CN117147251B - 一种人类离体牙髓组织透明化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种人类离体牙髓组织透明化方法，该透明化方法是先将人类离体牙齿经液氮冷冻后进行解剖牙髓及固定处理，所得已固定的牙髓组织再经脱水处理、漂白处理和染色预处理后得到已染色预处理的牙髓组织，然后根据所需添加的抗体是否共轭了荧光染料进行不同的孵育处理，作为已经染色处理的牙髓组织，最后经脱水处理和洗涤后浸泡入Eci缓冲液中作为透明化处理后的牙髓组织观察样本。该方法透明化程度显著，符合作为透明化牙髓观察样本进行图像采集的后续要求与标准；与现有技术相较，具有处理周期大幅缩短的显著进步，且在免疫荧光染色处理过程中，即便孵育处理超过7天，荧光也不会出现淬灭的现象，具有更高的稳定性。
Description
技术领域
本发明属于医学研究用人体牙髓组织透明化技术领域，涉及一种人类离体牙髓组织透明化方法，为获取非诊断、非治疗目的的离体牙髓组织观察样本。
背景技术
透明是物质透过光线的性质或情况，人体所包含的各组织内部因含有蛋白质、水、脂肪、胶原纤维等具有光折射率的组分，使得外源性光在其中发生散射，出现无法穿透的现象，从而呈现为不透明的状态。此外，人体部分组织内所含有的血红素、黑色素等物质，也会对光吸收，使得光无法穿透。基于光传播于人体组织内穿透的局限性，因此人体组织标本常用的石蜡切片厚度通常为3～5μm，冰冻切片厚度通常为6～10μm。上述厚度尺寸的组织切片有效增强光穿透的程度，进而使得现有技术中通过光学显微镜、共聚焦显微镜及3D成像技术等可以采集组织切片内部信息。但是上述技术通常需要花费大量时间、成本在于组织切片相关处理上，且切片过程中组织变形明显，组织重建难度较大。
为了简化组织切片的相关处理，研究者提出了组织透明化技术，组织透明化技术通过物理或化学技术，去除生物组织能能够吸光的物质，调整生物组织内部的折射率，进而让光线能穿透组织，此时配合共聚焦显微镜及光片显微镜等常规技术，即可实现生物组织或器官的整体成像。组织透明化技术的优势在于保留了生物组织内部细胞和组织结构的完整性、连续性，利用光片显微镜等可选择在几毫米到几厘米的深度皆可获得高质量的成像采集。
最早于1914年，组织透明化技术的相关概念就被首次提出，并被引入神经医学研究领域，主要应用于脑等中枢神经系统的研究。伴随科技发展，组织透明化技术逐渐广泛应用于软组织中，如血管网络的重建、肿瘤的诊断等。
人牙髓外围具有高度矿化且厚度高的牙釉质(厚度可高达2～2.5mm)，且牙髓本身又是充满血管丰富的软组织，这种特殊性导致透明化十分困难。在目前相关研究报道中，主要是采用改良Murray透明化技术及PEGASOS技术两种方法用于实验动物的牙齿透明化，未见针对人类离体牙齿透明化方法的相关研究报道。但是，在应用于人类离体牙齿时，上述改良Murray技术不能将牙齿变得完全透明，牙冠釉质阻挡了光线传播，因此不利于牙髓信息收集；而PEGASOS技术包含心脏灌注步骤(处死动物后将液体高压灌注于心脏内)，且需要长达2周脱钙时间，因此不适于人类离体牙齿且周期过于亢长。
此外，人类离体牙齿体积可达2×1.5×1cm，较实验动物牙齿更为庞大，因此更难实现快速透明化。然而，在医学研究中，人类离体牙髓作为易于获得的人体组织，对于探究牙齿相关疾病、牙齿再生具有重要科研意义，有利于推动科研成果向临床成果的转化。组织透明化技术可以在尽量保存原有空间结构的基础上，应用抗体标记牙髓内的多种抗原信号，使用显微镜进行采集，从而获得全面、多样、包含空间位置信息的牙髓血管、神经、免疫细胞等多种信息。因此亟需一种操作简单、周期短且可有效针对人类离体牙髓样本的牙齿透明化技术。
发明内容
本发明的目的是解决上述背景技术中的问题，提供一种人类离体牙髓组织透明化方法，该方法透明化程度显著，符合作为透明化牙髓观察样本进行图像采集的后续要求与标准；与现有技术相较，具有处理周期大幅缩短的显著进步，且在免疫荧光染色处理过程中，即便孵育处理超过7天，荧光也不会出现淬灭的现象，具有更高的稳定性。
为实现上述目的，本发明是采用由以下技术措施构成的技术方案来实现的。
一种人类离体牙髓组织透明化方法，包括以下步骤：
(1)解剖牙髓及固定处理
将人类离体牙齿直接浸泡于液氮中冷冻10～20分钟，使用牙科高速涡轮机及金刚砂车针将牙齿表面磨出凹痕直至靠近髓腔，然后使用牙科锤沿该凹痕敲开牙齿，取出其中牙髓；
将牙髓使用细胞固定液进行常规固定处理4～24h后，洗涤以去除细胞固定液，作为已固定的牙髓组织；
(2)脱水处理
将步骤(1)所得已固定的牙髓组织，采用组织脱水剂进行脱水处理，得到已脱水的牙髓组织；
所述组织脱水剂为甲醇或异丙醇；
(3)漂白处理
将步骤(2)所得已脱水的牙髓组织，采用过氧化氢甲醇溶液进行漂白处理，然后再次采用组织脱水剂进行复水处理，得到已漂白的牙髓组织；
(4)染色预处理
将甘油、Triton X-100和尿素添加入去离子水中混合均匀，配置得到抗原回收液；其中甘油、Triton X-100和尿素的质量百分比浓度分别为14～16％、5～10％和22～28％；
将驴血清、二甲基亚砜(DMSO)和Triton X-100添加入PBS缓冲液中混合均匀，配置得到封闭缓冲液；其中驴血清、二甲基亚砜和Triton X-100的质量百分比浓度分别为8～10％、9～11％和0.4～0.6％；
将步骤(3)所得已漂白的牙髓组织浸泡于抗原回收液中6～16小时，时间到达后，用添加有质量百分比浓度为2～3％胎牛血清(FBS)的PBS缓冲液洗涤至少两次，以去除抗原回收液，然后浸泡于封闭缓冲液中30～37℃温度条件下孵育处理30～60分钟，作为已染色预处理的牙髓组织；
(5)免疫荧光染色处理
将驴血清、二甲基亚砜(DMSO)和Triton X-100添加入PBS缓冲液中混合均匀，配置得到抗体稀释液；其中驴血清、二甲基亚砜和Triton X-100的质量百分比浓度分别为1.5～2％、9～11％和0.4～0.6％；
将驴血清和Triton X-100添加入PBS缓冲液中混合均匀，配置得到冲洗缓冲液；其中驴血清和Triton X-100的质量百分比浓度分别为1.5～2％和0.4～0.6％；
当所需添加的抗体为共轭了荧光染料的抗体时：将抗体按照1:(100～200)的体积比例在抗体稀释液中稀释为抗体工作液，步骤(4)所得已染色预处理的牙髓组织浸泡于抗体工作液中3～4℃温度条件下孵育处理至少1天；时间到达后，用冲洗缓冲液进行洗涤，作为已经染色处理的牙髓组织；
当所需添加的抗体为未共轭了荧光染料的抗体时：将抗体按照1:(100～200)的体积比例在抗体稀释液中稀释为抗体工作液，将荧光偶联剂按照1:(200～500)的体积比例在抗体稀释液中稀释为二抗工作液，步骤(4)所得已染色预处理的牙髓组织浸泡于抗体工作液中3～4℃温度条件下一抗孵育处理至少1天；时间到达后，用冲洗缓冲液进行洗涤，洗涤后浸泡于二抗工作液中3～4℃温度条件下二抗孵育处理至少0.5天；时间到达后，用冲洗缓冲液进行洗涤，作为已经染色处理的牙髓组织；
(6)透明化处理
将步骤(5)所得已经染色处理的牙髓组织，采用组织脱水剂进行脱水处理；然后用添加有质量百分比浓度为20～30％聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)的Eci缓冲液进行洗涤，洗涤后浸泡入Eci缓冲液中作为透明化处理后的牙髓组织观察样本。
本发明所得透明化处理后的牙髓组织观察样本，可直接用于转盘共聚焦显微镜和光片显微镜采集图像，或是适用于组织透明化后样本的常规处理方式。
在本文中，步骤(1)中所述细胞固定液为本技术领域中所常规使用的细胞固定液，例如公知常规的质量百分比浓度为4％的多聚甲醛溶液。
在其中一种技术方案中，步骤(1)中所述使用牙科高速涡轮机及金刚砂车针将牙齿表面磨出凹痕直至靠近髓腔，因人类离体牙齿的牙釉质厚度分布不均不具有统一标准，因此判断靠近髓腔的方式，经过经验总结，优选为磨出凹痕处能观察透出粉红色即可。
在其中一种技术方案中，步骤(1)中所述已固定的牙髓组织，因属于离体软组织且尺寸十分微小，在后续透明化处理过程中，因高度透明的缘故难以寻找辨别，因此优选将已固定的牙髓组织放置于光滑平面(例如培养皿或载玻片等)上，将质量浓度为0.5～1％的琼脂糖凝胶融化后逐滴滴于牙髓组织表面，直至完全包覆牙髓组织，静置等待琼脂糖凝胶冷却凝固，即将牙髓组织通过凝固的琼脂糖凝胶固定于光滑平面上，且不会影响到后续的处理。
需注意的是，上述技术方案中，所述琼脂糖凝胶的融化需要经过加热处理，该加热处理所使用温度以将琼脂糖凝胶融化的最低温度为宜，以保护样本抗原免受高温损伤。琼脂糖凝胶凝固后可形成光滑表面，以便于后续处理过程中转移样本、保存样本空间结构、避免显微镜观察时发生形变和位移，同时不影响光线穿透和透明化及成像效果。
在本文中，所述组织脱水剂为甲醇或异丙醇，是因为通过实验发现，常规所使用的组织脱水剂乙醇，其脱水效果对于牙髓非常差，经实验发现优选采用异丙醇具有综合更优的脱水效果，基于该实验事实，本发明限定组织脱水剂为甲醇或异丙醇，进一步优选为异丙醇。
在本文中，所述脱水处理和复水处理，皆为本技术领域的常规操作，本领域技术人员可根据公知常识或参考本领域现有技术进行操作。
为了更好地说明本发明，并提供一种可供参考的技术方案：所述脱水处理具体为：按照浓度梯度顺序，将牙髓组织依次浸泡在不同浓度的组织脱水剂中进行脱水处理，该浓度梯度顺序依次为质量百分比浓度28～32％、48～52％、78～82％及100％的组织脱水剂，且每次浸泡处理为10～60min，得到已脱水的牙髓组织。
为了更好地说明本发明，并提供一种可供参考的技术方案：所述复水处理具体为：按照浓度梯度顺序，将牙髓组织依次浸泡在不同浓度的组织脱水剂中进行复水处理，该浓度梯度顺序依次为质量百分比浓度100％、78～82％、48～52％及28～32％的组织脱水剂，且每次浸泡处理为10～60min。
在本文中，步骤(3)中所述采用过氧化氢甲醇溶液进行漂白处理，其中过氧化氢甲醇溶液的浓度为本技术领域中所常规使用的漂白剂浓度选择，例如采用体积百分比浓度为5％的过氧化氢甲醇溶液。
在本文中，步骤(3)中所述采用过氧化氢甲醇溶液进行漂白处理，其中漂白处理的时间通常为观察到牙髓组织完全白皙为止，漂白处理的时间通常为1～1.5小时。
在本文中，步骤(5)中所述抗体为本领域常规抗体试剂选择。
在本文中，步骤(5)中所述荧光偶联剂为本领域针对抗体二抗染色所常规使用的荧光偶联剂，例如cy3、cy5、Alexa Flour488等。
在本文中，所述洗涤所选用试剂和操作方式均为本技术领域的公知常识和常规操作，本领域技术人员可根据公知常识或参考本领域现有技术进行处理。
在其中一种技术方案中，未写明洗涤用试剂的洗涤均为使用PBS缓冲液进行，其洗涤方式为震荡冲洗至少3次，每次不少5分钟。
需说明的是，目前现有技术中未具有针对人类牙髓组织透明化的技术标准或共识，同时现有技术中针对实验用动物组织化透明化技术，在应用于牙髓组织时，都或多或少具有周期过长或是透明化程度过低的缺陷，甚至不能应用于牙髓组织。此外，本发明的发明人在长期实验及研究工作中发现，过长的透明化处理周期一方面不利于后续实验及研究的快速开展，需要耗费更多经费及时间；另一方面也会因为过长的透明化处理周期导致染色的荧光淬灭，从而使得透明化后的样本无法从中获得抗原信息，既浪费时间又大幅降低了效率。
而本发明的发明点在于，其中使用的各项试剂均对于牙髓组织及操作人员本身健康较为温和、安全的前提下，大幅缩短了牙髓组织透明化的所需周期，最低可在一周内即可完成整套透明化处理流程，且透明化效果显著。此外，经实验发现，在步骤(5)免疫荧光染色处理过程中，即便孵育处理超过7天，荧光也不会出现淬灭的现象，这极大有利于针对处理不同荧光需求或生理情况较为复杂的牙髓组织样本。
在本文中，所述人类离体牙齿，为本发明的发明人所在单位通过收集由医疗目的拔牙(例如智齿、牙科疾病所需拔牙等)所得离体牙齿。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明技术方案针对离体牙髓组织进行透明化，透明化程度显著，符合作为透明化牙髓观察样本进行图像采集的后续要求与标准；与现有技术相较，具有处理周期大幅缩短的显著进步，且在免疫荧光染色处理过程中，即便孵育处理超过7天，荧光也不会出现淬灭的现象，具有更高的稳定性。
(2)与现有技术尤其是常规组织透明化技术相较，本发明技术方案整体操作流程、试剂对于操作人员及操作环境更为温和、安全，适于作为相关实验标准处理方式进行推广。
(3)本发明技术方案，能够应用外源性的免疫荧光染色技术标记更多抗体，从而获得更多血管及血管周信息，有利于各项相关后续实验的开展，并推动相关研究进步。
附图说明
图1为本发明实施例1中前磨牙牙髓在透明化前后的照片。左图为前磨牙牙髓在透明化前的照片；右图中为前磨牙牙髓在透明化后的照片，因透明化程度高，照片无法清晰看到其轮廓，本图中用虚线对其轮廓进行了标识。
图2为本发明实施例1中牙髓组织观察样本进行显微镜图像采集后所得免疫荧光染色图。图中红色、绿色分别为α-SMA、CD34抗体信号(均为实验常用血管抗体)，左图标尺为1mm，右列局部扩大图标尺为100μm。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对发明权利要求的限制。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。虽然相信本领域普通技术人员充分了解以下术语，但仍陈述以下定义以有助于说明本发明所公开的主题。
一种人类离体牙髓组织透明化方法，包括以下步骤：
(1)解剖牙髓及固定处理
将人类离体牙齿直接浸泡于液氮中冷冻10～20分钟，使用牙科高速涡轮机及金刚砂车针将牙齿表面磨出凹痕直至靠近髓腔，然后使用牙科锤沿该凹痕敲开牙齿，取出其中牙髓；
将牙髓使用细胞固定液进行常规固定处理4～24h后，洗涤以去除细胞固定液，作为已固定的牙髓组织；
(2)脱水处理
将步骤(1)所得已固定的牙髓组织，采用组织脱水剂进行脱水处理，得到已脱水的牙髓组织；
所述组织脱水剂为甲醇或异丙醇；
(3)漂白处理
将步骤(2)所得已脱水的牙髓组织，采用过氧化氢甲醇溶液进行漂白处理，然后再次采用组织脱水剂进行复水处理，得到已漂白的牙髓组织；
(4)染色预处理
将甘油、Triton X-100和尿素添加入去离子水中混合均匀，配置得到抗原回收液；其中甘油、Triton X-100和尿素的质量百分比浓度分别为14～16％、5～10％和22～28％；
将驴血清、二甲基亚砜(DMSO)和Triton X-100添加入PBS缓冲液中混合均匀，配置得到封闭缓冲液；其中驴血清、二甲基亚砜和Triton X-100的质量百分比浓度分别为8～10％、9～11％和0.4～0.6％；
将步骤(3)所得已漂白的牙髓组织浸泡于抗原回收液中6～16小时，时间到达后，用添加有质量百分比浓度为2～3％胎牛血清(FBS)的PBS缓冲液洗涤至少两次，以去除抗原回收液，然后浸泡于封闭缓冲液中30～37℃温度条件下孵育处理30～60分钟，作为已染色预处理的牙髓组织；
(5)免疫荧光染色处理
将驴血清、二甲基亚砜(DMSO)和Triton X-100添加入PBS缓冲液中混合均匀，配置得到抗体稀释液；其中驴血清、二甲基亚砜和Triton X-100的质量百分比浓度分别为1.5～2％、9～11％和0.4～0.6％；
将驴血清和Triton X-100添加入PBS缓冲液中混合均匀，配置得到冲洗缓冲液；其中驴血清和Triton X-100的质量百分比浓度分别为1.5～2％和0.4～0.6％；
当所需添加的抗体为共轭了荧光染料的抗体时：将抗体按照1:(100～200)的体积比例在抗体稀释液中稀释为抗体工作液，步骤(4)所得已染色预处理的牙髓组织浸泡于抗体工作液中3～4℃温度条件下孵育处理至少1天；时间到达后，用冲洗缓冲液进行洗涤，作为已经染色处理的牙髓组织；
当所需添加的抗体为未共轭了荧光染料的抗体时：将抗体按照1:(100～200)的体积比例在抗体稀释液中稀释为抗体工作液，将荧光偶联剂按照1:(200～500)的体积比例在抗体稀释液中稀释为二抗工作液，步骤(4)所得已染色预处理的牙髓组织浸泡于抗体工作液中3～4℃温度条件下一抗孵育处理至少1天；时间到达后，用冲洗缓冲液进行洗涤，洗涤后浸泡于二抗工作液中3～4℃温度条件下二抗孵育处理至少0.5天；时间到达后，用冲洗缓冲液进行洗涤，作为已经染色处理的牙髓组织；
(6)透明化处理
将步骤(5)所得已经染色处理的牙髓组织，采用组织脱水剂进行脱水处理；然后用添加有质量百分比浓度为20～30％聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)的Eci缓冲液进行洗涤，洗涤后浸泡入Eci缓冲液中作为透明化处理后的牙髓组织观察样本。
本发明所得透明化处理后的牙髓组织观察样本，可直接用于转盘共聚焦显微镜和光片显微镜采集图像，或是适用于组织透明化后样本的常规处理方式。
在本文中，步骤(1)中所述细胞固定液为本技术领域中所常规使用的细胞固定液，在其中一种实施方式中，例如是采用公知常规的质量百分比浓度为4％的多聚甲醛溶液。
在其中一种实施方式中，步骤(1)中所述使用牙科高速涡轮机及金刚砂车针将牙齿表面磨出凹痕直至靠近髓腔，因人类离体牙齿的牙釉质厚度分布不均不具有统一标准，因此判断靠近髓腔的方式，经过经验总结，优选为磨出凹痕处能观察透出粉红色即可。需补充说明的是，步骤(1)中所述将人类离体牙齿直接浸泡于液氮中冷冻10～20分钟为必要步骤，若不冷冻或冷冻时间过短在敲开牙齿后无法直接获得完整或较为完整的牙髓，而冷冻时间过长则会对牙髓组织造成破坏。
在其中一种实施方式中，步骤(1)中所述已固定的牙髓组织，因属于离体软组织且尺寸十分微小，在后续透明化处理过程中，因高度透明的缘故难以寻找辨别，因此优选将已固定的牙髓组织放置于光滑平面(例如培养皿或载玻片等)上，将质量浓度为0.5～1％的琼脂糖凝胶融化后逐滴滴于牙髓组织表面，直至完全包覆牙髓组织，静置等待琼脂糖凝胶冷却凝固，即将牙髓组织通过凝固的琼脂糖凝胶固定于光滑平面上，且不会影响到后续的处理。
需注意的是，上述技术方案中，所述琼脂糖凝胶的融化需要经过加热处理，该加热处理所使用温度以将琼脂糖凝胶融化的最低温度为宜，以保护样本抗原免受高温损伤。琼脂糖凝胶凝固后可形成光滑表面，以便于后续处理过程中转移样本、保存样本空间结构、避免显微镜观察时发生形变和位移，同时不影响光线穿透和透明化及成像效果。
在本文中，所述组织脱水剂为甲醇或异丙醇，是因为通过实验发现，常规所使用的组织脱水剂乙醇，其脱水效果对于牙髓组织非常差，经实验发现优选采用异丙醇具有综合更优的脱水效果，基于该实验事实，本发明限定组织脱水剂为甲醇或异丙醇，在其中一种实施方式中，进一步优选为异丙醇。
在本文中，所述脱水处理和复水处理，皆为本技术领域的常规操作，本领域技术人员可根据公知常识或参考本领域现有技术进行操作。
为了更好地说明本发明，并提供一种可供参考的实施方式：所述脱水处理具体为：按照浓度梯度顺序，将牙髓组织依次浸泡在不同浓度的组织脱水剂中进行脱水处理，该浓度梯度顺序依次为质量百分比浓度28～32％、48～52％、78～82％及100％的组织脱水剂，且每次浸泡处理为10～60min，得到已脱水的牙髓组织。
为了更好地说明本发明，并提供一种可供参考的实施方式：所述复水处理具体为：按照浓度梯度顺序，将牙髓组织依次浸泡在不同浓度的组织脱水剂中进行复水处理，该浓度梯度顺序依次为质量百分比浓度100％、78～82％、48～52％及28～32％的组织脱水剂，且每次浸泡处理为10～60min。
在本文中，步骤(3)中所述采用过氧化氢甲醇溶液进行漂白处理，其中过氧化氢甲醇溶液的浓度为本技术领域中所常规使用的漂白剂浓度选择，在其中一种实施方式中，例如采用体积百分比浓度为5％的过氧化氢甲醇溶液。
在其中一种实施方式中，步骤(3)中所述采用过氧化氢甲醇溶液进行漂白处理，其中漂白处理的时间通常为观察到牙髓组织完全白皙为止，漂白处理的时间通常为1～1.5小时。
在其中一种实施方式中，步骤(4)中所述抗原回收液，其中所述甘油的质量百分比浓度为14～16％，例如甘油的质量百分比浓度为14％、15％、16％或它们之间的任何范围或点值；所述Triton X-100的质量百分比浓度为5～10％，例如Triton X-100的质量百分比浓度为5％、6％、7％、8％、9％、10％或它们之间的任何范围或点值；所述尿素的质量百分比浓度为22～28％，例如尿素的质量百分比浓度为22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％或它们之间的任何范围或点值。
在其中一种实施方式中，步骤(4)中所述封闭缓冲液，其中所述驴血清的质量百分比浓度为8～10％，例如驴血清的质量百分比浓度为8％、9％、10％或它们之间的任何范围或点值；所述二甲基亚砜的质量百分比浓度为9～11％，例如二甲基亚砜的质量百分比浓度为9％、10％、11％或它们之间的任何范围或点值；所述Triton X-100的质量百分比浓度为0.4～0.6％，例如Triton X-100的质量百分比浓度为0.4％、0.5％、0.6％或它们之间的任何范围或点值。
在其中一种实施方式中，步骤(4)中所述将步骤(3)所得已漂白的牙髓组织浸泡于抗原回收液中6～16小时，例如浸泡于抗原回收液中6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时或它们之间的任何范围或点值；时间到达后，用添加有质量百分比浓度为2～3％胎牛血清(FBS)的PBS缓冲液洗涤至少两次，以去除抗原回收液，然后浸泡于封闭缓冲液中30～37℃温度条件下孵育处理20～60分钟，作为已染色预处理的牙髓组织；其中例如浸泡于封闭缓冲液中30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃或它们之间的任何范围或点值的温度条件下；例如孵育处理20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟或它们之间的任何范围或点值。
在本文中，步骤(5)中所述抗体为本领域常规抗体试剂选择。
在其中一种实施方式中，步骤(5)中所述荧光偶联剂为本领域针对抗体二抗染色所常规使用的荧光偶联剂，例如cy3、cy5、Alexa Flour488其中任意一种。
在其中一种实施方式中，步骤(5)中所述抗体稀释液，其中所述驴血清的质量百分比浓度为1.5～2％，例如驴血清的质量百分比浓度为1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％或它们之间的任何范围或点值；所述二甲基亚砜的质量百分比浓度为9～11％，例如二甲基亚砜的质量百分比浓度为9％、10％、11％或它们之间的任何范围或点值；所述TritonX-100的质量百分比浓度为0.4～0.6％，例如Triton X-100的质量百分比浓度为0.4％、0.5％、0.6％或它们之间的任何范围或点值。
在其中一种实施方式中，步骤(5)中所述冲洗缓冲液，其中所述驴血清的质量百分比浓度为1.5～2％，例如驴血清的质量百分比浓度为1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％或它们之间的任何范围或点值；所述Triton X-100的质量百分比浓度为0.4～0.6％，例如Triton X-100的质量百分比浓度为0.4％、0.5％、0.6％或它们之间的任何范围或点值。
在其中一种实施方式中，步骤(5)中所述将抗体按照1:(100～200)的体积比例在抗体稀释液中稀释为抗体工作液，例如按照1：100、1：110、1：120、1：130、1：140、1：150、1：160、1：170、1：180、1：190、1：200或它们之间的任何范围或点值的体积比例。
在其中一种实施方式中，步骤(5)中所述将荧光偶联剂按照1:(200～500)的体积比例在抗体稀释液中稀释为二抗工作液，例如按照1：200、1：250、1：300、1：350、1：400、1：450、1：500或它们之间的任何范围或点值的体积比例。
在其中一种实施方式中，步骤(6)中所述用添加有质量百分比浓度为20～30％聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)的Eci缓冲液进行洗涤，例如是添加有质量百分比浓度为20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％或它们之间的任何范围或点值的聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)。
在本文中，所述洗涤所选用试剂和操作方式均为本技术领域的公知常识和常规操作，本领域技术人员可根据公知常识或参考本领域现有技术进行处理。
在其中一种实施方式中，未写明洗涤用试剂的洗涤均为使用PBS缓冲液进行，其洗涤方式为震荡冲洗至少3次，每次不少5分钟。
需说明的是，目前现有技术中未具有针对人类牙髓组织透明化的技术标准或共识，同时现有技术中针对实验用动物组织化透明化技术，在应用于牙髓组织时，都或多或少具有周期过长或是透明化程度过低的缺陷，甚至不能应用于牙髓组织。此外，本发明的发明人在长期实验及研究工作中发现，过长的透明化处理周期一方面不利于后续实验及研究的快速开展，需要耗费更多经费及时间；另一方面也会因为过长的透明化处理周期导致染色的荧光淬灭，从而使得透明化后的样本无法从中获得抗原信息，既浪费时间又大幅降低了效率。
而本发明的发明点在于，其中使用的各项试剂均对于牙髓组织及操作人员本身健康较为温和、安全的前提下，大幅缩短了牙髓组织透明化的所需周期，最低可在一周内即可完成整套透明化处理流程，且透明化效果显著。此外，经实验发现，在步骤(5)免疫荧光染色处理过程中，即便孵育处理超过7天，荧光也不会出现淬灭的现象，这极大有利于针对处理不同荧光需求或生理情况较为复杂的牙髓组织样本。
在本文中，所述人类离体牙齿，为本发明的发明人所在单位通过收集由医疗目的拔牙(例如智齿、牙科疾病所需拔牙等)所得离体牙齿。
以下将参考实施例对本申请进行进一步的详细解释。然而，本领域技术人员应理解，这些实施例仅为了说明的目的提供，而不是意图限制本申请。
实施例
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限定本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本申请不应解释为受限于所述的具体实施例。
原料
实施例1
本实施例针对人类离体牙髓组织透明化方法，包括以下步骤：
(1)解剖牙髓及固定处理
将人类离体牙齿(前磨牙)直接浸泡于液氮中冷冻15分钟，使用牙科高速涡轮机及金刚砂车针将牙齿表面磨出凹痕直至靠近髓腔(可通过凹痕处观察透出粉红色)，然后使用牙科锤沿该凹痕敲开牙齿，取出其中牙髓；
将牙髓使用质量百分比浓度为4％的多聚甲醛溶液进行固定处理4h后，洗涤以去除细胞固定液，作为已固定的牙髓组织；
然后将已固定的牙髓组织放置于培养皿上，将质量浓度为1％的琼脂糖凝胶融化后逐滴滴于牙髓组织表面，直至完全包覆牙髓组织，静置等待琼脂糖凝胶冷却凝固；
(2)脱水处理
将步骤(1)所得已固定的牙髓组织，采用组织脱水剂进行脱水处理，得到已脱水的牙髓组织；
所述组织脱水剂为异丙醇；
所述脱水处理具体为：按照浓度梯度顺序，将牙髓组织依次浸泡在不同浓度的组织脱水剂中进行脱水处理，该浓度梯度顺序依次为质量百分比浓度30％、50％、80％及100％的组织脱水剂，且每次浸泡处理为30min，得到已脱水的牙髓组织；
(3)漂白处理
将步骤(2)所得已脱水的牙髓组织，采用体积百分比浓度为5％的过氧化氢甲醇溶液进行漂白处理1小时，然后再次采用组织脱水剂进行复水处理，得到已漂白的牙髓组织；
所述复水处理具体为：按照浓度梯度顺序，将牙髓组织依次浸泡在不同浓度的组织脱水剂中进行复水处理，该浓度梯度顺序依次为质量百分比浓度100％、80％、50％及30％的组织脱水剂，且每次浸泡处理为30min；
(4)染色预处理
将甘油、Triton X-100和尿素添加入去离子水中混合均匀，配置得到抗原回收液；其中甘油、Triton X-100和尿素的质量百分比浓度分别为15％、7％和25％；
将驴血清、二甲基亚砜(DMSO)和Triton X-100添加入PBS缓冲液中混合均匀，配置得到封闭缓冲液；其中驴血清、二甲基亚砜和Triton X-100的质量百分比浓度分别为10％、10％和0.5％；
将步骤(3)所得已漂白的牙髓组织浸泡于抗原回收液中6小时，时间到达后，用添加有质量百分比浓度为3％胎牛血清(FBS)的PBS缓冲液洗涤两次，每次5分钟，以去除抗原回收液，然后浸泡于封闭缓冲液中37℃温度条件下孵育处理30分钟，作为已染色预处理的牙髓组织；
(5)免疫荧光染色处理
将驴血清、二甲基亚砜(DMSO)和Triton X-100添加入PBS缓冲液中混合均匀，配置得到抗体稀释液；其中驴血清、二甲基亚砜和Triton X-100的质量百分比浓度分别为2％、10％和0.5％；
将驴血清和Triton X-100添加入PBS缓冲液中混合均匀，配置得到冲洗缓冲液；其中驴血清和Triton X-100的质量百分比浓度分别为2％和0.5％；
当所需添加的抗体为共轭了荧光染料的抗体时：将抗体按照1:150的体积比例在抗体稀释液中稀释为抗体工作液，步骤(4)所得已染色预处理的牙髓组织浸泡于抗体工作液中4℃温度条件下孵育处理至少1天；时间到达后，用冲洗缓冲液进行洗涤，洗涤的具体方式为将孵育处理后的牙髓组织浸没于冲洗缓冲液进行晃动洗涤3小时，每15分钟更换一次冲洗缓冲液，洗涤完成后作为已经染色处理的牙髓组织；
当所需添加的抗体为未共轭了荧光染料的抗体时：将抗体按照1:150的体积比例在抗体稀释液中稀释为抗体工作液，将荧光偶联剂按照1:300的体积比例在抗体稀释液中稀释为二抗工作液，步骤(4)所得已染色预处理的牙髓组织浸泡于抗体工作液中4℃温度条件下一抗孵育处理至少1天；时间到达后，用冲洗缓冲液进行洗涤，洗涤后浸泡于二抗工作液中4℃温度条件下二抗孵育处理至少0.5天；时间到达后，用冲洗缓冲液进行洗涤，洗涤的具体方式为将孵育处理后的牙髓组织浸没于冲洗缓冲液进行晃动洗涤3小时，每15分钟更换一次冲洗缓冲液，洗涤完成后作为已经染色处理的牙髓组织；
(6)透明化处理
将步骤(5)所得已经染色处理的牙髓组织，采用组织脱水剂进行脱水处理；然后用添加有质量百分比浓度为25％聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)的Eci缓冲液进行洗涤两次，每次5分钟，洗涤后浸泡入Eci缓冲液中作为透明化处理后的牙髓组织观察样本。
本发明所得透明化处理后的牙髓组织观察样本，可直接用于转盘共聚焦显微镜和光片显微镜采集图像，或是适用于组织透明化后样本的常规处理方式。
Claims (8)
1.一种人类离体牙髓组织透明化方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)解剖牙髓及固定处理
将人类离体牙齿直接浸泡于液氮中冷冻10～20分钟，使用牙科高速涡轮机及金刚砂车针将牙齿表面磨出凹痕直至靠近髓腔，然后使用牙科锤沿该凹痕敲开牙齿，取出其中牙髓；
将牙髓使用细胞固定液进行常规固定处理4～24h后，洗涤以去除细胞固定液，作为已固定的牙髓组织；
(2)脱水处理
将步骤(1)所得已固定的牙髓组织，采用组织脱水剂进行脱水处理，得到已脱水的牙髓组织；
所述组织脱水剂为甲醇或异丙醇；
(3)漂白处理
将步骤(2)所得已脱水的牙髓组织，采用过氧化氢甲醇溶液进行漂白处理，然后再次采用组织脱水剂进行复水处理，得到已漂白的牙髓组织；
(4)染色预处理
将甘油、Triton X-100和尿素添加入去离子水中混合均匀，配置得到抗原回收液；其中甘油、Triton X-100和尿素的质量百分比浓度分别为14～16％、5～10％和22～28％；
将驴血清、二甲基亚砜和Triton X-100添加入PBS缓冲液中混合均匀，配置得到封闭缓冲液；其中驴血清、二甲基亚砜和Triton X-100的质量百分比浓度分别为8～10％、9～11％和0.4～0.6％；
将步骤(3)所得已漂白的牙髓组织浸泡于抗原回收液中6～16小时，时间到达后，用添加有质量百分比浓度为2～3％胎牛血清的PBS缓冲液洗涤至少两次，以去除抗原回收液，然后浸泡于封闭缓冲液中30～37℃温度条件下孵育处理30～60分钟，作为已染色预处理的牙髓组织；
(5)免疫荧光染色处理
将驴血清、二甲基亚砜和Triton X-100添加入PBS缓冲液中混合均匀，配置得到抗体稀释液；其中驴血清、二甲基亚砜和Triton X-100的质量百分比浓度分别为1.5～2％、9～11％和0.4～0.6％；
将驴血清和Triton X-100添加入PBS缓冲液中混合均匀，配置得到冲洗缓冲液；其中驴血清和Triton X-100的质量百分比浓度分别为1.5～2％和0.4～0.6％；
当所需添加的抗体为共轭了荧光染料的抗体时：将抗体按照1:(100～200)的体积比例在抗体稀释液中稀释为抗体工作液，步骤(4)所得已染色预处理的牙髓组织浸泡于抗体工作液中3～4℃温度条件下孵育处理至少1天；时间到达后，用冲洗缓冲液进行洗涤，作为已经染色处理的牙髓组织；
当所需添加的抗体为未共轭了荧光染料的抗体时：将抗体按照1:(100～200)的体积比例在抗体稀释液中稀释为抗体工作液，将荧光偶联剂按照1:(200～500)的体积比例在抗体稀释液中稀释为二抗工作液，步骤(4)所得已染色预处理的牙髓组织浸泡于抗体工作液中3～4℃温度条件下一抗孵育处理至少1天；时间到达后，用冲洗缓冲液进行洗涤，洗涤后浸泡于二抗工作液中3～4℃温度条件下二抗孵育处理至少0.5天；时间到达后，用冲洗缓冲液进行洗涤，作为已经染色处理的牙髓组织；
(6)透明化处理
将步骤(5)所得已经染色处理的牙髓组织，采用组织脱水剂进行脱水处理；然后用添加有质量百分比浓度为20～30％聚乙二醇双丙烯酸酯的Eci缓冲液进行洗涤，洗涤后浸泡入Eci缓冲液中作为透明化处理后的牙髓组织观察样本。
2.权利要求1所述人类离体牙髓组织透明化方法，其特征在于：步骤(1)中所述使用牙科高速涡轮机及金刚砂车针将牙齿表面磨出凹痕直至靠近髓腔，判断靠近髓腔的方式为磨出凹痕处能观察透出粉红色即可。
3.权利要求1所述人类离体牙髓组织透明化方法，其特征在于：步骤(1)中所述已固定的牙髓组织，还包括将已固定的牙髓组织放置于光滑平面上，将质量浓度为0.5～1％的琼脂糖凝胶融化后逐滴滴于牙髓组织表面，直至完全包覆牙髓组织，静置等待琼脂糖凝胶冷却凝固。
4.权利要求1所述人类离体牙髓组织透明化方法，其特征在于：所述脱水处理具体为：按照浓度梯度顺序，将牙髓组织依次浸泡在不同浓度的组织脱水剂中进行脱水处理，该浓度梯度顺序依次为质量百分比浓度28～32％、48～52％、78～82％及100％的组织脱水剂，且每次浸泡处理为10～60min。
5.权利要求1所述人类离体牙髓组织透明化方法，其特征在于：所述复水处理具体为：按照浓度梯度顺序，将牙髓组织依次浸泡在不同浓度的组织脱水剂中进行复水处理，该浓度梯度顺序依次为质量百分比浓度100％、78～82％、48～52％及28～32％的组织脱水剂，且每次浸泡处理为10～60min。
6.权利要求1所述人类离体牙髓组织透明化方法，其特征在于：步骤(1)中所述细胞固定液为质量百分比浓度为4％的多聚甲醛溶液。
7.权利要求1所述人类离体牙髓组织透明化方法，其特征在于：步骤(3)中所述采用过氧化氢甲醇溶液进行漂白处理，是采用体积百分比浓度为5％的过氧化氢甲醇溶液。
8.权利要求1所述人类离体牙髓组织透明化方法，其特征在于：步骤(5)中所述荧光偶联剂为cy3、cy5、Alexa Flour488其中任意一种。
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Citations (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1369699A (zh) * | 2002-03-06 | 2002-09-18 | 中国科学院水生生物研究所 | 齿鲸类牙齿切片染色的方法 |
| TW571100B (en) * | 1997-08-20 | 2004-01-11 | Univ Miami | A high quality, continuous throughput, tissue fixation-dehydration-fat removal-impregnation method |
| AU2006259262A1 (en) * | 2005-06-17 | 2006-12-28 | Dynamis Therapeutics, Inc. | Treatment of inflammatory conditions |
| CN1961816A (zh) * | 2006-11-24 | 2007-05-16 | 山东建筑大学 | 胎儿透明标本的制作方法 |
| CN103492852A (zh) * | 2011-04-28 | 2014-01-01 | 独立行政法人理化学研究所 | 生物材料的透明化方法、及其利用 |
| CN105307670A (zh) * | 2013-06-26 | 2016-02-03 | 埃克西金炎症有限公司 | Jnk信号转导途径的细胞渗透肽抑制剂用于治疗多种疾病的新用途 |
| CN105556309A (zh) * | 2013-09-20 | 2016-05-04 | 加州理工学院 | 用于完整全组织的表型分析的方法 |
| KR20180062411A (ko) * | 2016-11-30 | 2018-06-08 | 단국대학교 산학협력단 | 생물학적 샘플의 3차원 영상 획득방법 |
| CN109406768A (zh) * | 2018-11-06 | 2019-03-01 | 扬州大学 | 一种观察微小组织内细胞立体分布及统计细胞数目的方法 |
| CN109845721A (zh) * | 2019-04-01 | 2019-06-07 | 中国海洋大学 | 一种头足类透明标本的制作方法 |
| CN111492223A (zh) * | 2017-12-29 | 2020-08-04 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 组织样品制备系统 |
| JP2021177146A (ja) * | 2020-05-08 | 2021-11-11 | 学校法人慶應義塾 | 被検体の透明化方法および透明化された被検体の製造方法 |
| CN114848911A (zh) * | 2022-04-14 | 2022-08-05 | 南方医科大学南方医院 | 一种脱细胞牙髓干细胞膜片及其制备方法和应用 |
| CN115073939A (zh) * | 2022-07-21 | 2022-09-20 | 四川大学 | 一种氧化锆陶瓷染色液及制备方法与应用 |
| CN116148008A (zh) * | 2023-01-10 | 2023-05-23 | 武汉沃亿生物有限公司 | 一种基于iDISCO透明化抗体染色生物组织样本三维成像方法 |
| CN116183328A (zh) * | 2023-01-09 | 2023-05-30 | 李迪迪 | 一种生物组织透明化方法及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9642687B2 (en) * | 2010-06-15 | 2017-05-09 | The Procter & Gamble Company | Methods for whitening teeth |
-
2023
- 2023-08-16 CN CN202311030360.1A patent/CN117147251B/zh active Active
Patent Citations (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW571100B (en) * | 1997-08-20 | 2004-01-11 | Univ Miami | A high quality, continuous throughput, tissue fixation-dehydration-fat removal-impregnation method |
| CN1369699A (zh) * | 2002-03-06 | 2002-09-18 | 中国科学院水生生物研究所 | 齿鲸类牙齿切片染色的方法 |
| AU2006259262A1 (en) * | 2005-06-17 | 2006-12-28 | Dynamis Therapeutics, Inc. | Treatment of inflammatory conditions |
| CN1961816A (zh) * | 2006-11-24 | 2007-05-16 | 山东建筑大学 | 胎儿透明标本的制作方法 |
| CN103492852A (zh) * | 2011-04-28 | 2014-01-01 | 独立行政法人理化学研究所 | 生物材料的透明化方法、及其利用 |
| CN105307670A (zh) * | 2013-06-26 | 2016-02-03 | 埃克西金炎症有限公司 | Jnk信号转导途径的细胞渗透肽抑制剂用于治疗多种疾病的新用途 |
| CN105556309A (zh) * | 2013-09-20 | 2016-05-04 | 加州理工学院 | 用于完整全组织的表型分析的方法 |
| KR20180062411A (ko) * | 2016-11-30 | 2018-06-08 | 단국대학교 산학협력단 | 생물학적 샘플의 3차원 영상 획득방법 |
| CN111492223A (zh) * | 2017-12-29 | 2020-08-04 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 组织样品制备系统 |
| CN109406768A (zh) * | 2018-11-06 | 2019-03-01 | 扬州大学 | 一种观察微小组织内细胞立体分布及统计细胞数目的方法 |
| CN109845721A (zh) * | 2019-04-01 | 2019-06-07 | 中国海洋大学 | 一种头足类透明标本的制作方法 |
| JP2021177146A (ja) * | 2020-05-08 | 2021-11-11 | 学校法人慶應義塾 | 被検体の透明化方法および透明化された被検体の製造方法 |
| CN114848911A (zh) * | 2022-04-14 | 2022-08-05 | 南方医科大学南方医院 | 一种脱细胞牙髓干细胞膜片及其制备方法和应用 |
| CN115073939A (zh) * | 2022-07-21 | 2022-09-20 | 四川大学 | 一种氧化锆陶瓷染色液及制备方法与应用 |
| CN116183328A (zh) * | 2023-01-09 | 2023-05-30 | 李迪迪 | 一种生物组织透明化方法及其应用 |
| CN116148008A (zh) * | 2023-01-10 | 2023-05-23 | 武汉沃亿生物有限公司 | 一种基于iDISCO透明化抗体染色生物组织样本三维成像方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117147251A (zh) | 2023-12-01 |
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