CN106289915A - 用于生物组织样本的脱水组合物、脱水方法和制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于生物组织样本的脱水组合物、脱水方法和制备方法，该制备方法包括脱水与透明两过程：脱水时每次采用不同梯度浓度的脱水剂，且最后一步的脱水剂中有机试剂的体积浓度为97％‑99.5％，每次的脱水时间视组织样本体积和最小厚度维度在0.5‑3小时之间选择；然后经透明剂浸泡0.5个小时即完成整个透明标本的制备。本发明方法制备的完整生物组织透明样本制备时间大大缩短，制得的透明标本透明度高，荧光蛋白荧光信号稳定，更可以利用光片照明显微镜进行快速连续的成像观察。

Description

用于生物组织样本的脱水组合物、脱水方法和制备方法
技术领域
本发明属于生物医学和生物组织标本制备领域，更具体的涉及一种用于生物组织样本的脱水组合物、脱水方法和制备方法。
背景技术
全面准确地了解器官的内部结构及其神经血管走向情况是神经科学乃至整个生物医学研究领域不可或缺的基础，但组织不透明阻碍了对于大多数完整生物组织标本的全局式观察。在这种需求下应运而生了完整生物组织透明技术，使得器官不必切片，即可在完整状态下进行观察研究。
近年来，组织透明方法层出不穷，大体可以分为两类，一类是利用水溶性试剂透明，通过这类方法制备完整生物组织透明样本时间较长，处理时间通常在一周以上，并且透明效果较差，只有个别方法制得的样品可以利用双光子显微镜观察，更不能达到光片照明显微镜成像需求；另一类是利用有机溶剂透明，通过这类方法制备完整生物组织透明样本的处理时间要短于水溶性试剂透明的时间，根据样本大小的不同需要3-5天时间，获得的透明样本透明效果很好，达到对样品透明度要求最高的光片照明显微镜观察的要求，但是通过这类方法制作样品至少也需要数天的时间，且其组织内部荧光蛋白荧光信号易淬灭，不利于观察。
综上所述，目前完整生物组织样本透明的制备方法中缺乏快速的透明手段，同时也缺乏具备高透明度、保护荧光蛋白荧光信号的技术。
发明内容
为克服上述现有技术的不足，本发明的主要目的是提供用于生物组织样本的脱水组合物、脱水方法和制备方法，以便解决上述技术问题中的至少之一。
为了实现上述目的，作为本发明的一个方面，本发明提供了一种用于生物组织样本的脱水组合物，包括：
能够使所述生物组织样本脱水的有机试剂；以及
水；
其特征在于，所述脱水组合物用于生物组织样本最后一步的脱水，且水占所述脱水组合物的体积浓度在0.5-3％范围之间。
作为本发明的另一个方面，本发明还提供了一种用于生物组织样本脱水的脱水试剂组合，包括：
N种脱水试剂，所述脱水试剂均包含能够使所述生物组织样本脱水的有机试剂和水，其中，N为大于等于2的整数；
其特征在于，所述N种脱水试剂中用于生物组织样本最后一步脱水的脱水试剂采用如上所述的脱水组合物。
作为本发明的再一个方面，本发明还提供了一种生物组织样本的脱水方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用如上所述的脱水试剂组合依次进行脱水，其中每一次脱水中，根据待处理的生物组织样本的体积和最小维度厚度，脱水时间在0.5-3小时之间选择；以及
所述脱水试剂组合中，有机试剂的体积浓度根据所述脱水试剂的使用先后顺序而逐渐增大。
作为本发明的还一个方面，本发明还提供了一种生物组织透明样本的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用如上所述的脱水方法对待处理的生物组织样本进行脱水；以及
使用透明剂浸泡所述待处理的生物组织样本来完成整个生物组织透明样本的制备。
基于上述技术方案可知，采用本发明的脱水组合物及脱水、透明方法可以在24小时内获得完整生物组织透明样本，具备快速制备完整生物组织样本的能力；本发明方法操作简便，透明效果好，更重要的是荧光蛋白荧光信号稳定，可用于光片照明成像设备进行完整器官快速整体成像。
附图说明
图1是C57小鼠脑标本经本发明实施例1处理后的透明效果图；
图2是SD大鼠脑标本经本发明实施例2处理后的透明效果图；
图3是荧光蛋白转基因小鼠脑标本经本发明实施例1处理后的光片照明成像效果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
现有的完整生物组织透明标本的制备方法多种多样，但是无论水溶性透明方法还是有机溶剂透明方法，对于完整动物组织来看透明标本的处理时间最短也需3天时间；而本发明公开了一种脱水、透明方法，可以在24小时内获得完整生物组织透明样本，具备快速制备完整生物组织样本的能力。
具体地，本发明公开了一种用于生物组织样本的脱水组合物，包括：
能够使生物组织样本脱水的有机试剂；以及
水；
其中，该脱水组合物用于生物组织样本最后一步的脱水，且水占脱水组合物的体积浓度在0.5-3％范围之间。
作为优选，该有机试剂选自乙醇、四氢呋喃、叔丁醇、丙醇、三甘醇、丁辛醇和环己醇中的一种或多种。
本发明还公开了一种用于生物组织样本脱水的脱水试剂组合，包括：
N种脱水试剂，该脱水试剂均包含能够使生物组织样本脱水的有机试剂和水，其中，N为大于等于2的整数；
其中，该N种脱水试剂中用于生物组织样本最后一步脱水的脱水试剂采用如上所述的脱水组合物。
本发明还公开了一种生物组织样本的脱水方法，包括以下步骤：
采用如上所述的脱水试剂组合依次进行脱水，其中每一次脱水中，根据待处理的生物组织样本的体积和最小维度厚度，脱水时间在0.5-3小时之间选择；以及
该脱水试剂组合中，有机试剂的体积浓度根据脱水试剂的使用先后顺序而逐渐增大。
作为优选，对于待处理的生物组织样本的最小维度厚度在1-3mm的，脱水时间为0.25-1h；最小维度厚度在3-5mm的，脱水时间为1-2h；最小维度厚度在5-10mm的，脱水时间为2-3h。
作为优选，N为3、4、5或6，即脱水次数为3、4、5或6。
其中，该生物组织样本可以是部分的，也可以是完整的生物组织样本，优选为完整的样本。
本发明还公开了一种生物组织透明样本的制备方法，包括以下步骤：
采用如上所述的脱水方法对待处理的生物组织样本进行脱水；以及
使用透明剂浸泡待处理的生物组织样本来完成整个生物组织透明样本的制备。
其中，透明剂例如选自苯甲酸与苯甲酸苄酯的混合液、苄醚、二苯醚、二甲苯或氯仿；透明剂的浸泡时间可以为0.5-1h，优选为0.5h。
本发明的脱水时间与现有技术构成鲜明的反差，下表中将这种对比清楚的展示了出来。
最小维度(mm) 已有方法每次脱水时间(h) 本申请方法每次脱水时间(h)
1-3 1 0.25-1
3-5 12 1-2
5-10 24 2-3
下面结合具体实施例和实验结果对本发明的技术方案作进一步阐述说明。
成年Thy-1小鼠一只，体重约20g，用1ml注射器抽取1％戊巴比妥钠溶液0.2ml，腹腔注射麻醉。
待动物痛觉消失后，开胸充分暴露心脏，快速用装有1×PBS溶液(pH7.4)的注射器自左心室进行心脏穿刺，5分钟内均匀推注1×PBS溶液20ml，动物眼球、前肢及肝脏血色消失，继续灌注4％多聚甲醛溶液20ml(pH7.4，1×PBS配制)。刚开始灌注多聚甲醛时，可见到动物抽动、甩尾，之后动物肢体和尾巴绷直，提示灌注成功。
剪开颅骨，小心分离剪断与脑相连的颅神经，取出完整动物脑标本，浸入4％多聚甲醛溶液中，置于4℃冰箱内继续后固定2小时以上，最好过夜。
实施例1
用蒸馏水配制50％四氢呋喃、60％四氢呋喃、80％四氢呋喃、90％四氢呋喃、98％四氢呋喃各50ml，分别盛放于密封的玻璃瓶内，用铝箔纸将玻璃瓶包裹严实，以避光。将脑标本依次浸泡于由低浓度到高浓度的四氢呋喃脱水剂中各1小时，然后再用苄醚作为透明剂对脑标本进行透明处理，将脑标本从98％四氢呋喃溶液中取出后浸入装有50ml苄醚溶液的密封玻璃瓶内，同样此玻璃瓶也用铝箔纸进行包裹避光，3小时后用显微镜进行观察，结果如图1所示。对该样品进行光片照明成像处理，结果如图3所不。
实施例2
用蒸馏水配制50％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、99％乙醇各50ml，分别盛放于密封的玻璃瓶内，用铝箔纸将玻璃瓶包裹严实，以避光。将脑标本依次浸泡于由低浓度到高浓度的乙醇脱水剂中内各2小时，然后再用苯甲醇与苯甲酸苄酯的混合液作为透明剂对脑标本进行透明处理。将脑标本从99％乙醇溶液中取出后浸入装有50ml苄醚溶液的密封玻璃瓶内，同样此玻璃瓶也用铝箔纸进行包裹避光，2小时后用显微镜进行观察，结果如图2所示。
经过试验验证，通过本发明方法制备的完整生物组织透明样本制备时间大大缩短，例如成年小鼠脊髓只需2.5个小时，大鼠整脑只需18.5个小时，并且由此制得的透明标本透明度高，荧光蛋白荧光信号稳定，可以利用光片照明显微镜进行快速连续的成像观察。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于生物组织样本的脱水组合物，包括：
能够使所述生物组织样本脱水的有机试剂；以及
水；
其特征在于，所述脱水组合物用于生物组织样本最后一步的脱水，且水占所述脱水组合物的体积浓度在0.5-3％范围之间。
2.如权利要求1所述的脱水组合物，其特征在于，所述有机试剂选自乙醇、四氢呋喃、叔丁醇、丙醇、三甘醇、丁辛醇和环己醇中的一种或多种。
3.一种用于生物组织样本脱水的脱水试剂组合，包括：
N种脱水试剂，所述脱水试剂均包含能够使所述生物组织样本脱水的有机试剂和水，其中，N为大于等于2的整数；
其特征在于，所述N种脱水试剂中用于生物组织样本最后一步脱水的脱水试剂采用如权利要求1或2所述的脱水组合物。
4.一种生物组织样本的脱水方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用如权利要求3所述的脱水试剂组合依次进行脱水，其中每一次脱水中，根据待处理的生物组织样本的体积和最小维度厚度，脱水时间在0.5-3小时之间选择；以及
所述脱水试剂组合中，有机试剂的体积浓度根据所述脱水试剂的使用先后顺序而逐渐增大。
5.如权利要求4所述的脱水方法，其特征在于，对于待处理的生物组织样本的最小维度厚度在1-3mm的，脱水时间为0.25-1h；最小维度厚度在3-5mm的，脱水时间为1-2h；最小维度厚度在5-10mm的，脱水时间为2-3h。
6.如权利要求4所述的脱水方法，其特征在于，所述N为3、4、5或6。
7.如权利要求4所述的脱水方法，其特征在于，所述生物组织样本为完整的生物组织样本。
8.一种生物组织透明样本的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用如权利要求4至7任意一项所述的脱水方法对待处理的生物组织样本进行脱水；以及
使用透明剂浸泡所述待处理的生物组织样本来完成整个生物组织透明样本的制备。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述透明剂选自苯甲酸与苯甲酸苄酯的混合液、苄醚、二苯醚、二甲苯或氯仿。
10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述透明剂的浸泡时间为0.5-1h，优选为0.5h。
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