CN111492223A - 组织样品制备系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备光学分析用生物组织样品(301)，从而所制备样品的体积和/或形态距原始组织的体积或形态的偏离最小化的方法(100)。该方法包括：－a)用第一固定液(202)固定(102)组织样品；－b)在脱脂液(204)中浸渍(104)组织样品，所述脱脂液包含适应于诱导样品膨胀的离液剂；－d)着染(108)组织样品；－f)在有机脱水液(210)中使组织样品脱水(112)，脱水液适应于诱导样品收缩；和－g)在有机透明化液(212)中浸渍(114)固定的组织样品。

Description

组织样品制备系统
技术领域
本发明涉及制备光学分析用生物组织样品，并且更具体地涉及组织透明化方案(tissue clearing protocols)。
背景和相关技术
组织样品的化学透明化正日益变成用于检测和重建组织样品(包括完整器官)中结构的关键手段。为了显微分析，一些组织类型薄到足以直接观察。大部分组织(例如，活检样品、厚组织样品、复杂3D组织形成如类器官或类球体、小型成年哺乳动物(如小鼠)的完整器官或完整躯体或胚胎)太厚，以至于不允许光穿过其传播。将组织切成薄切片具有丢失生物医学重要信息的缺点：生物学结构内在地是三维的(3D)。几种显微技术同时可用于(例如共聚焦显微术、双光子显微术和光片显微术)获得组织的3D图像。但是，生物标本天然地对UV-VIS-NIR范围的光学光不透明。
通常，这种不透明度的主要来源是吸收和散射。实际上，生物组织样品最终由浸渍于低折射介质(水)中的各种高折射率大分子如脂质和蛋白质构成。在生物分子的高折射率和包含这些分子的胞内水及胞外水的低折射率之间的错配产生多重散射事件，最终导致不透明的样品。光学光子已经在组织中短距离行进后，这些多重散射事件导致数目高度减少的光学光子在直路径上穿过组织行进(所谓弹道光子(ballistic photons))。越多光子在其穿过组织的道路上散射，则组织变得越不透明。但是，即便完全不存在散射，总吸收也常导致完全不透明(非透明)的组织样品。
因此，为了用显微镜检查，其尺寸超过某个阈值的标本必须“透明化”，而如本文所用的“透明化(clearing)”是如此处理生物样品，从而减少穿过样品的光的散射，例如，通过降低生物分子和周围介质之间的折射率错配做到。
如今常用的(如果并不是大部分的话)许多透明化技术基于使用有机溶剂。基于有机溶剂的透明化方法如例如uDISCO依赖于用显示折射率(RI)约1.55(即，许多组织类型的常见RI)的有机溶剂置换组织水。例如，使用苯甲醇和苯甲酸苄酯(BABB)的混合物作为有机溶剂。由于苯甲酸苄酯不溶于水中，常用基于丁醇的中间脱水步骤。这种通用方案(用有机溶剂脱水，然后在高折射率有机溶剂中孵育)是高度流行的透明化技术，但是具有几个缺点：在短时间段后，它使可能已经包含于组织中的荧光蛋白的发射猝灭，并且可以造成组织样品的明显收缩和形态变化。例如，Weizhe Li,Ronald N.Germain和Michael Y.Gerner，“大组织体积中采用透明化增强型3D显微术(Ce3D)的多重、定量细胞分析(Multiplex,quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced3D microscopy(Ce3D))”,PNAS 2017 114(35)E7321-E7330显示，CUBIC方案和iDISCO方案不利地影响组织样品形态。
发明概述
本发明的目的是提供制备光学分析用生物组织样品的改进方法、用于制备生物样品的相应系统和试剂盒，如独立权利要求中具体所述。本发明的实施方案在从属权利要求中给出。除非本文所述的实施方案和实施例不互斥，否则它们可以彼此自由组合。
在一个方面，本发明涉及一种制备光学分析用生物组织样品的方法。特别地，如此制备生物组织样品，从而所制备样品的体积和/或形态距原始组织的体积或形态的偏离减少或最小化。该方法包括：
-a)用第一固定液固定组织样品；
-b)在脱脂液中浸渍固定的组织样品，脱脂液包含适应于诱导样品膨胀的离液剂；
-d)用一种或多种染色液着染组织样品；
-f)在有机脱水液中洗涤和脱水染色的组织样品，脱水液适应于诱导样品收缩；
-g)在有机透明化液中浸渍固定的组织样品。
根据一些实施方案，至少洗涤和脱水步骤可以包括多个子步骤，例如在有机溶剂浓度渐增的一系列脱水液中使样品脱水。在有机透明化方案背景下，在具有离液剂的脱脂液中浸渍固定的组织样品可能是有利的，因为它可以允许生成具有高光学透明度的组织样品，其体积与最初所来源自的源生物的组织样品的体积相同或至少高度相似。如果欲光学地分析透明化样品以重建原始组织样品的形状和形态，这是特别有益的。在现有技术中，存在不诱导组织样品收缩的基于水的透明化方案。相反地，通常认为基于有机透明化液的现有透明化方案为组织提供更高程度的光学透明度，但一般引起样品强烈收缩。因此，本发明的实施方案可以允许在不明显程度地改变组织样品的体积和/或形态情况下，使用有机透明化液制备组织样品供进一步光学分析。
因此，本发明的实施方案可以允许基于透明化组织样品的光学分析，忠实对组织的原始3D形态成像或重建，甚至对于大的组织样品和甚至对于已经观察到响应于有机溶剂置换组织水发生强烈收缩的组织类型(例如脑组织)亦是如此。
使用离液剂可能是有利的，因为离液剂使蛋白质和膜去稳定化，例如通过使蛋白质解折叠、使疏水性聚集物去稳定化和增加疏水物的溶解度。离液剂造成组织样品膨胀。根据实施方案，具有离液剂的脱脂液造成组织样品膨胀至少5％、特别地至少10％，并且特别地以适应于补偿有机透明化剂所带来收缩的量膨胀。
已经令人惊讶地观察到，由有机溶剂和有机脱水液诱导的组织收缩和由离液剂引起的组织膨胀具有组织类型依赖性。肌肉和肝组织中可观察到明显的膨胀以及收缩作用，但是可观察的膨胀以及收缩作用在脑组织中突出得多。已经观察到，使用具有5-30％和特别地15％-25％之间浓度范围的离液剂的脱脂液诱导膨胀作用，所述膨胀作用将在宽范围的组织类型中(事先)补偿有机脱水液引起的收缩。
在又一有益方面，离液剂可能是有利的，因为离液剂将通过移除脂质，特别地来自组织的膜脂质，增加组织透明度，因而增加最终获得的透明化组织样品的组织透明度。
本发明的实施方案可以借助简单、快速和不太费力的浸渍方案，允许甚至大的组织样品(例如，任何鼠器官)的光学透明化，所述浸渍方案可以确保组织样品的体积和/或形态保留。费力工作(如清除血液的穿心灌注)和使用加速透明化或染色技术的专业化装置可能淘汰。可以迅速地、可再现地和任选地按半自动化或全自动化方式处理来自动物研究中庞大队列或来自临床诊断学背景下患者的众多样品。另外，实现了允许通过光片显微镜(例如3D光片显微镜)以细胞分辨率测量组织的透明度。由于改进地保留了原始形态且光散射明显减少以及信噪比增加，借助本发明实施方案的样品制备方法，生成的样品可以在短时间内测量并且以更好的准确度三维可视化。例如，根据一些实施方案，肿瘤中或肿瘤微环境中或肿瘤学(和其他疾病)小鼠模型的其他器官或组织中或患者组织样品中的免疫细胞群体可以可视化并且三维地共定位及定量。通过同时标记血管结构(例如通过体内施用荧光标记的凝集素)和形态的可视化，可以深层分析临床前研究中治疗药对已标记细胞群体的影响。例如，该方法可以用于加工人(例如，临床诊断学背景下的患者)的组织样品。可能不需要着染血管来可视化肿瘤微环境中的某些细胞类型或研究药物例如对免疫细胞参与或活性的影响。但是，为了研究药物在样品中的生物学分布(例如通过使用荧光标记的治疗性化合物)或如果药物直接影响血管(如抗血管生成药物)，对血管标记可能有益。
根据实施方案，该方法还包括c)用波长范围如下的光照射样品，所述波长范围包含染色性分子的荧光标志物中至少一者被激发和/或染色性分子的荧光标志物中至少一者发射出光的波长(激发波长和/或发射波长)；在所述波长范围内进行照射，旨在选择性消除或减少样品的自身荧光。
根据优选的实施方案，如此进行选择性光漂白，从而样品被至少包含一种或多种待用染料的发射波长的波长波段(wave length band)漂白。如若染料的发射谱复杂并且染料发射多个不同波长，则对具有最强烈信号的波长之一进行选择性光漂白。优选地，选择窄波长范围，例如，产生最强烈信号的染料的波长+/-50nm。例如，Alexa Fluor 647和AlexaFluor 750是常用的染料并且可以使用涵盖这些染料的至少最明显(就信号幅值而言)激发波长或发射波长的波长范围，进行选择性光漂白。
例如，如果至少一种稍后待分析其信号的染料在668nm具有发射峰，则可以为选择性光漂白如此选择滤光镜，从而在漂白过程中，将波长范围668nm-50nm至668nm+50nm(即，618nm-718nm)内的强光应用于样品上。
根据其他实施方案，如此进行选择性光漂白，从而样品被至少包含一种或多种待用染料的激发波长的波长波段漂白。优选地，波长范围覆盖自发荧光结构的激发谱，但不覆盖已含于样品中的任何染料(如果有的话)的激发谱。
根据实施方案，在近UV和/或蓝范围，例如在100-482nm范围内进行预照射。这可能是有利的，因为大部分自发荧光结构可以在这个范围内激发，并且将很可能不与大部分所用染料的激发/发射波段重叠。
在尚未对样品染色的情况下，可以在广泛类型的波长范围内应用宽波段照射。在已经包括特定染色的情况下，则优选地应用宽波段照射度减去样品中染料的激发频道(例如通过应用一个或多个滤光镜以生成在包含能隙(gap)的特定范围内的光，所述能隙是这样的波长范围，其是漂白波长范围的子范围并且包含染料的激发范围)。优选地，组织不应当无条件地暴露于高强度照射，因为它可能损伤组织。
根据实施方案，通过用广谱波长范围(下文中称作“自身荧光窗口”)照射样品，进行选择性光漂白。这种“自身荧光窗口”包含覆盖通过体内染色方法已经引入样品中的染料的激发波长的光谱子范围能隙。将光选择性地应用在自身荧光窗口内部、但不在这个“能隙”内部的样品上，以确保不漂白已经包含于样品中的染料。例如，“自身荧光窗口”是在450至730nm之间的波长范围，包含550和580nm之间的子范围能隙。
这些特征(也称作“选择性光漂白”)可能是有益的，因为可以观察到信噪比，这在如光片显微术和其他样品光学分析方法中常规获得的弱光信号背景下特别有益。例如，许多荧光显微镜配备荧光滤光片，所述荧光滤光片用于以选择性波长选择性刺激特定荧光染料或选择性允许与受检染料的发射谱相对应的某个波长抵达物镜。选择性应用波长限定的光可以减少例如由可能包含于样品中的其他荧光染料造成的噪音，所述其他荧光染料具有不同但与当前受检荧光染料部分重叠的发射谱和/或激发谱。已经观察到，这些滤光片也可以用于选择性允许高能广谱光源的有限波长谱的光抵达样品。优选地，如此选择滤光片，从而选择性允许对应于并且包含待检荧光染料的发射和/或激发波长的有限波长谱的光抵达样品。“选择性光漂白”具有以下作用：样品的自身荧光特别在预期有荧光信号并且因此获得改进的信/噪比的波长波段内减少。选择性光漂白可能在使用多种具有不同发射谱的荧光染料背景下特别有利，因为漂白作用可以限于比较小的波长范围，所述比较小的波长范围将一般不重叠于或包含当进行选择性光漂白时已经存在的其他荧光染料的发射波长。因此，本发明的实施方案可以允许在一般受阻于劣信/噪比的光学分析系统背景下，还准确地检测许多不同荧光染料的微弱荧光信号。
自身荧光，其主要是基于福尔马林的组织固定和固有(内源)荧光团(即，适当激发时发出荧光的生物分子)的影响和可能因将样品浸渍在脱脂和染色液中强烈增加，允许在500至600nm之间波长范围内进行组织自身荧光的3D测量。至少在一些情况下已经观察到，仅在缓冲液(例如，PBS)(包括经典染色缓冲液如TBST或PBST)中储存样品时，自身荧光已经在宽范围内(至少在高达630nm的波长内)线性增加。
自身荧光信号提供器官和组织形态的详细方面。所得的图像对比度差异可以允许精确区分各组织组分。另外，可以通过(例如用染料，如凝集素-AlexaFluor647)体内标记血管内皮细胞，可视化完整器官及其血管系统。联合获得组织自身荧光和血管构造通常可以应用于具有高度和中等透光性和低血红蛋白比例的器官，因为在这些组织中，光吸收仅具有有限影响。优选地通过测量近红外(NIR)染料，从具有高血红蛋白含量和低组织透光性的器官(例如肝脏、肾脏、心脏和脾脏)整体获得形态学特征，因为在这个波长范围(光学窗口)内，组织吸收是高度减少的。
根据实施方案，该方法还包括e)在进行洗涤和脱水之前，用第二固定液固定染色的组织样品。例如，第二固定液可以是PBS中的1％PFA。用第二固定液固定可以包括在室温于第二固定液中温和振摇样品约3-4小时。
这个额外的固定步骤可能是有利的，因为它保护染料免于洗出并且因此允许苛刻的脱水方案和改进的信噪比。在例如光片显微术中经常如此的微弱信号和低劣信/噪比背景下，这特别地有益。稍后描述的脱水步骤期间按递增溶剂浓度的反复浸渍步骤可能带来洗出现有染液的风险。特别地，用于着染靶的抗体通过非共价相互作用与其靶结合，当环境从水质改变成有机物时，很可能严重干扰所述非共价相互作用。该额外的固定步骤可以帮助保护这些染料在脱水过程期间免于洗出，特别地若使用乙醇替代丁醇(其视为比乙醇更温和的溶剂)时。
根据实施方案，如此选择脱脂液的组成，从而有机脱水液诱导的组织收缩事先被脱脂液诱导的膨胀补偿。
根据实施方案，离液剂是适应于引起样品的体积膨胀至少15％的原始样品体积或至少20％的原始样品体积。
此外或备选地，如此选择脱脂液的组成，从而脱脂液诱导的膨胀和脱水液引起的收缩的联合效果提供了与原始、未处理组织样品的体积偏离小于15％、优选地小于10％、优选地小于5％的透明化组织样品。
根据实施方案，脱脂液是基于水的透明化液。
基于水的透明化方案是当前应用的方案/认为是基于有机溶剂的透明化方法的备选。因此，虽然基于水的透明化方案和基于有机溶剂的透明化方案的组合似乎没有任何技术性，但已经在本发明的实施方案中令人惊讶地观察到，使用有机透明化液和包含离液剂的基于水的透明化液是高度有利的，因为离液剂引起的膨胀有效地确保浸渍于有机透明化液中的最终获得的样品的体积和形态与原始组织的体积和形态相同或高度相似。在又一有益方面，已经观察到可以通过以下方式获得特别高程度的光学透明度：在具有离液剂的基于水的透明化液中浸渍样品并稍后在有机脱水液中洗涤预透明化和膨胀的样品并使其脱水，以制备样品供浸渍于具有所需RI的有机透明化液中。根据脱脂液中浸渍样品的又一有益方面是，后续离体染色步骤中组织对多种染料的扩散阻力降低。这减少采用染色液的孵育时间、允许较大样品透明化和/或允许多重同时染色。
根据实施方案，组织在第一固定组合物中固定、固定的组织样品在脱脂液中浸渍、染色、洗涤和脱水及固定的组织样品在有机透明化液中的浸渍在不包括(即不含)灌注步骤的自动化或半自动化方法中进行。
由于脱脂剂和有机透明化剂组合，甚至对较大组织样品，达到可在常规方案中，仅在用于已灌注组织样品的方案中或包括特定设备如电泳槽的方案中实现的光学透明度。可以通过使用包含氨基醇的脱脂液进一步显著地增强透明化效果。提供不包括灌注步骤或额外设备的组织透明化方案可能因许多原因而有利：经常，例如，如果从患者获得样品，则不可能在取得样品之前灌注组织。有时使用离体灌注方案，但这些方案经常依赖于复杂和费时的手工步骤，例如固定组织样品、使样品的血管与灌注泵入口和出口连接等。因此，基于灌注的方案经常视为不适合制备用于光学分析的患者样品或至少不适合用于高通量样品制备和分析背景。通过使用作为基于水的透明化液发挥作用的、包含足够量去垢剂的脱脂液并将这种溶液与如本文对本发明实施方案所述的有机透明化方案组合，有可能提供适应于制备甚至非常大的组织样品(例如小鼠完整机体制备)的半自动化或全自动化、免灌注透明化方案，从而这些样品可以接受充分的光学分析并用于其中所含的亚结构的3D重建。
在3D可视化的用来检测组织异常和病态变化的透明化组织样品的背景下，保持组织形态可能特别有利。在一个实验背景中，成功地可视化原位长成的鼠非小细胞肺癌和肾腺癌的组织形态和肿瘤负荷。这种可视化允许毫无疑义地区分病态肿瘤组织与周围的小鼠健康组织，原因在于细胞密度和/或血管系统结构的显著差异。高分辨率图像明确地显示从生理血管构造至高度不规则且混乱肿瘤血管构造的鲜明过渡。仅次于形态学参数，可以解析药代动力学特征，如荧光标记的化合物/治疗药向组织和器官中的分布、渗透和蓄积，以保证代表性和客观分析。有可能与肾腺癌相比，在鼠健康肾组织中成功重建曲妥珠单抗-AlexaFluor750的3D分布。经标记的抗体在正常的肾血管系统内部循环，而仅在肿瘤区域中观察到与免疫效应细胞结合-可能借助抗体的Fc部分-和坏死组织区域中蓄积。原则上，对荧光标记的分子和/或细胞的这种3D分析可以迁移至任何其他器官和组织类型。
根据实施方案，有机透明化液是二苄醚。
根据备选实施方案，有机透明化液是苯甲醇和苯甲酸苄酯(BABB)的混合物。
该方法包括制备有机透明化液。制备有机透明化液包括如此选择苯甲醇和苯甲酸苄酯的比率，从而有机透明化液的折射率与样品的组织类型的折射率相同或相似。
根据进一步实施方案，有机透明化液是DPE(二苯醚)、苯甲醇和苯甲酸苄酯(BABB)的混合物。
该方法包括制备有机透明化液。制备有机透明化液包括如此选择有机透明化液中DPE的浓度，从而有机透明化液的折射率与样品的组织类型的折射率相同或相似。
根据分析的组织类型调整苯甲醇和苯甲酸苄酯的比率可能是有利的，因为已经观察到在不同组织类型中RI略微差异。根据实施方案，如此选择苯甲醇和苯甲酸苄酯的比率，从而所得的有机透明化液具有约1.54–1.58的RI。观察到这是适于一般也具有相同范围内RI的许多组织类型的RI范围。
根据实施方案，该方法包括通过经验地或借助文献研究确定这种组织类型的RI，生成适应于光学透明化特定类型组织的组织样品的有机透明化液。该有机透明化液也可以称作“RI匹配性溶液”或“浸渍溶液”。随后，如此选择有机透明化液的组成，从而达到所需的RI。
例如，可以通过以下方式生成具有限定RI的有机透明化液：生成一系列约10种具有不同BA:BB比率的BABB溶液；在所述10种BABB溶液的每一者中浸渍所述具体组织的样品(所述样品已经在多个洗涤和脱水步骤中完全脱水)并且确定在10种BABB溶液中组织样品的RI显示最大相似性(和最小光散射量)的一种BABB溶液。备选地，10种具有恒定BA:BB比率、但二苯醚浓度渐增的BABB溶液可以用于鉴定这样的有机透明化液，其二苯醚浓度产生与透明化组织的RI匹配的RI。
根据实施方案，样品是非人类或人类生物的组织样品。特别地，样品是人类和非人类哺乳动物的组织样品。例如，样品可以是患者的活检样品，例如来自肿瘤组织或健康组织的样品。例如，样品可以是人肝、脑、肾、肌肉、结肠或肺组织的活检样品或切片。
根据实施方案，样品具有至少0.5cm3、或至少0.75cm3、或至少1cm3的体积。在一些实施方案中，样品是完整器官样品，例如小鼠或大鼠的脑或肝脏。在一些实施方案中，组织样品是例如哺乳动物的完整机体，例如完整小鼠或完整胚胎。
根据实施方案，在用第一固定液固定样品之前，样品已经包含报道蛋白或染色的生物标志物、药物或代谢物。例如，报道蛋白可以是已经借助基因工程向取得所述样品的生物体中引入的蛋白质如GFP。例如，转基因小鼠或大鼠可以在一些组织类型或组织亚区域中选择性表达GFP，其中GFP的组织类型敏感型或组织亚区域敏感型启动子被激活。此外或备选地，组织可以包含用报道分子标记的药物或其他物质。例如，可能在取得组织样品之前某些分钟，已经向患者注射荧光标记的药物进入血流，并且样品可以在样品内部的特定细胞类型中包含蓄积量的标记药物。因此，出于从基因工程至摄入荧光标记药物的多种原因，组织样品可能已经包含一些染色的分子，本文中也称作“体内染色的分子”，并且在生物体中引入这类分子的相应技术可以称作“体内染色方法”。体内染色方法可以与离体(ex-vivo)染色方法组合。在这种情况下，应当如此选择染料，从而它们的发射谱可以容易地彼此区分。
根据实施方案，该方法还包括使用3D荧光显微术，例如光片荧光显微术(LSFM)，生成透明化组织样品的着色亚结构的3D图。
所述特征可能是有利的，因为已经观察到，对少数各组织切片的2D检查仅有限了解非均匀组织结构并且因此可能并不必然地反映总体情况。特别地在肿瘤分析中，这个方面具有巨大相关性，因为这类组织类型中非均匀性特别高。另外，复杂形态学关系，如血管构造，仅可以按三个尺度才充分理解。因此，仅三维(3D)分析完整组织标本才为总体和代表性组织评估提供适宜的解决方案。但是，基于各组织切片对福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)组织样品的数字式3D重建是非常繁琐和费时的过程。另外，切片过程引起的组织切片的机械扭曲使得后续3D重建很难进行并增加易出错性。本发明的实施方案可以通过提供适应于产生保留形态的高度透明化组织样品的改进样品透明化方案，允许克服基于切片机的常规组织病理学的问题和限制，因而提供了使用非破坏性成像方法，如光片显微术(light-sheet microscopy)，提供以细胞分辨率3D分析透明化组织标本的基础。
存在巨大数目的不同组织透明化方案，它们主要地应用于3D分析(例如啮齿类脊髓和脑中)内源标记的神经网络。尽管在神经科学和胚胎发育方面取得巨大成功，成像技术仍为其他科学领域提供可观潜力。首先，研究已经展示其对癌症研究和临床前药物开发的巨大价值。本发明的实施方案可以允许在组织病理学领域整合3D成像技术。
本文对本发明多种实施方案所述的透明化方法成功应用于以细胞分辨率三维、非破坏性的和多重分析完整小鼠器官、原位肿瘤异种移植物和同基因肿瘤和人肿瘤组织样品。显示本发明的实施方案可以提供就组织完整性和透明性二者而言，比通过现有基于有机透明化的方案获得的样品更有利的透明化组织样品。
此外或备选地，该方法还包括使用拉曼光谱法分析透明化组织样品。拉曼光谱法是用来观察系统(例如生物组织样品)中振动、旋转和其他低频模式的光谱技术。拉曼光谱法常在化学中用于提供可以籍此鉴定分子的结构指纹，但是也可以在生物学中和特别地组织学及高通量诊断学中用于获得关于具体组织样品的形态及其亚结构的信息。拉曼光谱法依赖于单色光的非弹性散射或拉曼散射。使用光学上高度透明的组织样品可以确保代表噪声的散射光减少。作为又一优点，激光可以更深地穿入组织，因而允许光学分析更大的或吸收更高的样品。
此外或备选地，该方法还包括使用光声成像(光声成像(optoacoustic imaging))分析透明化组织样品。光声成像是基于光声作用的生物医学成像模式。在光声成像中，非电离性激光脉冲输送至生物组织(当使用射频脉冲时，该技术称作热声成像)。一些已输送的能量将被吸收并转化成热，导致瞬态热弹性扩张(expansion)并且因此导致宽带(即MHz)超声发射。生成的超声波由超声波换能器检出并且随后分析以生成图像。已知光吸收密切相关于生理学特性，如血红蛋白浓度和氧饱和度。作为结果，与局部能量沉积成比例的超声波发射幅度(即光声信号)揭示生理学特异的光吸收反差。随后可以形成靶组织样品的2D或3D图像。使用光学上高度透明的组织样品可以确保将增加背景噪声的激光散射减少。
在又一个方面，本发明涉及制备光学分析用生物组织样品的自动化或半自动化系统。特别地，如此制备样品，从而所制备样品的体积和/或形态距原始组织的体积或形态的偏离减少或最小化。该系统设置为：
-接收固定的组织样品，固定的组织样品已经用第一固定液固定；
-在脱脂液中浸渍固定的组织样品，脱脂液包含适应于诱导样品膨胀的离液剂；
-用一种或多种染色液着染组织样品；
-在有机脱水液中使染色的组织样品脱水，脱水液适应于诱导样品收缩；和
-在有机透明化液中浸渍固定的组织样品。
根据实施方案，进一步设置该系统以进行以下步骤(其对应于样品制备方法的其他步骤)：
-洗去脱脂液；
-在已经洗去脱脂液后，在封闭液中浸渍样品，以最小化后续步骤中染色性分子的非特异性结合；
-洗去染色液。
根据实施方案，该系统包含多种溶液中每一者的试剂容器的系统，所述多种溶液包含脱脂液、一种或多种染色液、第二固定液、有机脱水液和有机透明化液。根据实施方案，该系统可以包含额外的容器和/或单元，例如用于一种或多种洗涤缓冲液、额外的染色液、封闭液等。试剂容器和/或单元的数目可以取决于所用样品制备方案的特殊性，包括一种或多种用于着染样品的染色方案的特殊性。
根据一些第一实施方案，该系统包含样品输送装置和多个分别与试剂容器之一耦合的样品容器。该系统设置成如此半自动或全自动地协调样品输送，从而样品浸渍于根据上述样品制备系统之实施方案的多种溶液的每一者中至少一次。
根据备选性第二实施方案，该系统包含一个或多个分别与试剂容器之一耦合的和与样品容器耦合的泵。该系统设置成协调这些泵，从而样品浸渍于根据上述样品制备系统之实施方案的多种溶液的每一者中至少一次。
根据一些实施方案，系统还包含第一固定液的试剂容器。根据一些实施方案，控制单元设置成如此半自动或全自动地协调样品输送，从而样品还浸渍于第一固定液中持续足够时间，以确保固定组织样品。根据一个备选的实施方案，系统包含泵和控制单元，所述泵与具有第一固定液的试剂容器耦合，所述控制单元设置成如此协调泵，从而样品还浸渍于第一固定液中持续足够时间，以确保固定组织样品。
可以使用样品输送系统，手工、半自动地或全自动地进行组织样品从一个具有相应样品容器的单元转移至下一个单元。同样地，可以自动、半自动或手工地进行根据第二实施方案的系统的单个样品容器中溶液的交换。
该系统可以包含一个或多个用于在脱脂液、染色液、洗涤液、封闭液、脱水液和有机透明化液中及第二固定液(如果有的话)中浸渍一个或多个样品的容器。该系统可以进一步包含用于所述溶液中每一者的瓶，所述瓶借助管道、泵和阀可操作地连接至一个或多个容器。该系统可以进一步包含自动化输送装置，例如将生物样品从一个样品容器输送至下一个样品容器的输送带或机械臂。该系统还包含控制单元，其适应于协调样品输送装置、泵和阀相互作用，从而执行本发明实施方案的样品处理方法。
在又一个方面，本发明涉及用于制备一个或多个组织样品的试剂盒。该试剂盒包含脱脂液和有机透明化液。脱脂液包含以体积计5％-30％、优选地5％-15％的至少一种离液剂和以体积计5-30％的至少一种去垢剂。
根据本发明的实施方案，试剂盒适应于制备光学分析用生物组织样品。特别地，试剂盒适应于如此制备组织样品，从而所制备样品的体积和/或形态距原始组织的体积或形态的偏离减少或最小化。
使用上文规定量的离液剂可能是有利的，因为它可以引起组织样品显著膨胀和组织的过度水化。膨胀促进和加速染色液和脱水液渗透，因而允许比现有技术的有机透明化方案更快地执行后续步骤。
向脱脂液添加去垢剂可能是有益的，因为移除了脂质，特别地膜脂质，因而减少光散射并增加组织样品的渗透性。
根据实施方案，至少一种去垢剂是至少两种不同去垢剂的组合。特别地，至少两种不同去垢剂的组合可以包含三乙醇胺(TEA)和吐温80的组合或由其组成。
观察到就组织透明度并就形态稳定性(真实性)而言，通过本发明实施方案的样品制备方案和相应试剂盒获得的组织透光性优于现有技术。本发明实施方案的样品处理方法和试剂盒产生了折射率(RI)优异和特别地短时间(例如，对于许多小尺寸样品和中等尺寸样品，在两天内)均匀浸渍组织的样品。需要的总时间可以取决于组织类型和样本尺寸。例如，小鼠完整肾脏可以在浸渍于脱脂液中三天后和浸渍于脱水和有机透明化液中1.5天后完全透明化。相反地，本领域已知的有机透明化方案，例如一些基于BABB的透明化方案，提供光散射和光吸收更大的样品。本领域已知的基于水的透明化方案，例如基于CUBIC-2和RIMS的透明化方案，引起扰动纹影线和光学异常。
根据实施方案，离液剂是脲或硫脲。
已知多种其他离液剂，例如正丁醇、乙醇、高氯酸锂、乙酸锂、氯化镁、苯酚、2-丙醇或十二烷基硫酸钠。但是，观察到使用非离子型离液剂，特别地脲或硫脲提供就组织通透性、移除膜液体和/或渗透恒定性而言比任何其他离液剂显著更好的结果。例如，一些离液剂如氯化镁具有不想要的渗透特性。
根据实施方案，去垢剂是吐温80。根据备选实施方案，去垢剂是tritonX-100、吐温20或相似去垢剂或其混合物。
根据实施方案，脱脂液还包含5-30％、优选地10-25％、优选地15-25％、更优选地20-25％(以体积计)的氨基醇。
例如，氨基醇可以是作为“Quadrol”市售的N,N,N',N'-四(2-羟丙基)乙二胺。
使用氨基醇作为又一组分可以具有以下优点：从组织样品移除作为强吸收剂起作用的分子如血液的各种组分，例如，血红蛋白。这将减少组织样品的吸收作用并且因此增加组织的光学透明度。
根据优选的实施方案，包含于脱脂液中的氨基醇的量与待光学分析的组织样品中包含的血红蛋白的量正相关。例如，肝样品一般包含大量血红蛋白并且在这种情况下，脱脂液优选地包含以体积计约20-25％的氨基醇。脑样品仅包含少量血红蛋白并且可以用不含氨基醇或仅包含以体积计小于15％的少量氨基醇的脱脂液处理。减少氨基醇的量可以具有优点：脱脂液的成本降低并且脱脂液的粘度也降低。具有大比例氨基醇的高度粘稠的脱脂液可能需要额外的时间和精力，例如，额外的洗涤步骤，旨在从样品移除脱脂液以允许用其他液体(例如，染色液)快速渗透样品。本领域普通技术人员能够针对样品中包含的血红蛋白的量，调整脱脂液中包含的氨基醇的量。
在实验性测试中，根据本发明实施方案获得的大部分鼠组织样品显示中等至高的组织透光性，甚至在脱脂液不包含氨基醇的情况下也是如此。但是，在具有天然大比例血红蛋白的器官如肝脏、肾脏、心脏和脾脏中，脱脂液提供的透明化效果显著地增加并且血红素相关的问题通过添加氨基醇至脱脂液来克服，这克服或至少减少血红素相关的问题。
根据实施方案，脱脂液还包含硫代二乙醇。观察到，向脱脂液添加硫代二乙醇可以进一步增加组织的透明度。
根据实施方案，脱脂液是适应于使pH值稳定的缓冲溶液。例如，脱脂液可以是10xPBS(磷酸盐缓冲盐水)。
根据实施方案，脱脂液还包含DMSO(二甲基亚砜)。向脱脂液添加DMSO可以具有优点：粘度减少并且因此使脱脂液完全渗透样品所需要的孵育时间也减少。在大规模、自动化样品处理管线背景下，这可能特别有利。
根据实施方案，脱脂液还包含抗微生物剂，例如，适合作为体外诊断(IVD)测定法的防腐剂的广谱抗微生物剂。优选地，抗微生物剂不抑制大部分酶、抗体结合作用，也不干扰ISE电极。这种抗生素的一个实例是SigmaAldrich的ProClin 300。
根据实施方案，脱脂液还包含用于调节脱脂液的渗透特性的盐，例如NaCl。
根据一个实施方案，脱脂液包含以体积计20％的脲、以体积计20％的吐温80、以体积计20％的Quadrol、以体积计20％的硫代二乙醇。在PBS中溶解全部组分后，将溶液用PBS补足直至终体积。在一个优选的示例性实施方案中，脱脂液还包含ProClin 300或另一种如供应商推荐的抗微生物剂。所述组合物已经显示为组织样品提供特别高的透明程度。
根据另一个实施方案，脱脂液包含以体积计15％的脲、以体积计15％的吐温80、以体积计15％的Quadrol、以体积计15％的硫代二乙醇。在PBS中溶解全部组分后，将溶液用PBS补足直至终体积。
根据另一个实施方案，脱脂液包含以体积计的10％脲、以体积计20％的Quadrol、以体积计5％的吐温80、5％的三乙醇胺(TEA)和5％的二甲基亚砜(DMSO)。任选地，可以向脱脂液添加荧光染料，所述荧光染料可以用于高亮一些组织结构或细胞组分。例如，脱脂液可以包含适应于选择性着染细胞核的荧光染料，例如碘化丙啶。根据一个例子，脱脂液包含约3μg碘化丙啶/ml脱脂液。
可以通过以下方式产生脱脂液：在PBS溶液中溶解全部组分并且随后用纯的PBS缓冲液补足这种PBS溶液直至终体积。
在一个示例性实施方案中，脱脂液还包含ProClin 300(例如以体积计0.5％)或另一种如供应商推荐的抗微生物剂。已经显示所述组合物提供这样的组织样品，其特别适应于保持已经按体内“染色”方案引入组织中的荧光信号的强度。
根据实施方案，试剂盒还包含第一固定液。第一固定液包含选自甲醛(福尔马林)、多聚甲醛(PFA)、戊二醛和乙二醛的固定剂。
根据实施方案，试剂盒还包含第二固定液，所述第二固定液包含PBS中的1％PFA。
根据实施方案，试剂盒还包含一种或多种脱水液，例如70％乙醇、95％乙醇和100％乙醇。
根据实施方案，试剂盒还包含一种或多种洗涤液和/或封闭液。
根据实施方案，试剂盒还包含容器，所述容器用于在有机透明化液中浸渍样品并且用于对容器中样品进行光学分析，同时样品浸渍于有机透明化液中。
根据一些实施方案，试剂盒是类属的并且用于制备许多不同类型和物种的光学分析用组织样品。根据其他实施方案，试剂盒专用于特定组织类型和/或特定物种。
根据实施方案，试剂盒包含一种或多种染色液。根据一些实施方案，染料是基于抗体的，即，使用一种或多种使染料与生物标志物选择性接合的抗体。根据其他实施方案，一种或多种染色液中的染料并不是基于抗体的荧光染料，而是荧光Fab2-片段或荧光量子点(QD)。QD是非常小的半导体粒子，大小仅数个纳米，如此小，从而它们的光学特性和电子特性异于较大粒子的那些特性。它们是纳米技术的中心主题。若向量子点施加电力或光，许多类型的量子点发出特定频率的光，并且可以通过改变量子点的大小、形状和材料，精确地调谐这些频率。归因于其小的特点，本发明背景下使用纳米点可能特别有益，因为它们的使用允许染色期间进一步减少孵育时间，因而减少为执行透明化方案所必需的时间量。
根据实施方案，染色液包含生色性染料。
根据其他实施方案，染色液包含荧光染料。
在实验性测试中，用基于生色和基于荧光的IHC方案，在已经根据本发明实施方案的组织制备方法透明化的小鼠肾脏的系列组织切片中着染鼠组织样品的几个组织靶。获得的染色显示在生色性方案和免疫荧光染色方案之间无组织形态和目标特异性的显著差异。另外，比较来自相同小鼠器官或肿瘤异种移植物的透明化组织切片和非透明化组织切片的生色性组织染色，示例性地显示H&E染色法、Trichrome染色法、CD31染色法和150Ki67染色法的特异性无差异。在透明化组织切片中仅观察到信号强度少量降低。
如本文所用的“样品”或“组织样品”是一片从生物取出的组织例如活检样品或生物的完整器官或甚至完整生物。例如，完整器官样品可以是成年小鼠或大鼠的完整肝脏、脑、肺或心脏。完整生物样品可以例如是胚胎。
如本文所用的“原始组织”是处于应用本文对本发明实施方案所述的样品制备方法之前状态的组织。例如，“原始组织”可以是处于它浸渍于第一固定液中之前状态的组织样品，例如，储存在PBS中或其他缓冲液中供进一步处理的组织样品。在其他实施方案中，“原始组织”指处于从生物获得样品之前或之后状态的组织。
“离液剂”是这样的物质，所述物质通过干扰非共价力如氢键、范德瓦尔斯力和疏水作用介导的分子内相互作用，增加体系的熵。离液溶质可以因为使毗邻蛋白质的水分子失序而降低疏水性区域的净疏水作用。这使疏水性区域在溶液中增溶，并且在一些情况下可能使蛋白质变性。离液剂可以屏蔽电荷和防止盐桥的稳定作用。因此，如本文所用的“离液剂”特别地是–在水中溶解时-可以破坏水分子之间成氢键网络的分子(即产生离液活性)。通过削弱疏水作用，这影响溶液中其他分子(主要是大分子(蛋白质、核酸))的天然状态的稳定性。例如，离液剂减少由本体和疏水性氨基酸周围水合层中水分子形成的蛋白质结构的有序量，并且可以引起蛋白变性。
根据一些实施方案，离液剂是适应于引起样品的体积膨胀至少15％的原始样品体积或至少20％的原始样品体积的物质。例如，离液剂是适应于在包含约5％(以体积计)离液剂的溶液中浸渍样品少于三天后，引起样品的体积膨胀至少15％的原始样品体积并且特别地至少20％的原始样品体积的物质。
优选地，离液剂是非离子型离液剂如脲和硫脲。
根据其他实施方案，离液物质是以胍盐(例如氯化胍、盐酸胍或硫氰酸胍)形式提供的离子型离液胍。
胍是一种平板状离子，其可以围绕其边缘形成微弱氢键，但可以对蛋白质羧基建立维持强力的结合氢的离子对，如同常见存在的季型结构的精氨酸-羧酸'盐'键。铺展的正电荷引起氮原子成为劣的氢键受体。另外，胍拥有相当疏水的表面，所述表面可以与相似的蛋白质表面相互作用以使蛋白质变性成为可能。
所述离液剂具有优点：它们通过削弱氢键，允许大分子在结构上更自由并激励蛋白质伸展和变性。在足够的水缺乏时，脲与自身及存在的任何蛋白质成氢键。它因此变得更疏水并因此更能够与蛋白质上的其他位点相互作用，导致脱水导致的局部变性。此外，脲和硫脲适应于从蛋白质表面代替并移除水，因而也使蛋白质变性。脲和胍均增加任何内在失序的蛋白质的回转半径。因此，上文提到的物质特别适用于使蛋白质变性。
在又一有益方面，所述物质并不显著增加脱脂液的粘度。因此，可以实现强烈的蛋白质变性和蛋白质伸展作用，同时保持脱脂液不粘稠。不粘稠的液体使得样品处置和处理容易并且可以允许从样品迅速移除脱脂液。
根据一些实施方案，“离液剂”是在20℃具有至少100g·l-1水溶解度的极性物质。
如本文所用的“脱脂液”是基于水的溶液，其包含适应于减少组织样品中脂质数量的至少一种离液剂和去垢剂。
如本文所用的“基于水的透明化液”是包含至少一种去垢剂的基于水的溶液，所述去垢剂适应于减少已经浸渍于基于水的透明化液中的组织样品的光散射。存在在基于水的组织透明化方案中使用的多种基于水的透明化液，例如“CUBIC-1”，其中所述基于水的组织透明化方案用作基于有机溶剂的透明化方法的备选。基于水的透明化液可以是亲水性透明化液，即，仅包含或优势地包含亲水物质的基于水的溶液。例如，基于水的溶液可以是水或1X PBS(磷酸盐缓冲盐水)，或10X PBS或PBST(含吐温的PBS)或包含至少一种去垢剂的相似缓冲液。相反地，本发明实施方案的“有机溶液”是有机溶剂或基本由有机溶剂组成的溶液。因此，“有机透明化液”是有机溶剂或主要由适应于并且用作组织透明化溶液的有机溶剂组成的溶液。适应于用作透明化溶液的溶液适应于通过将组织样品浸渍在透明化液中，使组织样品半透明或甚至透明化。广泛使用的有机透明化液是BABB。
“组织灌注”是倾倒液体穿过特定器官的管或其他腔体的动作。
如本文所用的“试剂盒”是一种溶液组合物，其设计用于并且允许按照极端标准的条件实施实验室工作流程(例如，样品制备工作流程或其部分，例如，样品着染工作流程或样品透明化工作流程)，其快于已经导致鉴定并开发基于试剂盒的实验性工作流程的传统实验室惯例。
如本文所用的表述“如此制备样品，从而所制备样品的体积和/或形态距原始组织的体积或形态的偏离减少”意指，由本文所述组织制备方法的实施方案带来的体积/形态变化小于由现有技术中基于有机溶剂的透明化方法带来的体积/形态变化。
在又一个方面，本文描述了一种如此制备组织样品，从而进行光学分析的样品的信噪比增加的方法。该方法包括：
-鉴定由染料待生成的光信号的波长，所述染料待用于着染组织样品或其所选择的组分；
-用波长范围的光照射样品，其中所述波长范围包含鉴定的波长以选择性消除或减少样品在所述波长范围内的自身荧光。
所述方法也可以在本文中称作“选择性光漂白”。例如，染料可以是荧光染料并且特定波长是该染料的发射波长或该染料的多个发射波长之一。例如，特定波长可以是该染料的多个发射波长中产生最强烈信号的一者。例如，通过以下方式确定波长范围：向染料的波长添加50nm和从其中扣减50nm，产生最强烈信号，添加和扣减的结果提供波长范围的边界。根据实施方案，该方法还包括用染料着染组织样品。例如，染料可以适应于选择性地结合于特定生物标志物例如特定蛋白质、或结合于特定核酸序列。根据实施方案，选择性光漂白可以作为使组织样品透明化的样品制备工作流程中的一个步骤使用。
在又一个方面，本发明涉及一种如此制备光学分析用生物组织样品，从而增加组织样品的光学透明度的方法。该方法包括：a)用第一固定液固定组织样品；b)在脱脂液中浸渍固定的组织样品，脱脂液包含适应于诱导样品膨胀的离液剂；d)用一种或多种染色液着染组织样品；f)在有机脱水液中使染色的组织样品脱水，脱水液适应于诱导样品收缩；和g)在有机透明化液中浸渍固定的组织样品。
在又一个方面，本发明涉及制备光学分析用生物组织样品的自动化或半自动化系统。特别地，如此制备样品，从而增加组织样品的光学透明度。该系统设置为：接收固定的组织样品，固定的组织样品已经用第一固定液固定；用第一固定液固定组织样品；在脱脂液中浸渍固定的组织样品，脱脂液包含适应于诱导样品膨胀的离液剂；用一种或多种染色液着染组织样品；在有机脱水液中使染色的组织样品脱水，脱水液适应于诱导样品收缩；和在有机透明化液中浸渍固定的组织样品。
在又一个方面，本发明涉及制备光学分析用组织样品的试剂盒。特别地，如此制备样品，从而增加组织样品的光学透明度。试剂盒包含脱脂液和有机透明化液。脱脂液包含以体积计5％-30％、优选地5％-15％的至少一种离液剂和以体积计5-30％的至少一种去垢剂。
本文中对方法、系统和试剂盒所述的全部特征和实施方案，所述方法、系统和试剂盒适应于并设置为制备光学分析用生物组织样品，从而所制备样品的体积和/或形态距原始组织的体积或形态的偏离最小化或减少，可以自由地与适应于和设置为制备光学分析用生物组织样品，从而增加组织样品的光学透明度的方法、系统和试剂盒组合。
附图简述
在下文仅以举例方式，参考附图更详细地解释本发明的实施方案，其中：
图1显示一种制备光学分析用生物组织样品的方法；
图2显示用于图1的方法中的多种试剂盒
图3显示两种设置为自动或半自动地制备组织样品的样品制备系统；
图4显示用常规透明化方案透明化的组织样品和用本发明实施方案的方法透明化的组织样品的比较；
图5显示光片显微镜和带样品的浸渍室；
图6显示3D荧光组织病理学工作流程；
图7显示在缺少脱脂液内浸渍的有机透明化方案的不同阶段的多种类型鼠组织样品；
图8显示使用多种脱脂液时获得的组织透明化效果；
图9显示多份未灌注的新鲜组织样品的照片和浸渍于中基于水的透明化液和基于有机溶剂的透明化液后的所述样品的照片，其中基于水的透明化液具有不同浓度的离液剂脲；和
图10显示在多个样品处理步骤和透明化步骤的每一步骤后多份组织样品的照片。
图1显示用于制备光学分析用生物组织样品的透明化方案100的步骤。
本发明的实施方案可以使用可引起膨胀以及样品预透明化的水质脱脂液以及有机脱水液和透明化液的组合，用于实现高程度样品透明性，同时维持样品体积和形态。另外，染色步骤后的额外的固定步骤可以帮助保持体内掺入的荧光染料的信号强度。因此，本发明的实施方案可以允许通过荧光物质，标记组织中的选定靶结构并且在完整样品透明化工作流程自始至终保护这些染料。
在一些实验环境下，可以进行任选的体内染色步骤。例如，可以将荧光分子引入试验动物体内(信号1)。荧光分子可以是借助基因工程引入生物体的荧光报道蛋白。此外或备选地，荧光分子可以是向活生物(例如，实验室动物)注射或应用的荧光标记的药物或代谢物。在其他实验环境下，取得样品时，生物体不包含任何荧光标记的分子。
体内染色可以是多种生物医学环境下有用的技术。根据一个实例(原位肺癌异种移植物)，可以如下产生来自携瘤动物的组织样品：通过在SCID小鼠中尾静脉注射NSCLC细胞(3x10e6个细胞/100μl PBS)产生原位肺癌异种移植物。循环的肿瘤细胞定居在肺中并开始增殖。在肿瘤细胞类型经过特定时间后，例如25天后，肿瘤达到用于进一步检查的最佳尺寸。动物接受静脉内尾静脉注射100μg凝集素-AlexaFluor647并且在五分钟孵育后安乐死。随后，可以将肺外植用于完整肺器官的离体分析。备选地，可以取得肺的各部分。此外，可以获得来自无瘤动物的组织作为对照。例如，可以通过尾静脉对SCID小鼠静脉内注射100μg凝集素-AlexaFluor647。在五分钟孵育后，使动物安乐死并且将不同的器官和组织样品外植以生成用于离体分析的组织样品。
组织样品可以是人类或非人类动物的组织样品。组织样品可以例如是活检样品、薄切片组织、完整器官组织样品或甚至完整生物样品，例如胚胎或小型哺乳动物。样品可以从组织库或另一来源(例如，冷却的样品存储单元)取回。可以将样品浸渍于缓冲液(例如，PBS)中，并在样品存储单元中约4℃或更低温度储存。
接下来在步骤102中，随后通过浸渍样品于第一固定液(例如，如多种标准透明化方案中所用的基于福尔马林的固定液)中，保护这种组织的状态。这个步骤的持续时间可以取决于组织样品的类型和大小。组织样品可以在第一固定液中在4℃于黑暗下孵育约24小时。已经观察到这些条件适用于许多不同的组织类型和直径直至1cm的样品。例如对于更小的组织，可以减少孵育时间。第一固定液可以具有浓度比较低的固定剂(fixans)，例如约10％缓冲的福尔马林。
在后续步骤104中，样品浸渍于基于水的脱脂液中。脱脂液包含适应于诱导组织的过度水化和明显膨胀的离液剂。这使得组织对流体更可透过并且通过有机透明化液扩散入样品，便利和加速组织样品的透明化。此外，脱脂剂包含适应于从组织移除许多引起光散射的生物分子(特别地膜脂质)的去垢剂。移除脂质进一步增加组织对其他物质(例如，染料、固定液、脱水液和有机透明化液)的通透性。脱脂液的其他成分，特别地氨基醇，可以从组织样品移除其他吸收组分，特别地，血液组分如血红素基团，因而进一步改善样品的透明性。因此，步骤104的结果是膨胀的预透明化组织样品，其显示比原始组织样品更大的光学透明度(光散射减少)。
根据一些实施方案，荧光性胞核标志物分子可以包含于脱脂液中。胞核标志物分子适应于选择性着染细胞核。因此，脱脂液可以用于向组织样品引入允许检测细胞核及使其可视化的其他信号(“胞核信号”)。例如在SatoshiNojima等人：“CUBIC病理学：用于病理学诊断的三维成像(CUBIC pathology:three-dimensional imaging for pathologicaldiagnosis)”Scientific Reports,2017年8月24日中描述了荧光性胞核标志物的实例。添加胞核标志物作为脱脂液的组分可以节省额外的染色步骤并且因此可以显著地加速样品制备程序。
将大小直至1cm3的组织样品(例如鼠完整器官样品或人类患者的大活检样品)优选地在25-37℃之间的温度浸渍于脱脂液中1-4天。更高的温度提供更好的透明化，但可能降低样品中体内染料(如果有的话)的信号强度，并且可能导致一些蛋白质和生物标志物发生部分变性并且因此可能破坏一些表位，从而使得难以检测所述表位。
已经观察到，样品浸渍于脱脂液中大大增加某些波长范围的自身荧光。这可能是有益的，因为它改善组织样品相对于背景的总体反差，并且允许轻易检测到组织样品的边界。但是，增加的自身荧光可能覆盖将在步骤108中引入和/或已经作为体内染料引入的荧光染料的发射波长范围，这是不想要的效果。在这种情况下，可以任选地进行额外的步骤106。
步骤106，也称作“选择性光漂白”，包括在一种或多种在步骤108中待引入和/或已经通过体内染色方法引入的荧光染料的发射波长范围内，选择性地强烈照射组织样品。选择性光漂白可以选择性地减少在待检查荧光染料的发射波长范围内的自发荧光。因此，本发明的实施方案可以允许利用增加的自身荧光(更好地辨识组织样品边界)并且同时通过选择性减少与待检查荧光染料的发射波长范围对应的那些波长范围内的自身荧光，确保高信噪比。
例如，可以使用具有1瓦特或更大功率、优选地约2瓦特功率的光源，例如激光。使用允许约545nm的光穿过样品的滤光片，对样品施加光源的光约10秒。通过光片显微镜，用上文提到的滤过的光源在每层照射每个样品约10秒，而光片(light sheet)按一个方向扫描样品。
由于脱脂液引起组织通透性升高，步骤108中的染色程序可以根据简单和快速的样品浸渍方案进行。一个或多个已经根据步骤102-104固定并浸渍于脱脂液中并且已经任选地经历选择性光漂白的样品浸渍于一种或多种染色液中。例如，染色液可以是分别包含直接(荧光)标记的第一抗体的一种或多种溶液。这可能是有利的，因为需要数目少的染色步骤和染色液更换，因而增加样品制备工作流程的性能。可以仅通过浸渍样品于一种或多种染色液中，快速着染大数量的组织样品。步骤108有可能包括将样品浸渍于多种包含不同荧光标志物的不同染色液中，所述荧光标记适应于选择性地结合于细胞表达的不同生物标志物，例如不同的蛋白质。由于脱脂液引起组织通透性升高，染色程序可以作为适于过程自动化的简单浸渍方案进行，因为它不需要复杂的样品灌注操作。在又一有益方面，样品在染色液中的孵育时间显著地短于现有技术的有机组织透明化方案，原因在于膨胀和脱脂的组织样品的通透性升高。一般地，基于现有技术中的方法，大的样品的制备和染色需要1-2周，而可以根据本发明的实施方案在4-5天内制备并染色相似尺寸的样品。
接下来在步骤110中，可以任选地进行组织样品的进一步固定。进行这个步骤以使组织样品中由步骤108中的一种或多种染色液引入的标志物分子固定。已经观察到，虽然这个额外的固定步骤需要额外的时间并且因此可以略微地减缓工作流程，但额外的固定步骤可能保护许多标记的标志物分子在脱水步骤112期间免于被洗出。另外，额外的固定步骤110可以允许在后续步骤112中应用特别苛刻的脱水方案，同时不明显降低荧光染料的信号强度。
在骤112中，通过在一系列脱水液(本文中还称作“洗涤液”)中多次浸渍组织样品，进行组织的逐步脱水。脱水液系列可以由具有渐增浓度的有机溶剂(例如乙醇)的一系列水-溶剂混合物组成，其用于替代组织中的水，以将组织样品液态部分的RI逐渐调整为有机透明化液的RI。脱水导致组织样品逐步收缩，因而补偿脱脂液引起的组织膨胀。当完成洗涤步骤并且组织样品包含最大可能浓度的有机脱水液时，样品收缩将停止，因而提供其体积和/或形态将与该样品所来源的活生物体中相应组织的体积和/或形态相同或非常相似的组织样品。
例如，可以通过在分级乙醇系列中(70％乙醇溶液中3次、在95％乙醇溶液中2次和100％乙醇中两次，每次30分钟)孵育样品，使组织样品脱水。
例如，脱水液210，也称作“脱水液”，可以包含一系列分别由水和有机溶剂(例如，乙醇)的混合物组成的溶液。甲醇也可以用作脱水液的有机组分。对于脱水液中使用的这些有机化合物中的每一者，发现脱水程序引起的荧光信号强度下降是可接受的。
也可以使用备选的脱水液如叔丁醇、BuOH(丁醇)、THF(四氢呋喃)。但是，它们应当优选地能够引起组织的收缩作用，从而如果与脱脂液组合，则样品的形态对应于原始组织的形态，其中所述引起组织的收缩作用通常是不希望有的。
接下来在步骤114中，将组织样品浸渍于有机透明化液(例如，BABB)中。优选地，如此选择有机透明化液的组分(例如，BA和BB)的浓度，从而有机透明化液的RI与对于当前被处理组织样品的来源组织类型的透明化组织样品常见的RI相同或相似。通过如本文所述的样品处理工作流程产生的组织样品可以具有比采用现有技术方案处理的样品更大程度的透光性和透明度。另外，所述样品将具有忠实再现活生物中原始组织体积和形态的体积和形态。另外，样品处理可能需要比当前的有机样品处理工作流程更少的时间和手工相互作用。
例如，可以将脱水的组织样品置于一份苯甲醇和二份苯甲酸苄酯(BABB，Sigma-Aldrich)组成的有机溶剂溶液中并且在4℃于黑暗下孵育至少两天。但是，持续时间可以强烈地取决于组织样品的形状和大小。非常大的致密组织样品可能需要超过24小时，较小样品可能仅需要12小时或更短时间。
接下来在步骤116中，借助样品光学分析方法(例如，3D光片荧光显微镜)分析透明化组织样品。将借助这种显微镜或其他类型样品光学分析装置所获得的图像在图像处理工作流程中处理并且用于生成和展示组织样品的亚结构的3D模型。特别地，3D可视化可以用于3D可视化一种或多种被标志物特异性染料、和/或胞核特异性染料和/或体内染料选择性标记并着染的靶结构或靶细胞群体。
例如，可以将光学透明化组织样品置于样品架中、转移入成像室并且用市售光片显微镜(例如，来自LaVision BioTec)扫描三维度。与现有的光片几何学相比，为了焦面内均匀照射几毫米直至厘米大小的光学透明化大标本，BTLSFM使用六个聚焦的激光光片的双侧照射(每侧三个)。这种几何学减少来自离焦区域的光散射和光漂白至最小并且能够实现非常快速和无拼接的数据获得。垂直于准直激光束发射的荧光由提供与大视场组合的高灵敏度和分辨率(像素：2560x 2160)的sCMOS照相机检测。通过使透明化组织样品步进竖直穿过准直光片，进行光学切片并且获得的虚拟组织切片z-堆栈(z-stack)用于直到细胞分辨率的二维和三维组织分析。照射几何学与大视场照相机共同能够实现按xy-方向往下至深度(z-方向)六毫米快速和无拼接测量光学透明的大组织样品。
可以进行总放大率为10x(xy-分辨率：0.6μm)的概况扫描以及高分辨率扫描，以在单个细胞分辨率接收详细的组织信息。可以针对光学透明化组织样品，对组织自身荧光(Ex：543/22nm；Em：593/40nm)和来自染色步骤中施加的多种荧光染料的荧光信号成像。此后，将生成的图像数据转化成Medicine(DICOM)文件中的数字成像和通讯，并且使用现有的软件解决方案(例如，OsiriX软件(Pixmeo，Bernex，瑞士；开源软件))可视化。此外或备选地，ImageJ(开源软件)和GNU图像操作程序(GIMP，开源软件)可以用于3D成像。
图2显示用于图1的方法中的多种试剂盒。例如，“简约试剂盒214”可以仅由脱脂液204和有机透明化液212组成。其他试剂盒216、218、220、222可以包含一种或多种额外的溶液，例如，第一固定液202、第二固定液208、一种或多种脱水液210和/或一种或多种染色液206。
例如，脱脂液204可以是包含(以体积计)约10％离液剂脲、20-25％Quadrol、5％吐温80、5％TEA和5％DMSO的10X PBS缓冲液。溶液204可以另外包含染料(例如，碘化丙啶)和/或抗微生物剂。
染色液206可以包含一种或多种荧光标志物例如量子点或抗体，还包含可能在一些特定可视化系统中需要的辅助溶液如过氧化物酶溶液。
根据一些实施方案，试剂盒作为“研究试剂盒”和/或作为“临床”试剂盒提供。“研究试剂盒”的瓶的设计和大小可以适应于研究实验室背景下或在其中有限数量的组织样品应按手工执行或仅部分自动化的工作流程透明化的任何其他实验室中使用。“临床试剂盒”的瓶的设计和大小可以适应于其中大量组织样品应按全自动化或半自动化工作流程透明化的大型临床前实验室、临床实验室和诊断实验室的背景下使用。例如，“临床试剂盒”的瓶设计可以允许将瓶插入如在例如中图3A和图3B所示的样品自动化预处理和透明化系统的相应插槽中。
图3A显示设置为根据本文对本发明实施方案所述的样品制备方法，自动或半自动制备组织样品的样品制备系统302。该样品制备系统可以是包含单元310、312、314、316、318、320、326、306、322中每者的一体装置，并且任选地，单元308也是整合的装置组件。备选地，样品制备系统可以是分布式、模块化系统，其中一个或多个上文提到的单元对应于分别的设备或装置。将样品从一个单元输送至下一个单元可以通过输送带和/或机械臂全自动进行或由人类用户手工进行。输送也可以半自动地实施，从而仅一个或多个输送步骤或其他工作流程步骤需要人类干预，而大部分工作流程步骤自动地进行。样品制备系统302可以包含或可操作地耦合于控制单元320，例如，具有例如微芯片形式的控制计算机或嵌入式设备。
用户可以将一个或多个组织样品301浸渍于第一固定液202中，用于生成固定的组织样品，其中所述固定的组织样品从其中第一固定发生的第一固定单元308手工或自动输送至样品制备系统的装载单元306。如上文段落中提到，在一些备选实施方案中，第一固定单元308可以是样品制备系统302的整合部分。
样品制备系统302借助样品装载单元306接收一个或多个固定的样品并且将样品浸渍于单元310中所浸渍的样品的第一样品容器C1中。容器C1包含脱脂液204。控制器326引起样品浸渍单元310将一个或多个样品浸渍于如本文对本发明实施方案所述(例如，如图1，步骤104的描述中所述)的脱脂液中。
光漂白单元312是任选的组分。控制单元可以设置成发送命令至样品输送单元211(例如，输送带和/或一个或多个机械臂)，所述命令适应于使得输送单元将一个或多个组织样品从样品浸渍单元310输送至光漂白单元312中的容器C2。备选地，光漂白单元可以是样品浸渍单元或染色单元314的整合部分并且适应于对一个或多个包含于容器C1或C3中的样品进行光漂白。控制单元可以适应于发送命令至光漂白单元，以如本文对本发明实施方案所述(例如，如图1，步骤106的描述中所述)，对一个或多个样品进行光漂白。
控制单元还可以设置成发送命令至样品输送单元211，用于将一个或多个组织样品从样品浸渍单元310或从光漂白单元312(如果有的话)输送至染色单元314中的容器C3。容器C3可以由一个或多个分别包含染色液或染色方案206中所需要溶液的容器组成。控制单元可以适应于发送命令至染色单元，用于以如本文对本发明实施方案所述(例如，如图1，步骤108的描述中所述)的一种或多种染料、特别地荧光染料着染一个或多个样品，例如，通过将样品浸渍于相应的染色液中持续预定的时间并且随后交换染色液或随后将样品放入包含不同染色液的不同容器C3中来着染。
控制单元还可以设置成发送命令至样品输送单元211，用于将一个或多个组织样品从染色单元输送至任选的第二固定单元314中的容器C4。容器C4可以包含在染色单元314中施加的适应于固定组织样品中标志物的第二固定液208。控制单元可以适应于发送命令至第二固定单元316，用于浸渍一个或多个样品于如本文对本发明实施方案所述(例如，如图1，步骤110的描述中所述)的第二固定液中。
控制单元还可以设置成发送命令至样品输送单元211，用于将一个或多个组织样品从第二固定单元316(如果有的话)或从染色单元314输送至脱水单元318中的一个或多个容器C5。容器C5可以包含一种或多种脱水液210，例如，水和乙醇的混合物。控制单元可以适应于发送命令至脱水单元，用于浸渍一个或多个样品于多种脱水液中，从而样品首先浸渍于有机溶剂含量比较低的脱水液中(例如70％乙醇、95％乙醇和100％乙醇)，随后浸渍于一种或多种具有渐增含量有机溶剂的其他洗涤溶液中，并且随后最终浸渍于包含高含量有机溶剂的洗涤溶液(例如，100％乙醇)中。可以如本文对本发明实施方案所述(例如，如图1，步骤110的描述中所述)那样进行样品的洗涤。
控制单元还可以设置成发送命令至样品输送单元211，用于将一个或多个组织样品从脱水单元输送至透明化单元314中的容器C6。容器C6可以包含有机透明化液212，例如，BABB，其中优选地调整所述机透明化液的组成，从而有机透明化液的RI与特定组织类型的已洗涤组织样品的RI相同或十分相似。例如，容器C6可以是显微镜的浸渍室或载物台容器，使得用户向显微镜输送透明化样品并且将它插入显微镜的浸渍室中成为可能。控制单元可以适应于发送命令至透明化单元320，用于浸渍一个或多个样品于如本文对本发明实施方案所述(例如，如图1，步骤114的描述中所述)的有机透明化液中。该系统可以进一步包含具有如图2中所示试剂和溶液的瓶和受控制器控制以按协调方式泵送溶液进入相应容器中的各种泵。
样品制备系统可以用于提供可在一个或多个样品分析系统304、特别地光学分析系统(例如，光片显微镜、拉曼光谱仪等)中分析的透明化组织样品301’。样品301’可以由样品输送装置自动输送至或由用户手工输送至样品分析系统。
图3B描述了一个备选的实施方案，为样品制备系统352。系统352包含数目比图3a中所述系统更少的样品容器。例如，系统352可以包含单个浸渍单元354的单个样品容器C0。浸渍单元借助一个或多个泵213可操作地耦合于脱脂液204、一种或多种染色液206、一种或多种脱水液120、有机透明化液212并且任选地还耦合于第一固定液202和/或第二固定液208。控制单元326适应于如此协调泵213，从而一个或多个从装载单元306载入浸渍单元的容器C0中的组织样品301浸渍于根据样品制备方法本文对本发明实施方案所述的溶液204、206、208、120、212中。例如，控制单元可以启动和停止一个或多个泵213、开放或关闭相应试剂瓶204-212的阀，从而例如首先用脱脂液填充含有样品的第一容器C0，随后将脱脂液移除，并且由一种或多种染色液、第二固定液、一系列脱水液并最终由有机透明化液替换，直至获得有机透明化的样品301’并且从样品制备系统352卸载至样品分析系统304。
尽管图3A中描述的实施方案基于多个用于不同溶液和输送装置的不同容器的组合，所述组合适应于将组织样品从一个容器输送至另一个容器，图3B中描述的实施方案基于协调控制与多个试剂瓶连接的泵和阀，从而单个容器C0中包含的一个或多个组织样品随后浸渍于不同溶液中，因为在预定的浸渍时间间隔后更换溶液。
根据进一步的实施方案，样品制备系统包含图3A和图3B中所示的两种基本构思的混合。例如，这些实施方案可以包含多于一个单一容器和多于一个单一浸渍单元，并且包含用于将样品从这些容器之一输送至另一容器的输送机构。但是，这些实施方案可以额外地包含控制单元，所述控制单元设置成如此协调与至少一些试剂瓶连接的泵和阀，从而在不输送样品至不同容器的情况下，当前浸渍样品的溶液被另一溶液交换。
几乎全部目前可用的组织透明化程序使用费时和费力的完整动物灌注法，以减少器官中血液和组织组分的光吸收的影响。相反地，本发明的实施方案提供免灌注透明化方案，其适应于加快组织透明化并使得实现大型动物研究成为可能，所述大型动物研究是很大程度依赖如图3A和图3B中所示的自动化样品处理系统的药学研究的前提。基于标准组织学的组织处理(福尔马林固定及乙醇脱水)和既存的基于有机溶剂的透明化方法(BABB)，本发明的实施方案提供可以按自动化或半自动化方式整合入常规组织学工作流程中的改进的透明化方案。本发明实施方案的组织透明化方案易于进行并且使得免灌注、快速、自动化、安全和便利的组织处理(例如，在真空和/或压力操作的组织制备系统中)成为可能。
在一些实施方案中，在有机透明化液中浸渍样品的步骤于自动化系统外部手工地进行，因为一些有机透明化溶液对大部分塑料组件有高度腐蚀性。但是，在优选的实施方案中，有机透明化液是BABB或光学特性相似的允许在室温按自动化样品处理工作流程浸渍样品的有机透明化液。根据实施方案，完全脱水的样品自动地转移入包含有机透明化液的移动式输送容器，例如，包含BABB溶液的抗腐蚀容器(其可以是试剂盒的部分)。
根据一些实施方案，样品制备系统可以包含一个或多个使得标准化条件下快速、自动化和高通量处理成为可能的真空和压力操作的组织处理器(如，例如Tissue
Figure BDA0002550254290000311
VIP、Sakura 311Finetek)或功能上等同的装置或装置组件。
图4显示用常规有机透明化方案透明化的组织样品和用本发明实施方案的方法透明化的组织样品的比较。
剖取肝叶并在4℃浸渍于具有4％多聚甲醛(PFA)的强力固定液中24小时。随后，将固定的组织样品浸渍于缓冲液(含有保存剂ProClin 300的磷酸盐缓冲盐水，PBSPC)中并储存在4℃直至进一步处理。随后，自肝叶取活检样品并作为组织样品使用。对组织样品使用不同的样品制备方案。
图4的上侧行中所述的三份组织样品说明了根据现有技术的有机组织透明化方案处理的标准化鼠肝脏样品的透光性。
图4的下侧行中所述的三份组织样品说明了根据本发明实施方案的组织制备方案处理的标准化鼠肝脏样品的透光性。将组织样品浸渍于作为脱脂液使用的基于水的透明化液(称作“CUBIC-1”)中，随后是用于生成图4上侧行中所述的透明化样品的相同现有技术的快速BABB组织透明化方案。如从上侧行和下侧行的比较可以容易地推导出，在启动实际有机透明化方案之前，在脱脂液中浸渍组织样品显著地增加光学透明度。另外，比较原始组织样品和透明化组织样品的图像(未显示)表明，当在样品根据有机溶液基透明化方案透明化之前，将样品浸渍于脱脂液中，组织形态保留得更好。
图5显示光片显微镜304和带样品504的浸渍室。更详细地描述了显微镜304的生成光片的照射源502。显微镜可以按竖直方向向上和/或向下移动光片并且还可以适应于按两个其他方向移动两个其他光片，从而3D坐标系统可以用已经与组织样品中的特定细胞或生物标志物选择性结合的荧光染料发射的信号填充。
图6显示数字3D荧光组织病理学工作流程整合入常规组织学工作流程(“FF”：福尔马林固定，“EtOH”；乙醇，“BABB”：苯甲醇苯甲酸苄酯)。优选地基于包括浸渍样品于脱脂液中和有机透明化液中的透明化方案进行“组织透明化”步骤。浸渍于有机透明化液中总是前置有一系列在溶液中的洗涤步骤，所述溶液包含渐增量的有机溶剂(如乙醇)，以确保样品的液体部分的RI与用于分析图像的透明化液的RI相同或相似及确保来自组织水和有机溶剂混合在分析期间不产生纹影(schlieren)。
图7显示在透明化方案的不同阶段的多种类型鼠组织样品，所述透明化方案仅包括有机脱水和透明化步骤，但不包括在脱脂液中浸渍样品的步骤。该图显示基于福尔马林的组织固定和脱水对组织完整性和透光性的影响。在组织处理方案的每个阶段测定外植的小鼠器官和组织样品的大小(并未描述全部阶段)。在第一固定液中和特别地在洗涤(脱水)液中孵育样品在几乎全部研究的器官中引起明显的组织收缩。特别地，与天然状态相比，神经组织如脑和坐骨神经显示出可观的尺寸减少(减少>30％)。这种收缩作用几乎可见于全部器官和组织类型，尺寸减少范围从1.5％直至30％。图7A描述了已经进行了不包括在脱脂液中孵育的有机透明化方案处理的不同小鼠器官和组织。基于所得的透光性，各个组织类型分成三个组：(I)高透光性(绿色标记)，(II)中等透光性(黄色标记)，和(III)低透光性(红色标记)。图7B描述对不同组织类型的组织收缩的分析。
图8显示对96孔平板806中的小鼠脑组织样品803施加表802中所列的多种脱脂液时获得的组织透明化效果。将脑组织样品在4℃浸渍于具有4％多聚甲醛(PFA)的强力固定液中48小时。随后，将固定的组织样品浸渍于缓冲液(PBS)中并储存在4℃直至进一步处理。随后，将脑样品转移到上透明底96孔平板，并且对不同波长(550、630、740nm)测量样品因散射和吸收产生的光衰减以获得“原始衰减”。
随后，将全部样品转移至falkon管以浸渍样品于脱脂液中。将相同列的孔中的全部样品均浸渍于相同的脱脂液中12-24小时。受检的一些脱脂液是本领域已知的基于水的透明化液，例如CUBIC-1变型。随后，将样品彻底洗涤5x5分钟以移除全部脱脂液并浸渍于用于测量“原始衰减”的相同缓冲液(例如PBS)中。随后，将样品转移回到96孔平板上并测量样品的光衰减。
测量在三个不同波长(550、630和740)的平均信号降低。条形图808中显示结果。观察到就组织的光学透明度而言，脱脂液“1.10.1”和“1.11”提供最佳结果。因此，根据实施方案，脱脂剂可以例如是脱脂液“1.10.1”或脱脂液“1.11”。“CUB1”也可以用作脱脂剂，不过与其他两种脱脂液相比，最终所得组织样品的光学透明度可能较低。
图9A显示按两列和三行安排的小鼠完整器官组织样品的六对照片。第一行对应于脾组织，第二行对应于肝组织并且最下行对应于脑组织。第一列“0％”和第二列“5％”分别包括三对组织样品照片，其中每对照片的左侧图像描述未灌注的新鲜组织样品并且每对照片的右侧图像描述在基于水的脱脂液和有机透明化液二者中浸渍后的所述组织样品。基于水的脱脂液充当基于水的透明化液。用于获得第一(“0％”)列中透明化组织样品的基于水的脱脂液DLS0不含离液剂脲。用于获得第二(“5％”)列中透明化组织样品的基于水的脱脂液DLS5包含5％(以体积计)离液剂脲。
例如，基于水的脱脂液DLS0可以由包含以下组分的基于水的溶剂组成：
·以体积计20％Quadrol，
·以体积计5％吐温80，
·5％三乙醇胺(TEA)，
·5％二甲基亚砜(DMSO)，
·约3μg碘化丙啶/ml。
例如，基于水的溶剂可以是纯水。备选地，基于水的溶剂可以是1X PBS(磷酸盐缓冲盐水)或10x PBS或不同浓度的PBS缓冲液。PBS是生物学研究中常用的缓冲溶液。它是含有磷酸氢二钠、氯化钠并且在一些配方中含有氯化钾和磷酸二氢钾的基于水的盐溶液。该缓冲液帮助维持恒定pH。溶液的克分子渗透压浓度和离子浓度优选地匹配于组织样品(等渗)。
例如，10x PBS是包含NaCl(58.44g mol-1)、KCl(74.55g mol-1)、Na2HPO4(141.96gmol-1)和KH2PO4(136.09g mol-1)的水。
基于水的脱脂液DLS5可以不同于DLS0，仅在于它额外包含以体积计5％的离液剂脲。
图像显示，如果脱脂液缺少离液剂或仅包含少量离液剂，则有机溶液BABB引起的组织收缩导致组织样品明显收缩和扭曲。这种作用对脑组织特别明显，其中BABB溶液和用有机溶剂洗涤导致脑样品的体积收缩30％，如果使用DLS0，所述体积收缩无法由任何离液剂补偿(图9A的第一列)。当应用DLS5而非DLS0时，可能至少部分补偿BABB引起的收缩作用，因为DLS5溶液中所含的5％脲产生仅10％而非30％的净组织体积收缩作用(图9A的第二列)。
在脑组织、肝组织和脾组织的又一试验系列中(未显示)，申请人观察到，下文给出其组成的备选性DLS0溶液与BABB组合时对组织样品具有基本相同的作用。备选性DLS0溶液由包含以下组分的基于水的溶剂组成：
·以体积计25％Quadrol，
·以体积计5％吐温80，
·5％三乙醇胺(TEA)，
·5％二甲基亚砜(DMSO)，
·约3μg碘化丙啶/ml。
量更高的quadrol导致具有高血红蛋白浓度的肝组织和脾组织的透明化略微更好。
图9B显示按三列和三行安排的小鼠完整器官组织样品的9对照片。如同图9A中，第一行对应于脾组织，第二行对应于肝组织并且最下行对应于脑组织。第一列“15％”、第二列“25％”和第三列“饱和”分别包含三对组织样品照片，其中每对照片的左侧图像描述未灌注的新鲜组织样品并且每对照片的右侧图像描述在基于水的脱脂液和有机透明化液二者中浸渍后的所述组织样品。用于获得第一(“15％”)列中透明化组织样品的基于水的脱脂液DLS15包含15％(以体积计)离液剂脲。用于获得第二(“25％”)列中透明化组织样品的基于水的脱脂液DLS25包含25％(以体积计)离液剂脲。用于获得第二(“饱和”)列中透明化组织样品的基于水的脱脂液DLSS是用离液剂脲饱和的基于水的溶液。
图像显示，DLS15能够补偿有机溶液BABB引起的组织收缩。肝组织和脑组织显示一些轻微变形，但原始组织样品的基本结构和大小基本维持。
在DLS25溶液(即，包含以体积计25％脲的DLS0溶液)中浸渍组织样品首先导致明显的样品膨胀(未显示)。组织膨胀使得组织样品对其他溶剂高度可透过并导致破坏一些向样品提供结构稳定性的胞外和/或胞内结构。洗涤和浸渍经DLS25先前处理过的样品因此导致组织形态的明显净收缩和扭曲(第二“25％”列中的右侧图像)。
在DLSS溶液(即，脲饱和的DLS0溶液)中浸渍组织样品首先导致明显的样品膨胀(未显示)。膨胀导致样品的结构去稳定化。对于全部受检组织类型，洗涤和浸渍经DLSS先前处理过的样品因此导致组织形态的强烈净收缩和扭曲(第三“饱和”列中的右侧图像)。
图9A的图像对显示，为了补偿BABB/脱水引起的收缩作用，需要至少5％的脲浓度。
图9B的图像对显示，如果选择离液剂的量过高，则膨胀作用和BABB引起的收缩作用可能无法单纯地彼此补偿。相反地，强烈膨胀可能破坏细胞结构和亚细胞结构并且使得组织样品甚至对BABB/脱水引起的收缩更敏感。但是，在限定的离液剂浓度范围(例如，5％-15％脲和硫脲)内，离液剂引起的膨胀作用确切地补偿有机透明化液例如BABB的收缩作用，并且通过促进全部种类的透明化剂和去垢剂灌注组织，进一步增加组织透明性。
为了获得每对照片的右侧图像中所述的组织样品，根据以下样品处理程序处理分别在每对照片的左侧图像中所述的未处理组织样品：通过4℃浸渍样品于固定液中约22小时，固定组织样品。固定液可以例如是4％多聚甲醛(PFA)。随后，将每份样品在PBS中淋洗两次并在以下基于水的脱脂液之一中浸渍10天：DLS0、DLS5、DLS15、DLS25、DLSS，伴以缓慢架空(overhead)转动。随后，将样品用水淋洗并转移至包含0.5％ProClin(或类似抗微生物剂)的PBS或PBST(含吐温例如吐温20的PBS)溶液。将样品在黑暗下于室温浸渍于PBST-ProClin溶液中约16小时，伴以缓慢架空转动。随后将样品转移至包含0.1％ProClin的PBS或PBST溶液中。随后，将样品转移至100％乙醇中。转移可以涉及逐步转移样品例如至70％乙醇中，随后转移至90％乙醇中并最终转移至100％乙醇中，以移除水。最后，将样品浸渍于有机透明化液如BABB中。
已经显示，高于15％的脲浓度与损坏组织的风险升高相关，至少对一些组织类型如此，而低于5％的浓度导致脱水/BABB浸渍后组织重度收缩。因此，可以认为脱脂液中离液剂的理想浓度在5％和15％之间。
图10显示在多个样品处理步骤和透明化步骤的每者后多份组织样品的照片。受检的组织样品是完整器官样品(脑、肝脏、心脏、肾脏和肺)和肿瘤组织样品。DLS5是上文参考图9描述的脱脂液并且包含约5％脲。上文参考图9描述的孵育时间和温度也用于处理图10中描述的样品。如可以从第二(在DLS5中孵育之前)列和第三(在DLS5中孵育之后)列中组织样品的图像的比较推断，已经通过浸渍样品于DLS5溶液中获得第一透明化效果。通过孵育样品于有机透明化液BABB中获得第二、更强烈的透明化效果。在DLS5和BABB两者中浸渍样品提供特别高的样品透明化效果和与此同时，特别低的样品形态学扭曲。
在下表中，提供图10中描述的新鲜组织样品和BABB处理的组织样品的尺寸比较：
Figure BDA0002550254290000361
*)归因于一些器官(如脾脏)强烈弯曲，将投影面积作为相应组织的宽度和长度的横向尺寸(lateral size)测定。
一般地，在BABB中浸渍组织样品导致组织样品的初始体积发生约30％至50％的组织收缩。该表显示，在浸渍样品于BABB溶液中之前，将样品浸渍于包含约5％脲的脱脂液中，能够保护组织样品避免大部分受检组织类型发生BABB引起的收缩。该效果在肝组织、脑组织、肾组织和肺组织中特别明显，还可在心脏和肿瘤组织中观察到。优选地，将特别坚固的组织类型(例如，心脏和肿瘤组织)浸渍于包含体积多于5％(例如，10-15％)量的离液剂的脱脂液中，以对抗BABB引起的收缩。
参考数值列表：
100 方法
102-116 步骤
202 第1固定液
204 脱脂液
206 染色液
208 第2固定液
210 有机脱水液(乙醇)
211 样品输送系统
212 有机透明化液
213 泵
214-222 试剂盒
301 组织样品
301’ 制备且透明化的组织样品
302 样品制备系统
304 样品分析系统，例如，显微镜
306 样品装载单元
308 第一固定单元
310 样品浸渍单元
312 光漂白单元
314 染色单元
316 第2固定单元
318 脱水单元
320 透明化单元
322 样品卸载单元
354 样品浸渍单元
502 横断组织样品的光片的图像
802 表
803 脑组织样品
806 96孔板
808 条形图

Claims (20)

1.一种制备光学分析用生物组织样品(301)，从而所制备样品的体积和/或形态距原始组织的体积或形态的偏离最小化的方法(100)，所述方法包括：
-a)用第一固定液(202)固定(102)组织样品；
-b)在脱脂液(204)中浸渍(104)固定的组织样品，脱脂液包含适应于诱导样品膨胀的离液剂；
-d)用一种或多种染色液(206)着染(108)组织样品；
-f)在有机脱水液(210)中使染色的组织样品脱水(112)，脱水液适应于诱导样品收缩；和
-g)在有机透明化液(212)中浸渍(114)固定的组织样品。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括：
-c)用波长范围的光照射样品，其中所述波长范围包含染料的一个或多个发射波长和/或激发波长，以选择性消除或减少样品在所述波长范围内的自身荧光。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括：
-e)在进行洗涤和脱水之前，用第二固定液(208)固定(110)染色的组织样品。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中如此选择脱脂液的组成，从而有机脱水液诱导的组织收缩事先被脱脂液诱导的膨胀补偿。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，
-其中离液剂是适应于引起样品的体积膨胀至少15％的原始样品体积或至少20％的原始样品体积；和/或
-其中如此选择脱脂液的组成，从而脱脂液诱导的膨胀和脱水液引起的收缩的联合效果提供与原始、未处理组织样品的体积偏离小于15％、优选地小于10％、优选地小于5％的透明化组织样品。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，离液剂是非离子型离液剂、特别地脲或硫脲、或离子型离液剂胍、特别地以胍盐形式提供的胍。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中脱脂液包含以体积计5-30％、优选地10-25％、优选地15-25％、更优选地20-25％的氨基醇、特别地N,N,N',N'-四(2-羟丙基)乙二胺。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中脱脂液是基于水的透明化液。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中组织在第一固定组合物中的固定、固定的组织样品在脱脂液中的浸渍、染色、脱水、和固定的组织样品在有机透明化液中的浸渍以自动化或半自动化工艺进行，所述工艺不包括灌注步骤。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，有机透明化液是苯甲醇和苯甲酸苄酯(BABB)的混合物，所述方法包括：
-制备有机透明化液，所述制备包括如此选择苯甲醇和苯甲酸苄酯的比率，从而有机透明化液的折射率与样品的组织类型的折射率相同或相似。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，样品具有至少0.5cm3、或至少0.75cm3、或至少1cm3的体积。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，在用第一固定液固定样品之前，样品已经包含报道蛋白或染色的生物标志物、药物或代谢物。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括：
-使用光片荧光显微镜，生成(116)透明化组织样品的着色亚结构的3D图。
14.用于制备光学分析用生物组织样品的自动化或半自动化系统(302,352)，系统设置为：
-接收固定的组织样品，固定的组织样品已经用第一固定液(202)固定(102)；
-在脱脂液(204)中浸渍(104)固定的组织样品，脱脂液包含适应于诱导样品膨胀的离液剂；
-用一种或多种染色液(206)着染(108)组织样品；
-在有机脱水液(210)中洗涤和脱水(112)染色的组织样品，脱水液适应于诱导样品收缩；
-在有机透明化液(212)中浸渍(114)固定的组织样品。
15.根据权利要求14所述的自动化或半自动化系统(302,352)，
-包含多种溶液中每一者的试剂容器的系统，所述溶液包含脱脂液(204)、一种或多种染色液(206)、第二固定液(208)、有机脱水液(120)和有机透明化液(212)；
-包含样品输送装置(211)和多个分别与试剂容器之一耦合的样品容器(C1-C6)的系统，系统设置成如此半自动或全自动地协调样品输送，从而样品浸渍于根据权利要求14的多种溶液的每一溶液中至少一次；或
-包含一个或多个分别与试剂容器之一耦合并与样品容器(C0)耦合的泵(213)的系统，所述系统设置成如此协调泵，从而样品浸渍于根据权利要求14的多种溶液的每一溶液中至少一次。
16.用于制备一个或多个组织样品的试剂盒(214,216,218,220,222)，包含：
-脱脂液，其包含：
以体积计5％-30％、优选地5％-15％的至少一种离液剂；
以体积计5-30％至少一种去垢剂；和
-有机透明化液。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，离液剂是非离子型离液剂或胍，特别地以胍盐形式提供的胍。
18.根据权利要求16或17所述的试剂盒，离液剂是脲或硫脲。
19.根据前述权利要求16-18中任一项所述的试剂盒，其中脱脂液还包含以体积计5-30％、优选地10-25％、优选地15-25％、更优选地20-25％的氨基醇、特别地N,N,N',N'-四(2-羟丙基)乙二胺。
20.根据权利要求16-18中任一项所述的试剂盒，至少一种去垢剂是至少两种不同去垢剂的组合，特别地三乙醇胺(TEA)和吐温80的组合。
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Hu Dual-View Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM) Imaging for Accurate 3D Digital Pathology

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