslösung 1/2 Stunde inkubiert (Zirkulation) und über Nacht bei 4°C mit einem Antikörper inkubiert(Zirkulation).

Danach werden die Schnitte gewaschen und 1-4 Stunden mit einer Färbelösung bei 37°C gefärbt(Zirkulation), mit Fixier lösung 1 Stunde inkubiert (Zirkulation), gewaschen und am Schluß aus der Waschsäule genommen und auf Objekträger ge bracht.

Bezugszeichenliste

1

Behälter

2

Gewebeschnitte

3

Abstandsmittel

4

Pumpe

5

Ventile

6

Vorratsbehälter

Claims

1. Geräteanordnung zur Präparation und Analyse von Gewe be für mikroskopische Untersuchungen, bestehend aus Be hältern in denen die Gewebeschnitte mit Reagenzien in Kontakt gebracht werden, dadurch gekennzeichnet,

a) daß mindestens zwei Behälter (1) für die Aufnahme von Gewebeschnitten (2) zueinander offen, zur Umgebung flüssigkeitsdicht verbindbar,
b) im Behälter die Gewebeschnitte (2) voneinander durch Abstandsmittel (3) gehalten und frei umströmbar sind,
c) die Behälter (1) einen Anschluß für die Zu- und Ablei tung von Reagenzien besitzen
d) und über Pumpe (4) und Ventile (5) mit Vorratsbehäl tern (6) für die Reagenzien in Verbindung stehen, so dass diese im Kreislauf oder mit einfacher Durchströ mung in beliebiger Folge fahrbar sind.

2. Geräteanordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, dass diese oder die Behälter (1) oder/und die Vor ratsbehälter (6) in einem Temperierschrank angeordnet sind.

3. Geräteanordnung nach Anspruch 1 und 2, dadurch ge kennzeichnet, dass mindestens zwei zylindermantelförmige Behälter (1) übereinander zu einer Waschsäule verbindbar sind und die äußeren Behälter (1) einen Anschluß für die Zufuhr und zwei Anschlüsse für die Ableitung von Reagen zien besitzen.

4. Geräteanordnung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch ge kennzeichnet, dass die Behälter (1) an den Enden am Umfang je ein Innen- und Außengewinde besitzen und nach dem Beschicken durch Verschrauben zu einer Waschsäule zusammenfügbar sind.

5. Geräteanordnung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch ge kennzeichnet, dass die Behälter (1) an den Enden am Umfang konisch ge formt sind und nach dem Beschicken mittels einer Schnell spannvorrichtung zu einer Waschsäule zusammenfügbar sind.

6. Geräteanordnung nach Anspruch 1 bis 5, dadurch ge kennzeichnet, dass die Pumpe (5) und Ventile (6) mit einer programmierbaren Steuerung verbunden sind, so dass die Reagenzien nach vorgegebenen Verfahrensschritten durch die Behälter (1) geleitet werden.

7. Geräteanordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, dass die Abstandsmittel (3) für die Gewebeschnitte (2) aus säurebeständigen und chemisch neutralen Netzen beste hen.

8. Geräteanordnung nach Anspruch 1 und 7, dadurch ge kennzeichnet, dass die Abstandsmittel (3) aus Nylonnetzen mit einer Maschenweite von 100 bis 200 µm bestehen.