JP2001516869A - 高品質、連続処理、組織固定−脱水−脱脂−含浸方法 - Google Patents
高品質、連続処理、組織固定−脱水−脱脂−含浸方法Info
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Abstract
Description
での処理に関する。
ヒド、脱水用に1連の濃度を順に増加したエタノールおよび洗浄用にキシレンの
、別々の溶液でインキュベーションすることによって、組織学用の組織を調製し
ていた。通常8時間またはそれより長時間、この処理に時間を要するので、これ
ら別々のステップ−固定、脱水、洗浄、および含浸−を完了するには通常、これ
らの仕事用にデザインされた自動機器で1夜を要している(例えば、米国特許第
3,892,197号、第4、141,312号、および第5,049,510
号を参照)。典型的な自動組織処理機器(TISSUE−TEK)は、8時間よ
り多くを必要とし、そして以下のように、組織試料のバッチを処理するようにプ
ログラムされている。
理研究室に送られるのに1日;組織標本が調製されるのに1夜;そして病理学者
が、早くとも翌日、研究室に標本が配送されてからほとんど24時間後に、組織
切片の顕微鏡検査に基いて診断を下す、ということが必要とされる(図1)。病
理学者からの報告の恩恵が外科医に与えられるのが、最小限1日遅れるのに加え
て、標本のバッチ処理の必要性、機器が終夜運転されていることに伴う安全に関
すること、機器の故障のリスクおよび機器をモニターする必要性、および、自動
化したときにそのような処理に要する大量の試薬の使用による廃棄物、によって
必然的となる、病理研究室における、仕事の流れの妨げに関連した問題がある。
更に、このプロセスに使用される試薬に関連した煙霧および毒性物質に対する、
実験室員の曝露を防止するに高価な対策が必要とされる。また、従来の方法によ
り産生される大量の廃溶媒やパラフィン屑は、環境を汚染する。
となり、診断および研究への遺伝子技術の応用を制限している。従って、ほとん
どのDNAおよびある種のRNA解析は、例えば新鮮な組織の瞬間冷凍のような
、材料の取扱いといった特別な注意を必要とする。なぜなら遡及的遺伝子解析は
、従来の組織処理技術により、損なわれるからである。
くの欠点を有している:凍結切片から作成したスライドは、「品質の均一性・・
・を有していない」;「検査される同一標本の連続切片を作るには技術的に、よ
り困難である」;「充分に薄い切片を確保し、標本の細部の破損の可能性を避け
るために、標本を切削するのに極度の注意を働かせねばならない」;そして全て
のスライドは「最初の冷凍状態にある間に」調製されなければならない。なぜな
ら「もし、組織が溶け、切片とされるのに再凍結されると、ひどく損傷されるか
らである」(米国特許第3,961,097号)。
いる。更に、最近のヘルスケアの焦点は、組織処理を含め種々の処置のコストを
減らすことを目標としてきた。組織処理のコストは、時間、調製および解析に要
するスペース、試薬(処理および廃棄取扱いの両方に要する量)、および必要な
人数、に関連している。より重要なことは、患者およびその医者は、治療の指針
である病理学者による評価および診断に依存している。組織処理を完了するのに
必要な時間量を減ずることは、標本を受理し、外科医へ病理学者の報告が配達さ
れるまでの期間中に経験する不安を減じることになる。
、しかし、彼らは、従来の方法に単に適度な改良を行っただけであった。組織処
理を促進するために、米国特許第4,656,047号、第4,839,194
号、および第5,244,787号は、マイクロ波エネルギーを使用している;
米国特許第3,961,097号および第5,089,288号は、超音波エネ
ルギーを使用している;そして米国特許第5,023,187号は、赤外エネル
ギーを使用している。米国特許第5,104,640号は、固定剤、安定剤、お
よび可溶化剤の血液スメアー(smear)をスライドに接着させる非水性組成
物を開示している。しかしながら、前述の特許は、診断用組織スライドを調製す
る全プロセスが、固定から開始して含浸で終了する、試料の連続処理(cont
inuous throughput)を、2時間より少ない時間で完了できる
、ということを教示または提案していない。本発明は、そのようなプロセスを提
供するものである。
の減少、実験室設備のサイズ、使用される試薬の容積、および必要な人数による
コストを減少させる、組織処理のための組成物、およびそれらを利用するための
システムを提供するにある。このことにより、手術を受けている患者に対する外
科病理の現在の実務を、迅速な応答へと変換することが可能となり、そして手術
室に近接した、病理学者による治療時点での診断を可能にするであろう。
は4から6ミクロンのオーダーでなければならない、切削によって得ることので
きる新鮮な組織の最も薄い薄片は約1mmであり、典型的な薄片は3mmのオー
ダーである。顕微鏡検査用の充分に薄い切片を作るためには、組織を硬くする必
要があり、そうすることによってより薄い切片が、例えば、ミクロトームによる
切片作成によって、得ることができる。本発明は、組織の硬化過程を大幅に加速
し、その結果、従来の1夜の処理を、全部で40分のオーダーの処理に変換する
ものである。かくして、我々は、組織が病理研究室に受け入れられた時点から2
時間より少ない時間で、ミクロトーム切片作成に適した含浸組織ブロックの調製
を可能にする、簡単、安全、低コスト、迅速かつ信頼性のある方法を開発した。
本方法は、標本の連続的な流れを可能にし、自動化に適応することができ、ホル
マリンおよびキシレンの毒性のある煙霧を除き、組織処理の標準化を可能にし、
そして従来の方法よりも比較的少量の試薬を必要とするものである。本発明によ
り、新鮮な、または前以て固定された組織のいずれも処理することができる。
来の方法では喪失した組織構造および形態を保存することを可能にする。
A抽出が、従来の処理方法よりもよりよく保存されることを示している。それで
、病院および他の環境で得られた組織は、研究室に送達後直ぐに組織学および遺
伝子研究の両方のために処理することができ、資料としての材料が、将来の研究
およびその他の応用に使用し得ることになる。遺伝子材料の取得、資料としての
遺伝子材料の安定性、遺伝子材料のサイズおよび完全性、および遺伝子材料の化
学的変化の低減が、公知技術に比較して、改善されることが期待され得る。
よび装置を提供するものである。「連続処理」は、数分遅れて、追加の試料にシ
ステムをアクセスすることを意味する。それゆえ、任意の与えられた時間で、組
織の試料が、処理の異なった段階にある。別の言葉では、我々の方法では、組織
処理の種々のステップに沿って、標本の連続処理および流れがある。我々の方法
とは対照的に、従来の方法が8時間より長い時間を要するために、バッチ処理が
現在必要とされている。試料は、全体の機器のサイクルが完了するまで追加試料
にアクセスすることができない、自動機器に置かれる。全てのこれら組織試料は
、機器のサイクルの任意に与えられたステップにおいて、同じ処理段階にある。
、非水性試薬を提供することにある。
、毒性物質の必要性を取り除くことにある。
去される。使用される適当な混合物は、固定剤および脱水剤を含む非水性溶液、
好ましくはケトンおよびアルコールであり;アルコール対ケトンの容量比は約1
:1から約3:1の間である。組織標本は、約25分より少ない時間、好ましく
は15分より少ない時間、そして更により好ましくは5分より少ない時間、イン
キュベーションされる。インキュベーションは、好ましくは約30℃と65℃の
間、より好ましくは約40℃と55℃の間、そして最も好ましくは約45℃と5
0℃の間である。
。本発明のこの様相における好ましい溶液は、アルコールおよび洗浄剤である。
この処理は約5分より少ない時間で完成する。
溶液中で洗浄されそして含浸される。好ましくは、この処理は、約5分より短い
時間で完成される。切片作成に先立って、含浸された組織標本は含浸剤中に包埋
される。
に含浸される。組織標本の脱水に一致して、ワックス溶液の水分含量はできるだ
け低いことが好ましい。それゆえ、ワックス溶液は、溶解している水分を蒸発す
るためワックスを加熱して、および減圧下で脱気して、含浸の前に調製される。
組織標本の含浸は、組織標本から溶媒を除去するため、およびワックス溶液を組
織標本に引き入れるために、大気圧より低い圧力下、および昇温下で行われる。
減圧は、試料中に存在する溶媒の拡散を加速し、蒸発温度を低くすることによっ
て含浸時間を減じる。ワックス溶液は、脱気パラフィンおよび/またはミネラル
オイルを含む。組織標本の含浸は、約15分より少ない時間で完了する;好まし
くは、約10分より少ない時間で完了する。切片作成の前に、含浸した組織標本
は、組織ブロックを形成するため含浸剤に包埋される。
することであり、少なくともそのいくつかは、同時に、固定、脱水、脂肪の除去
、および含浸、の1つ以上の仕事を実行する混合物である。混合物は、固定剤、
脱水剤、および脂肪溶媒(例えば、ケトンおよびアルコール)を含む。別の溶液
は、固定剤、脱水剤、脂肪溶媒、および洗浄剤(例えば、アルコールおよびキシ
レン)を含む。更に別の溶液は、洗浄剤および含浸剤(例えば、キシレンおよび
パラフィン)を含む。組織標本は、異なった鎖長(例えば、室温で、液体である
ミネラルオイルおよび固体であるパラフィン)の混合物を含むワックス溶液中で
含浸される。好ましくは、混合物は少なくとも2つの異なった化学薬品(例えば
、アルコール)を含有する。
水剤−脂肪溶媒−洗浄剤、洗浄剤−含浸剤)、組織標本内を1様に加熱するため
の熱源としてマイクロ波エネルギー、および減圧源を使って圧力を減じることに
より、低減することができる。溶液の組織標本内への拡散および化学薬品の置換
は、機械的攪拌、加熱、減圧、あるいはこれらの組み合わせによって促進される
。
溶液に加えることによって加速される。固定増強剤はポリエチレングリコール(
PEG)、モノ−およびジメチレングリコール、プロピレングリコール、ポリビ
ニルピロリドン、その他であり;使用されるポリマーは約100と約500の間
の平均分子量、好ましくは約300の分子量である。界面活性剤は、ジメチルス
ルホキシド(DMSO)、ポリオキシエチレンソルビタンエステル(例えば、T
WEEN−80)、ジメチルスルホコハク酸ナトリウム、中性家庭用洗剤、その
他である。
例えば、アセチルアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオ
キサール)、アルコール(例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール
)、酢酸、酢酸鉛およびクエン酸鉛、水銀塩、クロム酸およびその塩、ピクリン
酸、四酸化オスミウム、その他である。
、プロピルアルコール、ブタノール、イソブタノール、エチルブタノール、ジオ
キサン、エチレングリコール、アセトン、アミルアルコール、その他で脱水され
る。
うな有機溶媒と共に除去される。
ーテル、二硫化炭素、四塩化炭素、ジオキサン、丁子油、シーダー油、その他で
ある。
ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、寒天、ゼラチン、ニトロセル
ロース、メタクリル酸樹脂、エポキシ樹脂、その他のプラスチック媒体、その他
に、含浸および/または包埋される。
される組織片である。また、いかなる生体液(例えば、腹水、血液、胸膜浸出液
)からの単一の細胞、あるいは固体臓器の吸引または体腔の洗浄から得た細胞懸
濁液を称する。単一細胞は、処理の前に沈降または浮力遠心分離によってペレッ
トにされる。
合せが保存されねばならないような、組織標本に特に適している。そのような標
本は、好ましくは、その最小の寸法で約3mmより小さい、より好ましくは、約
2mmより小さい、更により好ましくは、約1.5mmより小さい、そして最も
好ましくは、約1mmより小さい、組織薄片である。
で2−3時間固定)、または固定したもの(例えば、10%ホルマリンまたはそ
の他の固定化剤で1夜固定)である。上記発明は、固定から含浸までの組織標本
の処理が、約2時間より少ない時間、好ましくは約90分間より少ない時間、よ
り好ましくは約1時間より少ない時間、更により好ましくは約45分間より少な
い時間、そして最も好ましくは約30分間より少ない時間、処理されることを許
容する。組織標本が、固定されまたは部分的に固定されると、それに従って処理
時間が短縮される。組織は、手術室から病理研究室に水溶液中で運搬される;そ
のような運搬液は、ここに記載した、水性バッファーと非水性混合物の等容量か
らなる。
織標本を包埋するのに使用する試薬は、好ましくは、含浸に使用した材料と同じ
であるが、しかし、異なった含浸剤も、また、使用し得る。ブロックとなった組
織標本は、約1ミクロンと約50ミクロンの間、好ましくは約2ミクロンと約1
0ミクロンの間、の組織切片を作成するためにミクロトームに装着することがで
きる。組織切片は、更に、組織化学染色、抗体結合、in situ核酸ハイブ
リダイゼーション/増幅、あるいはこれらの組合せのためにに処理される。次い
で、組織標本は、典型的には顕微鏡によって検査される。しかし、細胞の性質を
検出するための他の技術も、処理した組織標本を検査するために使用され得る(
例えば、自動化サイトメトリー、オートラジオグラフィー、核酸の電気泳動)。
、脱水、脂肪除去、および含浸のステップを、約2時間より少ない時間で完遂す
ることができる;このことは、病理学者が、試料を受領後短時間に、多分患者が
手術中か回復室にいる間に、評価することを可能にする。病理診断に必要な時間
を減じることによって、患者の不安を減らすことができる。組織標本の厚さの低
減、混合物を含む非水性溶液の使用、高められた温度および攪拌による溶液交換
、マイクロ波放射による組織および溶液の均一な加熱、減圧下での含浸、または
それらの組合せによって、迅速かつ連続処理が完遂される。
らのステップは、組織を処理する前に適当な大きさにトリミングすることにより
、そして、そのような組織ブロックを保持し、固定、脱水、脂肪除去、および含
浸するための溶液の間の運搬を容易にするカセットを用いることによって、促進
される。
によって細胞形態が保存される。化学薬品固定がないと、内酵素が細胞を異化し
溶解し、そして組織の組織学が変ってしまう。そのような固定剤は、ケトン、ア
ルデヒド、アルコール、酢酸、重金属、クロム酸、ピクリン酸、あるいは四酸化
オスミウムである。不適当な固定を示唆するものとして、以下を含み得る:組織
構造の解離、組織切片中の気泡、貧弱で不規則な染色、萎縮した細胞、細胞質の
凝集、濃縮したはっきりしない核クロマチン、および赤血球の自己融解/溶血。
剤で置換することは、また、次に脱水剤を含浸に使用する材料で置換するのを容
易にする。この溶液交換は、脱水用揮発性溶媒の使用によって強化される。脱水
剤は、低分子アルコール、ケトン、ジオキサン、アルキレングリコール、または
ポリアルキレングリコールである。標本の脱水に失敗すると、不十分な含浸、切
片作成中の貧弱なリボンの形成、組織切片の裂け目、構造の解離、組織切片中の
水の結晶、および貧弱な染色、をもたらす。
れる。不十分な脂肪除去は、組織切片のアーチファクト(artifacts)
の拡散、組織切片のしわ、および貧弱な染色、をもたらす。
不透明度を減じる。洗浄剤の例は、キシレン、リモネン、ベンゼン、トルエン、
クロロホルム、石油エーテル、二硫化炭素、四塩化炭素、ジオキサン、丁子油、
またはシダー油を含む。
ン、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、寒天、ゼラチン、ニト
ロセルロース、メタクリル樹脂、エポキシ樹脂、またはその他のプラスチックの
ような、含浸剤によって硬化される。含浸した標本をブロックに置き、ミクロト
ームナイフで10ミクロンまたはそれより薄い切片を得る前に、細胞形態の適切
な保存と共に、組織標本の適切な硬化が必要とされる。好ましい含浸材料は、市
販のワックス類、異なった融点のワックスの混合物(例えば、流動ミネラルオイ
ルおよび固形パラフィン)、パラプラスト、バイオロイド、エンベドール、プラ
スチック、その他である。パラフィンは、安価であり、取り扱いやすく、そして
この材料によってもたらされる構造の統一性によってリボン切片を得るのが容易
になるので、本明細書の実施例の中で使用するのに選ばれている。
切片は、ひび割れたり、または「ばらばら」になる。組織処理は、以下の問題の
1つ以上に遭遇するとき、失敗と思われる:包埋した組織ブロックが柔らかすぎ
るか硬すぎる、切片が包埋剤とは異なった圧縮値となるかあるいは示す、切片が
柔らかである、組織リボンが形成できないか曲がってしまう、切片が砕けるある
いは破れる、赤血球が溶血する、細胞質が凝集する、クロマチンの濃縮、核封入
体の好塩基性染色、萎縮した細胞、アーチファクトの拡散、および虫食い効果。
組織化学の前に融解され、除かれる。組織切片は、復水され、染色または抗体に
より以下に記載したようにして解析される。染色が完了し、あるいは組織化学反
応が展開した後、スライドはカバーグラスをかけ、顕微鏡下で観察される。代り
に、染色または抗体付加標本は、サイトメトリー機器で検査される。組織ブロッ
クは、標本保存の目的あるいは遡及的研究用に保存される。
する。それゆえ、臨床病理研究室で日常的に採集された標本に対しても、遺伝子
研究が可能である。これらの技術の結合した力は偉大である。組織学的観察は、
1つの切片を染色または免疫組織化学によって解析し、そして遺伝子解析用に隣
接した切片から核酸を調製することによって、遺伝学との相互関係を明らかにす
ることができる。例えば、同一切片の死んだ領域と正常領域を遺伝子相異(例え
ば、突然変異、転写レベル)を検出するために比較することができ、疾病の進行
を、いくつかの時間点で試料を採取し、遺伝子相異を比較することによって特徴
づけることができ、そして腫瘍の進展を、原発ガンから転移への遺伝子相異の蓄
積に従って評価することができる。
)組織標本の連続投入、およびシステムを通しての連続した流れ;(c)溶液か
らの水分の除去(即ち、非水性溶液);(d)均一な加熱(例えば、マイクロ波
エネルギー)により行われる組織の固定、脱水、脂肪除去、洗浄、および含浸;
(e)固定−脱水−脂肪除去、固定−脱水−脂肪除去−洗浄、および洗浄−含浸
のための混合溶液;および(f)脱気含浸剤と共に減圧下での組織の含浸。これ
らの特色は、本発明を簡便で、実用的で、実行容易であり、かつ、自動化にかな
うものにする。
理学者による比較の標準と考えられる。更に、本発明は、一般的に文献、例えば
、Thompson(組織化学および組織病理学方法抜粋、C.C.Thoma
s,Springfield,Illinois,1966)、Sheehan
and Hrapchak(組織技術の理論および実際、C.V.Mosby
,St.Louis,Missouri,1973)、およびBancroft
and Stevens(組織学の技術の理論および実際、Churchil
l Livingstone,New York,1982)、に記載されてい
るような、トリクローム、レチクリン、ムシカルミン、およびエラスチック染色
を含む他の染色と両立し得ることが発見された。そのような染色手順は、完成に
ほんの5分を要するだけのFisher Scientificから得られる急
速染色法があるものの、完成には30分から数時間を要する。
。ガンの手術については、染色組織切片から病理学的診断を提供する能力があり
、患者が手術室から離れる前に使用可能な情報を外科医に提供できる。例えば、
ガンが切除組織に限定されているという病理学者からの指摘は、外科医に処置を
保存的にし、近隣の健全な組織を保存することを可能にする。代りに、ガンが切
除臓器に限定されていないという病理学者による所見は、患者が手術室に未だい
る間により侵襲的な外科治療を可能にする。
らは以下を含む:脳、胸部、ガン(例えば、大腸、鼻咽喉、胸部、肺、胃)、軟
骨、心、肝、腎、リンパ腫、髄膜種、胎盤、前立腺、胸腺、扁桃、臍帯、および
子宮。ミネラル化組織(例えば、骨、歯)は、本発明によって処理する前に脱石
灰が必要である。例えば、組織は、Stephens Scientific(
Allegiance Healthcare Supply,カタログNo.
1209−1A)から得られる塩酸/エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液
により、製造者の指示書に従って脱石灰される。
発明は、抗原が回収され保存されている組織標本を提供し、固定剤の選択は、特
定の抗原の回収および保存のために最適化され得る。非特異的結合部位は、ブロ
ックされ、抗原が特異的抗体により結合され(即ち、1次抗体)、そして非結合
抗体は除かれる。もし、プローブまたはシグナル発生部分により標識されていれ
ば、1次抗体は直接検出されるが、しかし、プローブが1次抗体に特異的に結合
するタンパク質(例えば、2次抗体)に結合していることが好ましい。2次抗体
は、1次抗体の重鎖または軽鎖定常部に対して上昇される。これは、各1次抗体
は多くの2次抗体と結合するので、抗原−抗体結合によって発生したシグナルを
増幅する。これとは別に、ビオチン−ストレプトアビジンのような、その他の特
異的作用を通して増幅が起こり得る。抗体結合は、高価な試薬の使用を減じ、高
い結合率を保つため小容量で実行される;この小容量の蒸発は、加湿箱でインキ
ュベーションすることにより減少される。シグナル発生部分は、組織に存在しな
い酵素が望ましい。例えば、アルカリ性ホスファターゼおよび西洋わさびペルオ
キシダーゼは2次抗体に結合され、あるいはストレプトアビジンに結合される。
可視的に検出できる色素原、蛍光、または発光産物を発生するこれら酵素のため
の基質は、入手可能である。
抗原の局所発現に使用できる。抗原の発現は、細胞または組織型、発生段階、腫
瘍予後マーカー、退化代謝過程、あるいは病原体による感染、を同定できる。
鏡により、それぞれ、放射能、蛍光、またはコロイド金属プローブで、可視化さ
れる。類似のプローブが、遺伝子突然変異または転写を同定するため、in s
ituハイブリダイゼーションにより、組織切片の核酸を検出するために使用さ
れる;別の云い方をすれば、核酸(DNAまたはRNA)は、組織切片から抽出
され、そして更に遺伝子解析する前にブロッティング、または増幅により直接解
析される。
われ、あるいは突然変異は、体性的である可能性があり、疾病病因における遺伝
子変化を決定するのに使用される。疾病は、代謝または神経的な不全、悪性度、
発生上の欠損、あるいは感染原に起因する。本発明は、簡単な手順で室温保存に
より遺伝子解析用の材料を保存する。
を大量に与える組織を保存することが想像される。
続した組織を処理する場所、例えば、単一組織処理単位または領域、が提供され
る。非制限的実施例によれば、適当な組織処理装置は、図3に描かれている。
最終的な検査のための適切な組織試料を調製することである。典型的には、対象
となる組織の薄片を調製する。できるだけ薄いスライス、厚さ、約1ないし3m
m、好ましくは1ないし2mmのものが得られる。処理時間は、処理される組織
試料の大きさに比例する。組織スライスは、組織が次のステップに移る直前まで
の間収納される組織カセット中に置かれる。次いで、組織カセットは、本発明に
従って提供される第1溶液中に置かれる。
方法が記載されているようにそれ自身が、実質的に連続したものであり、あるい
は限定された別の数の、類似した組織カセットと共に、従来のビーカー12内に
置かれる。ビーカー12は、図4に記載されているように、シェーカーバス16
内に置かれ、ゆっくり攪拌され、同様に加熱される。我々は、この目的のために
、LAB−LINE/DUBNOFFインキュベーター−シェーカーバスを使用
した。組織試料が曝露され、そして、実際、最終的に脱水されるのに水分を最小
限にする目的のため、水よりもむしろ、我々は、シェーカーバス16中の温度伝
導液18としてグリセリンを選んだ。グリセリンは、熱エネルギーの効率的な伝
同体であり、しかし蒸発しないという有利な点を有している。蒸発は、組織が処
理される環境の湿気を望ましくないように増加させ、そして定期的な補充を必要
とする。グリセリンは補充も環境に対して湿気を加えることもないので、最も好
ましい。処理のこの段階で、組織試料(カセット10の中)を、シェーカーバス
18中で約3−15分、第1溶液中で処理する。
外部ポンプ(A)(図3)が、それからチューブが、バブリング用の溶液ビーカ
ー12または他の受容器に挿入されており、その内容を攪拌している。通気拡散
ノズルまたはプレートが、より均一な溶液の攪拌が必要と思われるか望ましい場
合に行えるように装備されている。
に保つため、我々は、従来のシェーカーバスを改良して、例えば、4つのワイヤ
ーのような横断索または支索20や、例えば、組織カセットを含むビーカー12
が配置されている5つの縦のチャンネルのような境界をこしらえた。かくして、
新しい試料をシェーカーバスの左端で加え、充分に処理された試料をその右端か
ら取り去ることによって、例えば、ビーカー12の試料は規則的にシェーカーバ
ス18に加えられ、そして、充分に処理された組織試料がそれから順番に取り去
られ、以下に記載するように更に処理が行われる。
ら、1連の液に曝露される。目下提案されている実施態様においては、図3に示
すように、3つのマイクロ波ユニットがあり、それぞれは、組織試料含有カセッ
トが所定の時間水浸されている、異なった溶液を有している。代りに、単一のマ
イクロ波エネルギー源を供給することもできる。しかしながら、そのようにする
と、組織カセットを受けるために、それぞれの溶液の連続した配置が必要となる
。単一の組織試料に対しては、そのような溶液の配置および再配置は、組織処理
サイクルの時間を著しくは増加させないが、複数の溶液を受けるのに単一のマイ
クロ波を使用すると、続く試料に関して処理の連続性を妨げることが認められる
。実際、1連のマイクロ波ユニットであると、ある組織試料が1つのマイクロ波
ユニットから、次の溶液を有する次のマイクロ波ユニットに移動するに従い、次
に続く組織試料を、最初のマイクロ波ユニットで受けることができる。それゆえ
、それぞれの溶液の各々に対してユニットを設けることは、次に続く組織試料が
、進行中の試料の全てのマイクロ波処理ステップが完了するまで保持される必要
がないことを意味する。しかしながら、連続性の顕著な妨害を伴って、図示した
3つのマイクロ波ユニットを、2つまたは1つに減ずることもできることが理解
されるべきである。同様に、処理の他のステップも、処理の連続性対人手、装置
、スペースの必要度の潜在的減少のバランスから、必要があればあるいは望まし
いならば、統合したり、部分統合することもできる。そのようなよりコンパクト
なユニットの例示は、以下において、図7を参照しつつ、詳細に考察する。
イクロ波照射を適用するために、我々は、Energy Beam Scien
ces Inc.製の実験室用マイクロ波オーブンを一時的に使用した。我々は
、2つのマイクロ波処理モデル、H−2800およびH−2500を使用した。
類似のシステムのいずれも使用することができる。例示として、Pyrexまた
はその他の透明でマイクロ波に使用できる液体受容器24が、3つのマイクロ波
ユニットの各々において本発明に従って供給される、それぞれ、2番、3番、お
よび4番溶液を保持するために使用される(図3)。温度プローブ26が、それ
ぞれのバスの温度が所望の範囲内にあることを保証するために溶液内に置かれて
いる。更に、組織処理を加速する、攪拌を行うため、通気が行われる。使用され
たマイクロ波ユニットは、通気用チューブ28を有している。単一のチューブが
バスに挿入されるが、より均一で完全な攪拌のためには、攪拌用の気泡を拡散す
るための、ガスチューブ28と協同する、拡散プレートまたはノズルヘッド(詳
細には示さない)を、例えば、溶液の全容積を均一に攪拌するための溶液受容器
の実質的な直径部分を横断して、設けることが最も好ましい。そのような拡散プ
レートおよびノズルは周知であり、例えば溶液受容器の基盤に、設けることがで
きる。
ンから有機溶媒を除く。この処理を強化するため、およびシステム内でパラフィ
ンを再使用するため、我々は、連続脱気を提案する。これは、カバーしたPyr
ex32を640mmHg以内に減圧を保つことにより達成される。
示すように、パラフィンバス中に置く。一時的に、カバーしたPyrex ja
r32内におかれた3つのパラフィンバスステーション(ビーカー)30を含む
パラフィンバスが設けられる。温度制御のために、Pyrex jar32は、
例えば、Poly Science印湯浴34、内に置かれる。蓋およびjar
の両方のフランジの内部縁にグリースまたは類似品をつけ、蓋とjarの間に気
密が保たれるようにし、蓋につけたホースコネクターを通して真空に引くことが
できる。ModelNo.01−092−25が使用された。Pyrex ja
r32内を真空にするため、通常の加圧/真空ポンプ38が、コネクター36に
つながったチューブ40につながれる。適切なそのような電動ポンプはFish
er Scientificから入手でき、例えば、100psi maxを有
するものである。攪拌は、好ましくは、振動攪拌、超音波、または通気攪拌のい
ずれかにおいて、パラフィンバスステップ中、行われる。
kuraから市販されている、通常のTissue−Tek包埋コンソールシス
テム(I)(図3)、例えばModelNo.4708、を使用する。
して配置のために浮かせる(M)。我々は、Leitz1512ミクロトーム、
およびLipshaw Electric Tissue Float Mod
el375を使用する。
る。我々は、Fisherから入手したIsotemp Oven300シリー
ズを使用した(図3)。
節約するため自動染色機(O)(図3)を使用することを推薦する。非連続処理
には、バッチでスライドを染色する、Sakura多様染色機DRS−601を
使用することができ;代りに連続処理には、Leica自動染色機XLを使用す
ることができ、これは、脱ワックス工程を含んでいるので、オーブンでの別のイ
ンキュベーションは省略できる。固定され、染色された組織試料は、例えばTi
ssue−Tekカバーグラス、製造者No.4764(R)(図3)で、カバ
ーされる。
連続なユニットの連続とすることができる。代りに、上記に記載したように、1
つ以上のステップを、単1処理部品またはユニットで行うこともできる。また、
上記で考察したように、提供されるユニットの数および各ユニットによって実行
されるステップは、処理ユニットの連続性に影響を与える。従って、低容量の環
境においては、複数の組織処理ステップを実行するため単1ユニットが有利であ
り、組織処理の連続性に著しく影響を与えない。高容量のシステム環境において
は、2あるいはそれより多いユニットが好ましい。
サブユニット;マイクロ波プロセッサーユニット44および含浸ユニット46、
を含む。マイクロ波プロセッサーユニット44は、処理される組織を連続的に溶
液A,溶液B、および溶液Cに浸け、おのおの溶液を攪拌し、マイクロ波エネル
ギーを組織に照射するために、使われる。このように、図解した実施態様におい
て、容器48は、例えば、1つ以上の組織カッセット10が置かれている1つ以
上のトレー50を受けるために使われる。容器48は、組織脱水用の溶液の各々
の源と液体でつながっている。それゆえ、組織カセットが受器トレー50に置か
れると、溶液Aは容器48に運ばれ、例えば、通気チューブ(図7には図示せず
)を経て攪拌しつつ、マイクロ波エネルギーが連続的に与えられる。充分な時間
曝露が行われた後、溶液Aは吸引され、そして組織カセットは、好ましくは、溶
液Bまたは溶液Aと溶液Bの混合物と共に流され、残余の溶液Aは十分に除かれ
る。次いで、溶液Bが容器48に供給され、そこで、所定の時間マイクロ波エネ
ルギーおよび攪拌が再び適用される。溶液Bの供給が終わると、溶液Bは、貯蔵
容器に戻り、組織試料は、溶液Cまたは溶液Bと溶液Cの混合物で流される。そ
の後、溶液Cが、容器48に供給され、攪拌およびマイクロ波エネルギーが与え
られ、そして最終的に溶液Cは吸引される。組織試料は、そこで、含浸のための
準備ができることになる。
る。これによって、次の組織試料がマイクロ波エネルギーを受ける間に含浸され
ることが可能である。もし、単一ユニットが使われるなら、マイクロ波処理に使
用される容器を含浸に使用し得るが、しかしマイクロ波エネルギーは、含浸ステ
ップ中は適用できない。
えば容器54の好適なトレー52に配置された組織カセットに適用され、組織調
製処理の採集ステップとして組織試料の含浸を効果ならしめるために、連続パラ
フィンバスに移される。含浸サブユニット46において、組織試料は、制御され
高められた温度で減圧下に置かれる。組織試料は、好ましくは、また、このステ
ップの間、マグネチックスターラー、超音波、また空気泡立てにより攪拌される
。
行われる。
に従って、組織処理を容易にするために開発された。これら特別にデザインされ
た機器および器具は、以下に記載される。
水および固定時間の最小化に関しては、脱水処理に先立って、できるだけ薄く組
織をスライスすることが望ましい。薄片の作成を容易にするため、我々は病理学
者を助ける3つの機器を提案した。図8に図解したように、便宜的に薄切ガイド
60と称する1つは、例えば厚さ1ないし2mmのオーダーの薄い金属プレート
で、例えば、親指の爪(約1cm2)の巾の切抜き64を有する、形のものであ
る。ストップ66は、切抜きまたはノッチ64の端でナイフまたは刃のストッパ
ーとして作用するものと定義される。平らな表面またはその他の切削表面から薄
切ガイド60を取上げるのを容易にするため、リップ68が切断ノッチから離れ
て金属プレート62の端に装備される。組織の薄切をつくるため、組織のより大
きな部分が切抜きまたはノッチ64の上に置かれ、そのためその部分がノッチに
配するようになる。組織の露出した表面に圧力がかけられ、そしてそれに対して
切削装置が置かれ、組織の残りからノッチ64に配置された組織を切るために薄
切ガイドに沿って水平に滑らされる。切削刃と刃ストッパー66の連動で切削処
理が完了し、刃の上に配置された、組織の塊は横に置かれる。スロットに配置さ
れている、残りの組織は、次いで、脱水および含浸のために適当なカセットに置
くことができる。
さの組織の薄片を作るのを容易にする。
別の通常の鉗子72の端に平坦なプレートまたはブロック70をつけることを提
案した。ブロックは、鉗子の端に永久または1時的に固定されている。切断され
る組織は、締め付けているブロック70の間に置かれ、鋭い刃が締め付けたブロ
ックの間を組織を薄切するように通過する。2つの大体平面の平らな表面74の
1つに近接して切るために、大体均一な厚さの薄い組織片を得ることができる。
平行したむしろ大きな平らな表面は、切削処理の間組織をその位置に保つことで
均一な圧力分布を与え、組織の完全さを好適に保つ均一な切削を確実にする。
ーク様器具92を提案した。図解した実施態様において、歯94は互いにおよそ
1センチメーター間隔を占め、各々は、最小の破損で組織を容易に貫くように鋭
い、とがった先端96を有している。器具92の歯94で組織をカッティングボ
ードに保持することによって、組織の好適な薄片を、歯に平行にあるいは間を切
ることにより得ることができる。図示した実施態様において、器具92は、歯が
種々の標本に合わせて5−10cmのオーダーの長さを有し、約8センチメータ
ーの長さのハンドルが歯から2−4センチメーターの間隔であって、切削中の装
置の操作と正確な把持を容易にする、ということで特徴付けられる。我々は、ホ
ーク様器具92は、腸や胆嚢のような臓器から切片標本を得るために特に有利で
あることを見出した。実際、そのような標本を歯94で確保すると切削処理中相
互のすべりから組織の種々の層を保護する。
られた断片の運搬を容易にするため、手術室で使用される組織受容ユニットおよ
びカセットを作ることを提案した。針生検したような組織が直接、例えば、適当
な溶液のジャーに入れられると、研究室の技術者にとって、ジャーから小さい組
織試料を回収することは、そして特に、全ての生検組織を確実に回収するのは、
しばしば困難となり得る。それゆえ、図11および12に図示したように、我々
は、そのような小さな組織試料を直ちに受け取るための、手術室向けの組織カセ
ット10′を作ることを提案した。
空間のプラスチックフォームである、バイオプシースポンジの薄いシートで、少
なくともその1部に局部的な深さの凹部82で、その中に他のバイオプシースポ
ンジと共に、生検組織を受け入れる区画を設けたものを提供した。このようにし
て、手術室で生検組織を、バイオプシースポンジ80の1つの凹部80に、直ち
に配列し、そして組織カセット10を閉じることができる。処理する実験室に運
ぶのに組織の安全を維持するため、組織カセット10′は適切な溶液のジャーの
中に置かれる。カセットの回収が容易なように、そして溶液の中に完全に浸され
ているように、我々は、蓋90から突き出ている柱状支持体88を有し、そして
組織カセット10′上の補完構造物84に結合するための、蓋90の先端に構造
を有する標本ジャー86を用意した。図12は、頂部表面に接合状態の組織カセ
ット10′を示す。しかし、カセットの底面あるいは蝶番側のような、代りの接
合点も可能である。さらに、2つ以上のカセットが柱状支持体88に接合するこ
ともできる。
端に1時的に確保でき、そして運搬に適した溶液に入れることができる。組織処
理実験室では、蓋90はジャー86から外され、組織カセット10′は柱88か
ら外される。どのような適当なファスナー、例えば、ベルクロタイプファスナー
、プラスチックスナップロック、あり組み(dove tail)スライドコネ
クターあるいはその他の協同連結構造も、組織カセット10′を支持柱88に接
合することができる。標本ジャー86内の溶液は、運搬(水性)溶液あるいは第
1(非水性)溶液であり得る。ジャーの外側に結合したカセットと共に、手術室
に標本ジャーを届け、組織がカセット内に入れられた後に、蓋を逆さにして、カ
セットがジャーの中の溶液に浸されるようにすることが便利である。
ける従来の方法を超えた多くの進歩性を有している。
は、外科介入と病理学的評価の間の迅速、あるいはむしろリアルタイム、臨床関
係を可能にする。このことは、疾病の診断、予後、および治療計画を待つ間の、
最小の患者の不安を除くあるいは減じることによる、患者ケアの顕著な改善をも
たらす。
室のスペース、病理学の専門技術、ならびに事務および技術の人員をより効率的
に利用できる。連続した仕事の流れは、標本を処理し評価する病理学者の経験お
よび責任を改善し、標本の処理および評価に要した病理学者の数を減らし、そし
て、また、医学教育、特に専門医学実習プログラムの経験および責任を改善する
。
レンの除去、および減少した他の有害な化学物質の必要性は、研究室の環境およ
び安全性の改善に有益である。
る。ホルムアルデヒドの使用、および/または、長時間の処理による組織学上の
アーチファクトは除かれる;それゆえ、正常および疾病組織の顕微鏡形態のより
精密な評価が可能になる。同様に、抗原の検索および染色が改善される。遺伝子
解析のためには、ホルムアルデヒド誘導DNA突然変異が除かれ、保存参考材料
からの核酸抽出が高められる。貯蔵されていた、固定パラフィン包埋組織からの
RNA研究の可能性は、診断および研究への応用に対し、無限の道を開くことに
なる。
して、参照することによって、ここにとり入れられる。
れらによっていずれにせよ限定されず、あるいは制限されるものではない。
、以下の組成の非水性第1溶液中に置いた: 40%イソプロピルアルコール、 40%アセトン、 20%ポリエチレングリコール(平均分子量300)、および 1%ジメチルスルホキシド(DMSO)(即ち、上記混合物の10ml/l)
。
ートした。固定用の400ml溶液を、水浴シェーカー中の500mlビーカー
に置いた(5cm/秒の直線的変換)。固定溶液の追加攪拌はエアーポンプでの
バブリングで行った。
、第2、第3および第4溶液)に、組織標本を、Energy Beam Sc
iencesの3つのマイクロ波オーブンの各々の1つに、連続的に曝露するこ
とによって達成される。1500mlビーカー中の70%イソプロピルアルコー
ルおよび30%ポリエチレングリコール(平均分子量300)の1リッター溶液
を第1オーブン(model−H2800)内に置き、第2オーブン内の溶液は
、1500mlのビーカー中70%イソプロピルアルコールおよび30%キシレ
ンの1リッターからなり、そして第3オーブン(model−H2500)は1
500mlのビーカー中キシレン1000mlおよびパラフィン300mgの溶
液を含有している。DMSOの10ml/lをこれら3つの溶液に加える。マイ
クロ波照射による60℃に加熱を、第1オーブンに15分間行い、そして第2お
よび第3オーブンの各々に5分間行う(2秒サイクルで75%出力設定)。
を、パラフィンを満たした大型デシケーター内に置かれた溶融パラフィンの4つ
の500mlバス中で、そして75℃で2つのグリセリンバスに静置してインキ
ュベーションした。組織切片標本は、1つのパラフィンバスから次のバスに、全
部の含浸時間を12分とし、3分間隔で移した。各3分間隔は、圧力の読みが約
640mmHgである時間から測られた。このステップでは、攪拌は行わなかっ
た。
びパラフィン含浸、はこれら組織切片標本を、以下の継続したステップに曝露す
ることによって40分間で完了した。
液1リッターは、組織カセットに保持された60試料を固定するのに充分である
。試料を、第1溶液を含有する1連の3つのバスで、各々5分間市販のマイクロ
波処理装置(H2500またはH2800、Energy Beam Scie
nces)で、55℃にて、インキュベーションした(総インキュベーション1
5分間);溶液の攪拌は溶液交換を加速するためバブリングによった。
約1%濃度に加えた溶液中で、60℃でインキュベーションした。試料を、溶液
を含有する2つのビーカー中で、各々5分間市販の組織マイクロ波処理装置(H
2800、Energy Beam Sciences)で加熱し(総インキュ
ベーション10分間)、バブリングによって攪拌した。
、大型デシケーター中に置かれた25%ミネラルオイルおよび75%溶融パラフ
ィンのワックス溶液中で、約200mmHgの減圧下、5分間、インキュベーシ
ョンすることによって、含浸を開始した。パラフィンは、実施例1に記載したよ
うに、使用前脱気した。
フィンの4つのバス中で、75℃にてインキュベーションすることによって、完
了した。組織切片標本は、1つのパラフィンバスから、次のバスに、3分間隔で
、総含浸時間12分間かけて、運搬された。各3分間間隔は、圧力の読みが約6
40mmHgである時間で測った。
l中メチレンブルー10g)6mlを、イソプロピルアルコールおよびアセトン
の溶液の各々に加えた。組織標本は、含浸および取り扱い中に、標本の取扱いを
容易にする青色を獲得する;組織標本の浸透は、また、組織標本全体にわたって
均一な青色の観察によってモニターすることもできる。
、脱水、脂肪除去、およびパラフィン含浸は、これら組織切片標本を、以下のよ
うにして、65分間で完了することができる。
である。試料を、第1溶液を含有する1500mビーカー中で、15分間市販の
マイクロ波処理装置(H2500またはH2800、Energy Beam
Sciences)で、65℃にて、インキュベーションする;溶液の攪拌は、
溶液交換を加速するためバブリングによる。
ングリコール(平均分子量300)、10%低粘度ミネラルオイル、総容量の約
0.5%の濃度に加えた氷酢酸、および約1%の濃度に加えたDMSOの溶液中
で、インキュベーションする。試料を、溶液を含有する1500mlビーカー中
で、15分間、市販の組織マイクロ波処理装置(H2800、Energy B
eam Sciences)で、65℃にて加熱し、バブリングによって攪拌す
る。
ラルオイル、総容量の約0.5%の濃度に加えた氷酢酸、および約1%の濃度に
加えたDMSOの溶液中で、インキュベーションする。試料を、溶液を含有する
1500mlビーカー中で、5分間、市販の組織マイクロ波処理装置(H280
0、Energy Beam Sciences)で、65℃にて加熱し、バブ
リングによって攪拌する。
ーター中に置かれた、70%溶融パラフィンのワックス溶液の2つのバス中で、
約640mmHgの減圧下、5分間、各バス中でインキュベーションすることに
よって、含浸を開始する。
フィンの4つのバス中で、約75℃ないし80℃、および約640mmHgの減
圧にて、おのおの5分間、インキュベーションすることによって完了する。組織
切片標本は、1つのパラフィンバスから、次のバスに、5分間隔で、総含浸時間
20分間かけて、運搬された。各5分間隔は、圧力の読みが約640mmHgで
ある時間で測った。
、そしてガラススライドの上に浮かせる。パラフィンを、58℃のオーブン、あ
るいは好ましくは37℃のオーブン中で約18時間または1夜、スライドを置く
ことによって融解した。次いで、キシレンバス中で10分間脱ワックスした。ス
ライドを、各1分間エタノール分を減らしていった溶液(無水アルコールで2バ
ス、95%で2バス、90%で1バス)で再水和した。そして流水中に浸すこと
によって、2分間リンスした。
または6%H2O235mlと140mlのメタノール、の溶液で、15分間イ
ンキュベーションして、阻害した。スライドを流水中に浸すことによって2分間
、およびPBSに2分間リンスし、そして乾燥した。
した。過剰の正常ウマ血清はスライドから傾斜し、特異的1次抗体を、組織切片
標本上で、加湿箱中、室温にて、30分間インキュベーションした。スライドを
、圧搾瓶を使用して前後に動かしてPBSで洗い、2分間PBSバス中に浸し、
そして過剰のPBSを各スライドについて乾燥した。結合溶液(2次抗体、また
はビオチン化抗ウサギまたは抗マウス、として知られている)を、各組識切片標
本に加え、そして加湿箱中で、25分間インキュベーションした。スライドを、
圧搾瓶を使用してPBSで洗い、PBSバス中に2分間浸し、そして過剰のPB
Sを各スライドについて乾燥した。
従って展開した。ABC溶液を組織切片標本に加え、加湿箱中で25分間インキ
ュベーションした。スライドを、圧搾瓶中でPBSで洗い、PBSバス中にラッ
クで2分間浸した。ラックをDABクロモゲンのバスに6分間浸し、流水中に浸
してゆるやかに4分間洗浄した。組織切片標本を、ヘマトキシリン(染色時間は
、ヘマトキシリンの経時数による)で15秒から90秒対比染色を行った。スラ
イドを過剰の対比染色を除くため3分間流水下で洗浄し、アルコールバス中で(
各々約10秒間)85%から100%まで脱水し、キシレンで洗滌し、カバーグ
ラスをかぶせた。
ンレセプター、第VIII因子関連抗原、CD−31、CD−68、サイトケラ
チン−7、クロモグラニン、および平滑筋抗原について示された。
μlキシレンを加え、そして振り混ぜて混合し、400μl無水エタノールを加
え、振り混ぜて混合し、チューブを高速微量遠心器で5分間遠心分離し、そして
、上清を捨てた。ペレットに800μl無水エタノールを加え、振り混ぜて混合
した。
ゼK溶液(1%NP40またはトリトンX−100、2.5mg/mlプロテイ
ナーゼk2.4μl)をペレットに加え、そして55℃にて1時間インキュベー
ションした。プロテイナーゼKを、95℃にて10分間インキュベーションする
ことにより不活化した。微量遠心器で5分間遠心分離した後、DNAを含む上清
を保存する。この材料は、直ぐにPCRに使用し得る。もし、サザンブロット法
を計画しているなら、更に、沈殿および/または抽出を行うべきである。制限酵
素による解析用に、充分なDNAを得るためには、より多くの切片標本が必要で
ある。
DNAは、本発明に従って調製した試料(実施例1)と従来の組織調製処理(T
issue−Tek VIP 組織処理機、Miles−Sakura,製造者
の指示書に従って使用した)の間で比較できる。
用して切削した;ブロックは本発明に従って調製され、従来の組織処理は実施例
5に記載により調製された。それらを、50mlFalconチューブに置き、
キシレン20mlで脱パラフィン化し、残余の組織を無水アルコールで、30分
間、2回洗滌した。組織は、4Mグアニジンチオシアネート、25mMクエン酸
ナトリウムpH7.0、0.5%N−ラウリルザルコシン、および0.1M−2
−メルカプトエタノールを含有する溶液に0.5g/ml懸濁した。溶液は、か
き混ぜて混合し、DNAは18ないし22ゲージの注射針を通して、剪断した。
.7M−CsClの2.8ml上に注意深く重層した、そしてRNAを、Bec
kman L8−53超遠心分離器で35,000rpm、18℃、14時間、
SW55T1ローターで、遠心分離により沈殿させた。頂上のフラクションは、
注意深く除いて、チューブの底のRNAペレットを残した。ペレットをリボヌク
レアーゼを含まない水に再懸濁し、エッペンドルフチューブを14,000rp
mで10分間、遠心した。RNA含有上清を保存し、UV吸収を測定した:吸光
係数1OD280/cmは40μg/mlRNAであり、OD260/OD28
0比は約1.8と約2.0の間でなければならない。総量45μgのRNAが、
本発明に従って調製した組織標本から抽出された、これに対し、従来により処理
された組織標本からは、RNAは検出されなかった(図13B)。
えられているかに関して記載されたものであるが、本発明は、開示された実施態
様に限定されたり、あるいは制限されたりするものではなく、反対に、付随する
特許請求の範囲の精神および範囲内に包含される、種々の変形例および均等な組
合せを保護することを意図していることが理解される。
当業者に自明であり、そしてそのような変形は、特許請求の範囲内に来ることが
意図されていることが、理解されるべきである。
切片の顕微鏡検査から準備することができることによる診断の時、の間にほとん
ど24時間が過ぎることを示すフローチャートである;
た外科医が、2時間より少ない時間で利用することができることを示すフローチ
ャートである;
;
のシェーカーバスを示す;
のマイクロ波オーブンを示す;
のパラフィンーバスを示す;
/含浸ユニットの模式図解である;
イドの模式図解である;
び切削組立品の切断図である;
器の模式図解を示である;
織カセットの模式図解である;
および運搬ジャーを示す;そして
RNA、それぞれの、アガロースゲル電気泳動を示す。図13Aにおいて、レー
ン1は分子量標準を含み、レーン2は本発明に従って処理した組織標本からの稀
釈試料を含み、レーン3−4は本発明に従って処理した組織標本からのDNA試
料を含み、そしてレーン5−6は従来の方法に従って処理した組織標本からのD
NA試料を含む。図13Bにおいて:レーン1、4および6はブランク、レーン
2−3は、従来の方法に従って処理した組織標本からの試料であり、レーン5は
、本発明に従って処理した組織標本からのRNA試料を含み、そしてレーン7は
対照RNAを含む。
Claims (39)
- 【請求項1】 (a)組織標本を固定し、 (b)組織標本を脱水し、 (c)組織標本から脂肪を除去し、そして (b)組織標本を含浸する、 ことを含む組織学用組織標本の調製方法であって、組織標本を固定し、脱水し、
そして脂肪を非水性溶液で除去し、それにより組織標本は、2時間またはそれよ
り少ない時間内で組織学用に調製される、上記方法。 - 【請求項2】 第1溶液の非水性溶液の少なくとも1つが、固定剤および脱
水剤を含む、請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 第1溶液が、1と3の間のアルコール対ケトンの容量比を有
する、請求項2記載の方法。 - 【請求項4】 第1溶液が、更に、ポリエチレングリコールを含む、請求項
2記載の方法。 - 【請求項5】 第1溶液が、更に、界面活性剤を含む、請求項4記載の方法
。 - 【請求項6】 界面活性剤がジメチルスルホキシドである、請求項5記載の
方法。 - 【請求項7】 非水性溶液の少なくとも1つが、アセトン、イソプロピルア
ルコール、およびポリエチレングリコールを含む第1溶液である、請求項1記載
の方法。 - 【請求項8】 組織標本が、第1溶液中で25分より少ない時間インキュベ
ーションされる、請求項2記載の方法。 - 【請求項9】 組織標本を洗浄することを更に含む、請求項1記載の方法。
- 【請求項10】 組織標本を固定し、脱水し、脂肪を除去し、そして非水性
溶液中で洗浄することよりなる、請求項9記載の方法。 - 【請求項11】 非水性溶液の少なくとも1つが、洗浄剤を含む第2溶液で
ある請求項10記載の方法。 - 【請求項12】 洗浄剤がキシレンである請求項11記載の方法。
- 【請求項13】 非水性溶液の少なくとも1つが、イソプロピルアルコール
およびキシレンを含む第3溶液である、請求項10記載の方法。 - 【請求項14】 組織標本が、第4溶液である非水性溶液の少なくとも1つ
の中で洗浄され、含浸される、請求項9記載の方法。 - 【請求項15】 第4溶液が洗浄剤および含浸剤を含む、請求項14記載の
方法。 - 【請求項16】 洗浄剤がキシレンである、請求項15記載の方法。
- 【請求項17】 含浸剤がパラフィンである、請求項16記載の方法。
- 【請求項18】 組織標本が、10分間またはそれより少ない時間で洗浄さ
れる、請求項13記載の方法。 - 【請求項19】 組織標本が、ワックス溶液で含浸される請求項1記載の方
法。 - 【請求項20】 ワックス溶液が、脱気パラフィンを含む請求項19記載の
方法。 - 【請求項21】 ワックス溶液が、更に、低粘度ミネラルオイルを含む請求
項20記載の方法。 - 【請求項22】 組織標本が、大気圧より低い圧力下でワックスで含浸され
る、請求項19記載の方法。 - 【請求項23】 組織標本が、ワックスで15分より少ない時間で含浸され
る、請求項19記載の方法。 - 【請求項24】 組織標本が、90分より少ない時間内に組織学用に調製さ
れる、請求項1記載の方法。 - 【請求項25】 組織標本が、1時間より少ない時間内に組織学用に調製さ
れる請求項1記載の方法。 - 【請求項26】 組織標本が、45分より少ない時間内に組織学用に調製さ
れる、請求項1記載の方法。 - 【請求項27】 組織標本が、3ミリメーター以下の厚さを有する請求項1
記載の方法。 - 【請求項28】 組織標本が、1−2ミリメーターの厚さを有する請求項1
記載の方法。 - 【請求項29】 組織標本が、約640mmHgの負圧に実質的に保持され
ているパラフィン中で含浸される、請求項20記載の方法。 - 【請求項30】 洗浄剤および脱気パラフィンを含む溶液中における組織標
本のインキュベーションを含む、組織標本の洗浄および含浸方法。 - 【請求項31】 洗浄剤がキシレンである請求項30記載の方法。
- 【請求項32】 更に、脱気パラフィン中に組織標本を包埋することを含む
、請求項30記載の方法。 - 【請求項33】 低粘度ミネラルオイルおよび脱気パラフィンを含む溶液中
で組織標本をインキュベーションすることを含む、ワックス中に組織標本を含浸
する方法。 - 【請求項34】 組織標本が、大気圧より低い圧力下でワックスに含浸され
る、請求項33記載の方法。 - 【請求項35】 更に、脱気パラフィン中で組織標本を包埋することを含む
、請求項33記載の方法。 - 【請求項36】 組織標本が、約15分より少ない時間で含浸される、請求
項33記載の方法。 - 【請求項37】 組織標本が、約640mmHgの負圧に実質的に保持され
ているパラフィン中で含浸される、請求項33記載の方法。 - 【請求項38】 (a)各セットが少なくとも1つの組織標本を含む、複数
のセットの組織標本を用意し、 (b)該複数のセットの組織標本の、第1のセットの組織標本を固定し、 (c)該第1のセットの組織標本を脱水し、 (d)該第1のセットの組織標本から脂肪を除き、そして (e)該第1のセットの組織標本を含浸し; (f)各追加のセットの組織標本について、該複数のセットの組織標本が、全
て処理されてしまうまで、ステップ(b)−(e)を繰り返し、前のセットにつ
いてステップ(e)が完了してしまう前に、該ステップ(b)を各セットの組織
標本につき開始する、 ことを含む組織学用の複数の組織標本を、順次に、実質的に連続処理するための
方法であって、各セットの組織標本は、実質的に2時間以下の時間で組織学用に
調製される、上記方法。 - 【請求項39】 該組織標本が固定され、脱水され、そして脂肪が非水性溶
液中で除去される、請求項38記載の方法。
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