CN114848911A - 一种脱细胞牙髓干细胞膜片及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脱细胞牙髓干细胞膜片及其制备方法和应用。所述制备方法包含以下步骤：S1.利用膜片培养基培养牙髓干细胞12～16天，得到牙髓干细胞膜片；S2.将牙髓干细胞膜片置于细胞裂解液中，36～38℃下处理5～30min；然后利用脱氧核糖核酸酶处理后即得脱细胞牙髓干细胞膜片；所述膜片培养基为含有胎牛血清和抗坏血酸的α‑MEM培养基。本发明所提供的脱细胞牙髓干细胞膜片作为治疗脊髓损伤的支架材料，具有良好的治疗效果，不仅可以促进损伤脊髓的愈合以及神经的再生，还能恢复机体的运动功能；同时具有制备简单、可塑性强、细胞外基质丰富、无需人工合成材料搭载等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料领域，具体地，涉及一种脱细胞牙髓干细胞膜片及其制备方法和应用。
背景技术
脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种以脊髓组织坏死、神经细胞退变和凋亡、神经信号回路中断为特征的严重中枢神经系统破坏性疾病，患者会发生永久性的机体运动和感觉功能障碍。全球脊髓损伤总病例数高达270万，全世界每年诊断出超过70万例新的SCI病例，且发病率并无下降趋势。脊髓损伤的治疗方法以手术为主，药物、康复理疗等为辅，由于成人中枢神经系统神经元的先天再生能力差，现今治疗手段无法逆转这种永久性残疾，这需要承受极端的身体折磨和对患者及其家庭的沉重精神负担。
为了解决现有治疗手段对损伤神经的修复及再生作用有限这一难题，以脱细胞胞外基质(decellularized extracellular matrix,dECM)为基础的支架材料已成为脊髓损伤后促进修复再生的一种潜在治疗方案。脱细胞胞外基质是通过脱细胞方法去除细胞或组织中的细胞成分后，仅保留细胞外基质，以此来获得脱细胞生物支架。ECM对细胞迁移、增殖、分化等有直接的调控作用，ECM中的多种生物因子可促进细胞的募集和迁移。脱细胞胞外基质材料主要分为两种：1)组织或器官来源的dECM材料；2)细胞来源的dECM材料。
目前，已有研究利用包括脊髓组织(DOI:10.1016/j.biomaterials.2020.120596)、脑组织(DOI:10.1016/j.actbio.2019.11.012)、外周神经组织(DOI: 10.4103/1673-5374.310696)来源的dECM材料治疗脊髓损伤，但组织或器官来源的dECM存在来源缺乏、潜在病原性、制备困难等问题，使之难以大规模应用。
而细胞来源的dECM则有来源充足、制备简单、制备过程无菌等优势，可以一定程度上解决以上组织或器官来源的dECM存在的问题，但是现有技术中利用细胞来源dECM来治疗脊髓损伤需要额外使用化学材料搭载dECM作为复合支架(DOI:10.1002/jbm.a.35466)，尚无单纯使用细胞来源dECM制作用于修复脊髓损伤的支架。
发明内容
为了克服现有技术中没有单纯使用细胞来源脱细胞胞外基质制作支架用于修复脊髓损伤的问题，本发明提供一种脱细胞牙髓干细胞膜片及其制备方法和应用。
本发明的第一个目的是提供一种脱细胞牙髓干细胞膜片的制备方法。
本发明的第二个目的是提供上述制备方法制得的脱细胞牙髓干细胞膜片。
本发明的第三个目的是提供上述脱细胞牙髓干细胞膜片在作为治疗脊髓损伤的支架材料或在制备脊髓移植物中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明提供了一种脱细胞牙髓干细胞膜片的制备方法，所述脱细胞牙髓干细胞膜片即为牙髓干细胞脱细胞胞外基质，本发明的脱细胞胞外基质来源于间充质的原代牙髓干细胞。
细胞来源的脱细胞胞外基质具有来源充足、制备简单、制备过程无菌等优势，其中牙髓干细胞因其来源充足、易于扩增、能形成丰富的细胞外基质及分泌多种神经营养因子等特性，可作为治疗脊髓损伤的种子细胞，也为制备细胞来源的脱细胞胞外基质支架提供基础。
一种脱细胞牙髓干细胞膜片的制备方法，包含以下步骤：
S1.利用膜片培养基培养牙髓干细胞12～16天，得到牙髓干细胞膜片；
S2.将牙髓干细胞膜片置于细胞裂解液中，36～38℃下处理5～30min；然后利用脱氧核糖核酸酶处理后即得脱细胞牙髓干细胞膜片；
步骤S1所述膜片培养基为含有胎牛血清(FBS)和抗坏血酸的α-MEM培养基；
步骤S1所述牙髓干细胞为原代牙髓干细胞培养的第2～4代牙髓干细胞；
步骤S2所述细胞裂解液为含有体积分数为0.5％～1％TritonX-100和18～22 mMNH4OH的磷酸盐(PBS)缓冲液。
优选地，步骤S1中利用膜片培养基培养牙髓干细胞14天，得到牙髓干细胞膜片。
优选地，步骤S1所述牙髓干细胞为原代牙髓干细胞培养的第3代牙髓干细胞。
优选地，步骤S1具体步骤为：将牙髓干细胞先经过完全培养基培养至细胞密度为80％～90％，然后换用膜片培养基培养；所述完全培养基为含有胎牛血清 (FBS)的α-MEM培养基。
优选地，步骤S1所述膜片培养基为含有体积分数8％～12％胎牛血清(FBS) 和终浓度为48～52μg/mL的抗坏血酸的α-MEM培养基。
优选地，步骤S1所述膜片培养基为含有体积分数10％胎牛血清(FBS)和终浓度为50μg/mL的抗坏血酸的α-MEM培养基。
进一步优选地，步骤S1所述膜片培养基还含有体积分数为0.8～1.2％的青链霉素。
更优选地，步骤S1所述膜片培养基还含有体积分数为1％的青链霉素。
优选地，所述完全培养基为含有体积分数8％～12％胎牛血清(FBS)的α-MEM培养基。
优选地，所述完全培养基为含有体积分数10％胎牛血清(FBS)的α-MEM 培养基。
优选地，所述完全培养基还含有终浓度为98～102IU的青霉素和终浓度为 98～102μg/mL链霉素。
更优选地，所述完全培养基还含有终浓度为100IU的青霉素及终浓度为100 μg/mL的链霉素。
优选地，所述细胞裂解液为含有体积分数0.5％～1％TritonX-100和20mM 的NH4OH的磷酸盐(PBS)缓冲液。
更优选地，所述细胞裂解液为含有体积分数1％TritonX-100和20mM的 NH4OH的磷酸盐(PBS)缓冲液。
优选地，步骤S2中将膜片置于细胞裂解液中，37℃下处理5～30min。
优选地，步骤S2中将膜片置于细胞裂解液中，37℃下处理5min。
优选地，步骤S2所述脱氧核糖核酸酶处理具体将细胞裂解液处理后的牙髓干细胞膜片置于脱氧核糖核酸酶中，36℃～38℃反应55min～65min。
优选地，步骤S2所述脱氧核糖核酸酶处理具体将细胞裂解液处理后的牙髓干细胞膜片置于脱氧核糖核酸酶中，37℃反应60min。
优选地，所述脱氧核糖核酸酶的浓度为90U/mL～110U/mL。
更优选地，所述脱氧核糖核酸酶的浓度为100U/mL。
利用所述制备方法制得的脱细胞牙髓干细胞膜片也在本发明的保护范围之内。
所述脱细胞牙髓干细胞膜片在作为治疗脊髓损伤的支架材料或在制备脊髓移植物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所提供的脱细胞牙髓干细胞膜片作为治疗脊髓损伤的支架材料，具有良好的治疗效果，不仅可以促进损伤脊髓的愈合以及神经的再生，还能恢复机体的运动功能。具有制备简单、可塑性强、细胞外基质丰富、无需人工合成材料搭载等优点。
附图说明
图1为原代hDPSCs的培养及标记物鉴定结果；a为本发明采用的原代 hDPSCs培养图(100×)；b为流式细胞仪检测hDPSCs表面分子标记CD29、CD34、 CD90、CD44、CD45及CD105的表达情况。
图2为hDPSCs的单克隆鉴定结果；a为单个hDPSC(100×)；b为hDPSCs 集落(×40)。
图3为hDPSCs的分化鉴定结果；a为1％茜素红S染色结果(100×)；b为油红O染色结果(100×)；c为神经诱导14天后的hDPSCs(40×)；d～e为神经诱导的hDPSCs中GAP43、β3-TUBLIN的表达量变化，*表示p＜0.05。
图4为本发明牙髓干细胞膜片经过脱细胞处理前后的直观图及H&E染色图； a为牙髓干细胞膜片的直观图，可见牙髓干细胞膜片呈典型的乳白色半透明样的膜片结构；b～d为0.5％Triton X-100分别处理5min、10min、30min下hDPSCdECM 的直观图；e～g为1％Triton X-100分别处理5min、10min、30min下hDPSCdECM 的直观图；h为牙髓干细胞膜片的H&E染色图；i～k为0.5％Triton X-100分别处理5min、10min、30min下hDPSCdECM的H&E染色图；l～n为1％Triton X-100 分别处理5min、10min、30min下hDPSCdECM的H&E染色图。
图5为hDPSCdECM的DNA含量检测及生物安全性检测的结果；a为0.5％Triton X-100、1％Triton X-100分别处理5min、10min、30min下hDPSCdECM 的DNA含量检测结果；b为0.5％Triton X-100、1％Triton X-100分别处理5min、 10min、30min下的hDPSCdECM的浸提液对C17.2神经干细胞的毒性检测结果。
图6为hDPSCdECM的扫描电镜分析结果；a为牙髓干细胞膜片的整体电镜图，虚线指示单个hDPSC；b～d为0.5％Triton X-100分别处理5min、10min、 30min下hDPSCdECM的整体电镜图；e～g为1％Triton X-100分别处理5min、 10min、30min下hDPSCdECM的整体电镜图；h为牙髓干细胞膜片的局部电镜图；i～k为0.5％Triton X-100分别处理5min、10min、30min下hDPSCdECM的局部电镜图；l～n为1％Triton X-100分别处理5min、10min、30min下hDPSCdECM 的局部电镜图；箭头指示胶原纤维；a～g、h为放大1000倍的电镜图；i～n为放大5000倍的电镜图。
图7为hDPSCdECM的I型胶原免疫荧光染色结果；a为牙髓干细胞膜片的荧光图；b～d为0.5％Triton X-100分别处理5min、10min、30min下hDPSCdECM 的荧光图；e～g为1％Triton X-100分别处理5min、10min、30min下hDPSCdECM 的荧光图；h为DAPI的平均荧光强度；i为I型胶原的平均荧光强度。
图8为大鼠T10脊髓左侧半横断损伤模型的构建及治疗的过程；a为暴露大鼠T10段脊髓；b为大鼠T10脊髓呈现左侧半横断损伤；c～d为在大鼠T10脊髓植入hDPSCdECM；e为用凝胶海绵覆盖术区的hDPSCdECM；f为用牙科玻璃离子水门汀覆盖术区hDPSCdECM。
图9为hDPSCdECM治疗大鼠脊髓损伤7天及28天的H&E染色图；a为治疗大鼠脊髓损伤7天的H&E染色图；b为治疗大鼠脊髓损伤28天的H&E染色图；虚线指示脊髓组织的缺损面积；箭头指示神经细胞；c为移植第7天脊髓组织横截面空洞面积柱状图；d为移植第28天脊髓组织横截面空洞面积柱状图。
图10为hDPSCdECM治疗大鼠脊髓损伤28天时神经元轴突标记物NF-200 的荧光染色结果；虚线指示脊髓组织的缺损边界。
图11为hDPSCdECM治疗大鼠脊髓损伤28天时大鼠的足迹分析结果；上方足迹为大鼠的健侧足迹，下方足迹为大鼠的患侧足迹。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
α-MEM培养基：Gibco，C12571500BT；青链霉素：Gibco，15140122； EDTA抗原修复液(1×)：索莱宝，C1033；组织自发荧光淬灭剂：赛维尔，G1221。
实施例1牙髓干细胞的分离、培养与鉴定
一、实验方法
1、牙髓间充质干细胞的分离与培养
(1)收集因正畸或阻生原因拔除的成人(18～24岁)健康正畸牙或第三磨牙，用高速涡轮牙科手机将牙体颈部磨出较深的一条坑道，且坑道不能太深，以防止导致牙髓组织暴露而造成污染。在生物安全柜中，使用含有2v/v％青链霉素青链霉素的PSB缓冲液冲洗牙齿，洗干净牙齿上的血液及软组织。
沿牙体颈部深坑处将牙齿劈开，用拔髓针或眼科镊取出牙髓组织，并剪除根尖1/3处的根髓组织，将牙髓组织放置于含有2v/v％青链霉素的PBS缓冲液中，用枪头轻轻吹打，漂洗三次。
漂洗完成后，将牙髓组织置于α-MEM培养基中，并用眼科剪将牙髓组织剪成约1mm3大小的组织块，离心800rpm，3min后小心地吸去上清，加入3g/L 的I型胶原酶，完全覆盖住剪碎的牙髓组织后，放置于37℃培养箱消化30min。
配制完全培养基：以α-MEM培养基为基础培养基，制备含有10％胎牛血清 (v/v％)、100IU青霉素及100μg/mL链霉素的α-MEM培养基，即完全培养基。
向消化的牙髓组织加入完全培养基终止消化。800rpm离心3min后，小心吸去上清，并加入100～200μL完全培养基，轻轻吹打培养基以重悬牙髓组织块。
(2)将牙髓组织块接种于25cm2细胞培养瓶中，接种后尽量将牙髓组织块周围的培养基吸尽。将培养瓶倒置放置于5％CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中， 4h后翻转细胞培养瓶，加入4mL的完全培养基，继续培养。
每隔2～3天更换一次完全培养基，并于倒置显微镜下观察组织块的贴壁情况以及细胞爬出的情况。
(3)当培养瓶中来自牙髓组织块的牙髓干细胞(hDPSCs)增殖至汇合度达 80％时，即可进行传代培养。
吸尽细胞培养瓶中原有的培养基，用PBS缓冲液轻轻漂洗hDPSCs2～3次。加入0.5mL含有EDTA的胰蛋白酶(体积分数0.025％胰蛋白酶、体积分数0.01％ EDTA的磷酸盐缓冲生理盐水)进行消化，并于倒置显微镜下观察，当hDPSCs 收缩变圆时，立即加入3mL的完全培养基终止消化。反复吹打hDPSCs的生长面直至细胞脱落，收集细胞悬液。800rpm离心3min，弃上清，加入完全培养基，重悬hDPSCs后接种于新的培养瓶中，将hDPSCs均匀铺于培养面，置于37℃、 5％CO2培养箱进行常规培养。
每2～3d更换一次完全培养基。直至培养至第三代牙髓干细胞。
2、牙髓间充质干细胞的鉴定
(1)标记物鉴定
取第三代处于对数生长期、生长状态良好的hDPSCs，经胰蛋白酶消化，离心后收集hDPSCs，调节细胞密度至1×106个/mL，重悬置于预冷的PBS中。以小鼠抗人PE标记的CD29、CD34、CD90抗体及小鼠抗人FITC标记的CD44、 CD45、CD105抗体(如表1所示)，置于冰上避光孵育1h后，用预冷的PBS 清洗细胞2～3次，用流式细胞仪检测。
表1流式细胞检测所用抗体的信息
(2)单克隆鉴定
取第三代生长状态良好的hDPSCs，以1×102个/皿的细胞密度接种于细胞培养皿中，用完全培养基进行培养；于37℃、5％CO2培养箱中培养，每2～3天更换一次完全培养基，连续培养14天。
弃除原培养基，用PBS漂洗hDPSCs2次。用4％多聚甲醛固定hDPSCs15 min。加入结晶紫，染色30min，用PBS洗去多余结晶紫，于倒置显微镜下观察单克隆的形成情况，以≥50个细胞记为一个克隆。
(3)成骨分化鉴定
取第三代生长状态良好的hDPSCs，以2×105个/孔的细胞密度接种于6孔细胞板中，2～3天更换一次完全培养基。
配制成骨分化诱导培养基：以DMEM培养基为基础培养基，制备含有10％胎牛血清(v/v％)、1％青链霉素(v/v％)、终浓度为100nmol/L的地塞米松、终浓度为50μg/mL的抗坏血酸和终浓度为1mmol/L的β-甘油磷酸盐钠的DMEM 培养基，即成骨分化诱导培养基。
待hDPSCs生长密度达60％～70％时，将完全培养基更换为成骨分化诱导培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每2～3天更换一次成骨分化诱导培养基。
诱导hDPSCs成骨分化14天后，弃除细胞板中原有的培养基，用PBS漂洗 hDPSCs2～3次，4％多聚甲醛固定hDPSCs15 min。每孔加入1wt％茜素红S染色液，室温染色30min。去除茜素红S染色液，用PBS缓冲液漂洗hDPSCs3次，去除多余的染色液，于倒置显微镜下观察矿化结节的形成情况。
(4)成脂分化鉴定
取第三代生长状态良好的hDPSCs，以2×105个/孔的细胞密度接种于6孔板中，2～3天更换一次完全培养基。
配制成脂诱导培养基：以DMEM培养基为基础培养基，制备含有10％胎牛血清(v/v％)、1％青链霉素(v/v％)、终浓度为0.5mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、终浓度为1μM的地塞米松、终浓度为10μg/mL的胰岛素和终浓度为200μM 的吲哚美辛的DMEM培养基，即成脂诱导培养基。
待hDPSCs生长密度达60％～70％时，将完全培养基更换为成脂诱导培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每2～3天更换一次成脂诱导培养基。
诱导hDPSCs成脂分化21天后，弃除细胞板中原有的培养基，用PBS漂洗 hDPSCs2～3次，4％多聚甲醛室温固定hDPSCs15 min。每孔加入1mL的油红O 染色液，染色15min。去除油红O染色液，PBS缓冲液漂洗3次，再用60％异丙醇(v/v％)震荡去除残余的染色液，于倒置显微镜下观察脂滴的形成情况。
(5)神经分化鉴定
取第三代生长状态良好的hDPSCs，以2×105个/孔的细胞密度接种于6孔板中，2～3天更换一次完全培养基。
配制神经分化诱导培养基：以α-MEM培养基为基础培养基，制备含有10％胎牛血清(v/v％)、1％青链霉素(v/v％)、终浓度为20ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、终浓度为20ng/mL的表皮细胞生长因子(EGF)的α-MEM 培养基，即神经分化诱导培养基。
待hDPSCs生长密度达60％～70％时，将完全培养基更换为神经分化诱导培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每2～3天更换一次神经诱导培养基，诱导hDPSCs神经分化14天。
以只用完全培养基培养、不经神经分化诱导的hDPSCs作为对照组，分别于诱导hDPSCs神经分化的3、7、14天，使用EZ-press RNA Purification Kit试剂盒提取神经分化诱导的hDPSCs(即neural diff)与对照组hDPSCs(即control) 的RNA，具体步骤参照试剂盒说明书。
将RNA逆转录为cDNA，利用qPCR检测hDPSCs中神经分化标志物GAP43、β3-TUBLIN的表达量。所用检测引物的序列如下：
GAP43-F：5’-GGCCGCAACCAAAATTCAGG-3’；
GAP43-R：5’-CGGCAGTAGTGGTGCCTTC-3’；
β3-TUBLIN-F：5’-GGCCTCTTCTCACAAGTACG-3’；
β3-TUBLIN-R：5’-CCACTCTGACCAAAGATGAAA-3’；
GADPH-F：5’-CTGGGCTACACTGAGCACC-3’；
GADPH-R：5’-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’。
qPCR反应体系为：2×qPCR Mix，5μL；cDNA，2μL；正向引物(10μM)， 0.2μL；反向引物(10μM)，0.2μL；ddH2O，补足至10μL。
qPCR反应程序为：95℃，5min；95℃，10s，60℃，30s，40个循环。
二、实验结果
(1)原代hDPSCs的培养及标记物鉴定结果如图1所示。
如图1中的a所示，本发明分离的牙髓组织块经培养10～14天后，可见部分组织块有细胞爬出，细胞形态呈现长梭形或成纤维细胞样；如图1中的b所示，细胞对CD29(99.88％)、CD44(99.94％)、CD90(99.86％)和CD105(98.69％) 呈阳性，对CD34(0.55％)和CD45(0.29％)呈阴性；表明本发明所分离培养的细胞不仅呈现牙髓干细胞的典型形态，而且细胞中的间充质干细胞的表面分子标记物高表达、造血干细胞表面分子标记物低表达，说明本发明所分离培养的是来源于间充质的牙髓干细胞。
(2)hDPSCs的单克隆鉴定结果如图2所示。
如图2中的a、b所示，单个牙髓干细胞培养14天后，可克隆形成细胞集落。说明本发明分离培养的牙髓干细胞具有良好的增殖能力。
(3)hDPSCs的分化鉴定结果如图3所示。
如图3中的a所示，诱导人牙髓干细胞成骨分化14天后，可见细胞中有大量矿化结节的形成；
如图3中的b所示，诱导人牙髓干细胞成脂分化21天后，可见部分细胞的胞质内出现脂滴；
如图3中的c所示，诱导人牙髓干细胞神经分化14天后，可见细胞出现突触样结构；如图3中的d～e所示，与对照组相比，神经分化诱导的人牙髓干细胞GAP43、β3-TUBLIN的表达量均有所升高。
分化鉴定的结果说明：本发明分离培养的牙髓干细胞具有成骨分化、成脂分化、神经分化的能力。
综上可知，本发明成功分离到来源于间充质的原代牙髓干细胞，该牙髓干细胞具有增殖生长、多向分化的能力。
实施例2脱细胞牙髓干细胞膜片的制备
一、实验方法
1、牙髓干细胞膜片的制备
(1)将实施例1所得第三代牙髓干细胞以2×105个/孔的密度接种于6孔板，用完全培养基培养3天，用完全培养基培养3天，至细胞密度到达80％～90％。
(2)成膜诱导
配制膜片培养基：以α-MEM培养基为基础培养基，制备含有10％FBS(v/v％)、 1％青链霉素(v/v％)和终浓度为50μg/mL的抗坏血酸的α-MEM培养基，即膜片培养基。
待hDPSCs培养3天后，细胞密度为80％～90％，将完全培养基更换为膜片培养基，利用膜片培养基连续培养14天，每2天更换一次膜片培养基。
(3)培养14天后，6孔细胞板中有肉眼可见的乳白色半透明样的膜片，用细胞刮刀将膜片从6孔板上刮下，用PBS清洗3遍，即得到牙髓干细胞膜片。
2、脱细胞处理
(1)配制不同浓度的细胞裂解液：
低浓度细胞裂解液：含0.5％TritonX-100(v/v％)和20mM NH4OH的PBS 溶液。
高浓度细胞裂解液：含1％TritonX-100(v/v％)和20mM NH4OH的PBS 溶液。
(2)向单片的牙髓干细胞膜片加入1mL的PBS、低浓度细胞裂解液或高浓度细胞裂解液，37℃分别处理5min、10min或30min。以加入1mL PBS处理的牙髓干细胞膜片作为对照组，记为control。
(3)将经过(2)处理的牙髓干细胞膜片分别用PBS清洗3遍，并加入1mL 浓度为100U/mL的脱氧核糖核酸酶，37℃处理1h；再用PBS清洗3遍，即得到脱细胞牙髓干细胞膜片，即hDPSCdECM。脱细胞牙髓干细胞膜片置于PBS， 4℃可保存30天。
3、脱细胞牙髓干细胞膜片的鉴定
(1)大体观察及组织学观察
取材和固定：取本实施例步骤2制得的牙髓干细胞膜片或脱细胞牙髓干细胞膜片，卷成团，用擦镜纸包裹好放于包埋盒内，放入75％乙醇中固定。
包埋：固定后，将包埋盒内标本进行流水冲洗过夜，然后依次于70％乙醇浸泡1h、80％乙醇浸泡30min、85％乙醇浸泡30min、90％乙醇浸泡30min、95％乙醇浸泡30min、无水乙醇浸泡两次(30min/次)、二甲苯浸泡两次(15min/次)，最后浸泡于65℃石蜡溶液中4h，即得到石蜡组织块。所述百分比均为体积百分比。
切片：将完成包埋的石蜡组织块进行切片，厚度为6μm。
苏木精-伊红(H&E)染色：将选取好的石蜡切片依次于二甲苯浸泡两次(10 min/次)、无水乙醇浸泡两次(5min/次)、95％乙醇浸泡5min、90％乙醇浸泡5min、 80％乙醇浸泡5min、70％乙醇浸泡5min，得到脱蜡的切片，用自来水漂洗切片 5min。所述百分比均为体积百分比。将切片先放入苏木精染液中染色15min，染细胞核，接着用自来水漂洗5min后，用1％盐酸乙醇(v/v％)分化切片20s；之后用自来水再次漂洗2min，用弱碱性水返蓝45s；自来水仔细漂洗10min，用伊红染色切片10min，染细胞质；再次经梯度乙醇脱水：依次浸入90％乙醇溶液3min、无水乙醇两次(3min/次)。二甲苯透明两次(5min/次)，用中性树胶封片。
显微镜下观察并拍照记录。根据染色显示的细胞结构，判断细胞是否具有细胞核结构、是否保留细胞外基质结构。
(2)脱细胞牙髓干细胞膜片DNA定量
样品处理：将本实施例步骤2制得的牙髓干细胞膜片或脱细胞牙髓干细胞膜片于-80℃冻存48h以上。取出冻存处理后的样品，每管加入500μL 0.5mg/mL的蛋白酶K溶液(碧云天(中国)，ST533)，60℃水浴12h；振荡摇匀，取50μL 样品溶液加入到100μL的TE缓冲液(索莱宝(中国)，T1120-100mL)，混匀，得到牙髓干细胞膜片或脱细胞牙髓干细胞膜片的DNA样品。
样品测定：采用DNA定量试剂盒(Epigentek(美国)，P-1020)，参照说明书检测上述DNA样品的DNA含量。
(3)CCK8检测脱细胞牙髓干细胞膜片的细胞毒性
制备牙髓干细胞膜片及脱细胞牙髓干细胞膜片的浸提液：以高糖DMEM培养基为基础培养基，制备含有10％胎牛血清(v/v％)、100IU青霉素及100μg/mL 链霉素的高糖DMEM完全培养基；将本实施例步骤2制得的牙髓干细胞膜片或脱细胞牙髓干细胞膜片置于4mL高糖DMEM完全培养基中，于37℃恒温水浴 24h，即得到牙髓干细胞膜片的浸提液和脱细胞牙髓干细胞膜片的浸提液。
C17.2神经干细胞的培养及处理：将C17.2神经干细胞以3×103个/孔的浓度接种于96孔板中，向C17.2神经干细胞加入100μL牙髓干细胞膜片的浸提液进行培养，记为hDPSC组；向C17.2神经干细胞加入100μL不同浓度Triton X-100 细胞裂解液处理不同时间的脱细胞牙髓干细胞膜片的浸提液进行培养，记为0.5％ 5min组、0.5％10min组、0.5％30min组、1％5min组、1％10min组、1％30 min组；向C17.2神经干细胞加入100μL高糖DMEM完全培养基进行培养，作为对照组，记为DMEM组；将处理后的C17.2神经干细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每天更换各实验组浸提液和对照组的高糖DMEM完全培养基。
CCK8检测：分别于培养的第1、2、3、4、5、6天的同一时间段，向每孔 C17.2神经干细胞加入10mL CCK8试剂，避光置于37℃、5％CO2培养箱中培养 1h后，在酶标仪上测定450nm波长下各孔的OD值。
(4)电镜观察
将本实施例步骤2制得的牙髓干细胞膜片或脱细胞牙髓干细胞膜片用PBS 漂洗3次，每次3min；然后置入2.5％戊二醛固定液中4℃固定过夜，再用PBS 漂洗3次；经梯度乙醇脱水(分别为30％、50％、70％、80％、90％、95％乙醇各1次，100％乙醇2次，5min/次)；经乙酸异戊酯浸泡2次(20min/次)；喷金固定；扫描电子显微镜下观察并拍照记录，记录放大倍数为1000倍及5000倍时的视野。
(5)免疫荧光染色
将选取好的石蜡切片进行二甲苯脱蜡后梯度乙醇脱水(方法同H&E染色中切片脱蜡)，得到脱蜡的切片，用自来水漂洗3次；将切片完全浸泡于EDTA抗原修复液(1×)中，在微波炉内采用中火5min和低火10min加热修复；待修复结束后将切片置于室温下冷却；用PBS溶液洗涤切片3次，每次5min。
用滤纸稍擦干切片，避光，向组织加入组织自发荧光淬灭剂，5min后用自来水冲洗10min；用滤纸擦干切片，用免疫组化笔轻轻围绕着组织画圈，往圈内的组织上方缓慢滴加3％的BSA(v/v％)，室温避光封闭30min；弃去BSA，加入兔抗人I型胶原蛋白抗体(CollagenⅠ)(Abcam，ab138492)作为一抗覆盖组织，将切片缓慢地移入湿盒内，在4℃的条件下孵育过夜；取出湿盒，待切片恢复至室温，在摇床上缓慢用PBS溶液洗涤切片3次，每次时长5min；将切片用滤纸稍擦干后在圈内的组织上方加入Alexa Fluor 488荧光标记山羊抗兔抗体(Abcam，ab150077)作为二抗，室温避光孵育60min；用PBS溶液洗涤切片3 次，每次5min；用滤纸擦干切片，在圈内的组织上滴加0.1μg/mL DAPI染液，室温避光下孵育10min。
用PBS溶液洗涤切片3次，每次时长5min；在组织周围滴加抗荧光淬灭封片剂，将盖玻片缓慢覆盖在组织上方进行封片；于BX63全自动智能荧光显微镜下，进行观察并拍照。
二、实验结果
(1)本发明牙髓干细胞膜片经过脱细胞处理前后的直观图及H&E染色图如图4。
如图4中的a～g所示，随着细胞裂解液中Triton X-100浓度的升高及处理时间的延长，牙髓干细胞膜片逐渐变薄变脆，发生皱缩，但仍具有可操作性；如图4中的h～n所示，h可见膜片中牙髓干细胞的形态基本不变，牙髓干细胞被其自身分泌的细胞外基质所包绕；随着细胞裂解液中Triton X-100浓度的升高及处理时间的延长，hDPSCdECM的细胞结构基本消失，用0.5％Triton X-100处理牙髓干细胞膜片5min，仍可见部分细胞核残留(图4中的i中的箭头所指之处)； 0.5％TritonX-100及1％TritonX-100处理时间延长至10min或30min时，细胞外基质染色变浅，结构变疏松。用1％Triton X-100处理牙髓干细胞膜片5min，绝大部分细胞结构被去除，同时细胞外基质结构基本保持完整。
(2)hDPSCdECM的DNA含量检测及生物安全性检测的结果如图5所示。
如图5中的a所示，牙髓干细胞膜片中的DNA含量为3866±113ng/mL；用 0.5％Triton X-100处理5min的牙髓干细胞膜片中的DNA含量为173.1±5.655 ng/mL；用0.5％Triton X-100处理10min的牙髓干细胞膜片中的DNA含量为 95.22±6.426ng/mL；用0.5％Triton X-100处理30min的牙髓干细胞膜片中的DNA 含量为76.89±11.64ng/mL；用1％Triton X-100处理5min的牙髓干细胞膜片中的 DNA含量为49.67±7.122ng/mL；用1％Triton X-100处理10min的牙髓干细胞膜片中的DNA含量为26.33±2.432ng/mL；用1％Triton X-100处理30min的牙髓干细胞膜片中的DNA含量为7±2.146ng/mL(*p＜0.05)。
不同浓度Triton X-100、不同处理时间牙髓干细胞膜片DNA去除率如表2 所示。
表2不同浓度Triton X-100、不同处理时间牙髓干细胞膜片DNA去除率
根据文献(10.1016/j.biomaterials.2020.120596、10.1016/j.actbio.2019.11.012.、 10.1002/jbm.a.36266、10.1016/j.actbio.2018.10.005.、10.1016/j.actbio.2020.10.022.) 可知，DNA去除率达到96％以上即说明脱细胞成功。
根据图5和表2可知，用0.5％Triton X-100细胞裂解液处理10min、0.5％TritonX-100细胞裂解液处理10min、1％Triton X-100细胞裂解液处理5min、 10min、30min均可成功脱细胞。
如图5中的b所示，不同条件处理下的脱细胞牙髓干细胞膜片的浸提液对 C17.2神经干细胞的增殖均没有影响，各组间的细胞生长和增殖情况没有差异，表明本发明所制备的脱细胞牙髓干细胞膜片具有良好的生物安全性。
(3)hDPSCdECM的扫描电镜分析结果如图6所示。
如图6中的a～n所示，扫描电镜下观察可见对照组中牙髓干细胞膜片中的 hDPSCs呈长梭形，细胞呈复层生长(图6中a虚线圈示单个细胞)，此外可见 hDPSCs周围有大量胶原纤维(图6箭头示)。经过不同浓度Triton X-100细胞裂解液及不同时长的处理后，扫描电镜显示各处理条件下细胞结构均可从牙髓干细胞膜片中基本去除，但随着Triton X-100溶液浓度及反应时长增加，细胞外基质破坏严重，0.5％TritonX-100处理5、10、30min组及1％TritonX-100处理时间延长至10min或30min时细胞外基质残存的形态结构差，细胞去除后残留的陷窝更多更明显，胶原纤维密度最小(箭头示)。1％Triton X-100 5min组在可去除细胞成分的同时，仍可保留相对完成的细胞外基质(图6中l)。
(4)hDPSCdECM的I型胶原免疫荧光染色结果如图7所示。
如图7中的a～i所示，随着细胞裂解液中Triton X-100浓度的升高及处理时间的延长，牙髓干细胞膜片的DAPI荧光强度越来越低，而I型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)的荧光强度基本不变。表明随着细胞裂解液中Triton X-100浓度的升高及处理时间的延长，牙髓干细胞膜片中细胞核含量逐渐减少，用1％Triton X-100处理牙髓干细胞膜片5min即可大幅减少细胞核含量，但不会造成牙髓干细胞膜片中的胶原蛋白成分的损失。
综上可知，本发明使用1％TritonX-100 5min处理条件下制备脱细胞牙髓干细胞膜片的方法可以较为彻底地去除膜片中的细胞成分，且不会造成胶原成分的破坏和损失。选择使用1％TritonX-100 5min处理条件下所制备的脱细胞牙髓干细胞膜片进行后续实验。
实施例3脱细胞牙髓干细胞基质膜片治疗脊髓损伤
一、实验方法
1、大鼠T10脊髓半横断损伤模型的构建
取6～8周龄的雄性SD大鼠，予以1％戊巴比妥(0.2mL/100g)腹腔注射麻醉，取俯卧位并将大鼠的四肢远端用橡皮筋固定于手术台上。
T10为特征性解剖学标志。T9～T11三节脊椎棘突为梯形结构排列，而T10 最为突出，常作为大鼠脊柱椎体体表定位标志。术前定位以T10脊椎棘突为中心作为手术切口，手术部位予以剃毛备皮。
以T10为中心，切口部位皮肤常规消毒3遍，体积分数75％的酒精脱碘，铺无菌洞巾，切口长度约3cm，逐层切开皮肤、皮下组织，分离背部肌肉；沿深筋膜肌肉附着点切开深筋膜，暴露棘突和椎旁肌肉，锐性切开椎旁肌肉并向两旁用微型拉钩撑开，如图8中的a所示充分暴露T9～T11椎板。
在体视镜下用微型咬骨钳由T10～T11左侧椎间隙为入路，切开黄韧带，然后继续咬除左侧椎板及棘突，完全暴露脊髓正中静脉及左侧脊髓；用刀片沿脊髓后动脉左侧缘切开硬脊膜及脊髓，剪去除脊髓正中左侧2mm长脊髓，如图8中的b所示，大鼠T10脊髓呈现左侧半横断损伤。
以大鼠的左下肢及尾部表现痉挛性抽搐后出现瘫痪，判定大鼠T10脊髓半横断损伤模型构建成功。
2、脱细胞牙髓干细胞基质膜片的移植治疗
取1份实施例2中1％TritonX-100 5min处理条件下所制备的脱细胞牙髓干细胞膜片，如图8中的c～d所示，将脱细胞牙髓干细胞膜片移植至大鼠T10脊髓半横断损伤模型的半切缺损处；如图8中的e所示，用凝胶海绵覆盖损伤脊髓背侧；如图8中的f所示，用牙科玻璃离子水门汀覆盖并连接术区两侧锥板，作为移植组，记为hDPSCdECM组。
用凝胶海绵覆盖大鼠T10脊髓半横断损伤模型的损伤脊髓背侧，牙科玻璃离子水门汀覆盖并连接术区两侧锥板，作为对照组，记为control组。
对移植组和对照组充分止血，由深到浅逐层依次缝合肌肉、深筋膜、皮肤，白炽灯照射大鼠至麻醉复苏。
3、脱细胞牙髓干细胞膜片治疗脊髓损伤的效果鉴定
(1)H&E染色
分别于大鼠术后的7天及28天，经腹腔注射1％戊巴比妥(0.4mL/100g)，令大鼠进入深度麻醉，立即打开胸腔，经左心室向主动脉插管，剪开右心耳，快速灌注300mL常温PBS溶液，随后灌注300mL 4℃的4％多聚甲醛固定液；完全固定后，在台式显微镜下，用咬骨钳咬除椎板，用10号刀片切开硬脊膜，切断神经根，取出术区2cm长的脊髓，将脊髓组织置于包埋盒中，浸泡于4％多聚甲醛溶液固定过夜，参照实施例2的步骤3(1)制备石蜡切片并进行H&E染色，显微镜下观察并拍照记录。通过ImageJ定量分析三组(n＝3)移植第7天及第 28天脊髓组织横截面空洞面积。
(2)免疫荧光染色
参照实施例2的步骤3(5)，使用兔抗鼠NF-200抗体(Proteintech，18934-1-AP) 作为一抗、FITC荧光标记山羊抗兔抗体(Earthox，E031220)作为二抗，进行免疫荧光染色，并于BX63全自动智能荧光显微镜下，进行观察并拍照。
(3)足迹分析
于术后的28天，分别对移植组和对照组的大鼠进行足迹分析。将大鼠的双侧后肢印上红色染料，将其置于A1纸张上，允许其自由活动，截取大鼠直线行走的足迹进行分析。
二、实验结果
(1)hDPSCdECM治疗大鼠脊髓损伤7天及28天的H&E染色图如图9的 a、b所示；通过ImageJ定量分析的移植第7天及第28天脊髓组织横截面空洞面积柱状图如图9中c、d所示。
如图9中的a、b所示，与control组相比，移植脱细胞牙髓干细胞膜片治疗脊髓损伤的7天及28天，可以看到脊髓组织缺损面积显著减小(图中虚线圈注的白色区域的面积减小)；并且在移植治疗的28天，脊髓组织中可见少数神经细胞(图中箭头所指之处)。表明本发明的脱细胞牙髓干细胞膜片具有促进脊髓损伤愈合、促进神经轴突再生、促进运动功能恢复的效果。
如图9中的c、d所示，第7天时对照组空洞面积为1.898±0.1278mm2，hDPSC-dECM组为1.243±0.1522mm2；第28天时对照组空洞面为1.884±0.2904 mm2，hDPSCdECM组为1.022±0.0897mm2。移植第7天及第28天时 hDPSCdECM组脊髓组织横截面空洞面积相比对照组减少(p＜0.05)。表明本发明的脱细胞牙髓干细胞膜片具有促进脊髓损伤愈合的效果。
(2)hDPSCdECM治疗大鼠脊髓损伤28天时神经元轴突标记物NF-200的荧光染色结果如图10所示。
如图10所示，与control组相比，移植脱细胞牙髓干细胞膜片治疗脊髓损伤 28d时，脊髓组织缺损处(白色虚线示缺损边界处)NF-200荧光标记的再生的神经轴突更多，密度更大。表明本发明的脱细胞牙髓干细胞膜片具有促进脊髓损伤处神经轴突再生的效果。
(3)hDPSCdECM治疗大鼠脊髓损伤28天时大鼠的足迹分析结果如图11 所示。
如图11所示，与control组相比，移植脱细胞牙髓干细胞膜片治疗脊髓损伤 28d时，大鼠的患侧足迹与健侧足迹更接近，且患侧足迹的拖拽痕迹明显减少。表明本发明的脱细胞牙髓干细胞膜片具有促进脊髓损伤大鼠恢复运动功能的效果。
以上结果表明，本发明的脱细胞牙髓干细胞膜片用于移植治疗大鼠的脊髓损伤，具有促进损伤处脊髓组织愈合、神经再生的作用，可以使脊髓损伤的大鼠快速恢复正常的运动功能。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种脱细胞牙髓干细胞膜片的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
S1.利用膜片培养基培养牙髓干细胞12～16天，得到牙髓干细胞膜片；
S2.将牙髓干细胞膜片置于细胞裂解液中，36～38℃下处理5～30min；然后利用脱氧核糖核酸酶处理后即得脱细胞牙髓干细胞膜片；
步骤S1所述膜片培养基为含有胎牛血清和抗坏血酸的α-MEM培养基；
步骤S1所述牙髓干细胞为原代牙髓干细胞培养的第2～4代牙髓干细胞；
步骤S2所述细胞裂解液为含有体积分数为0.5％～1％TritonX-100和18～22mM NH4OH的磷酸盐缓冲液。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S1具体步骤为：
将牙髓干细胞先经过完全培养基培养至细胞密度为80％～90％，然后换用膜片膜片培养基；所述完全培养基为含有胎牛血清的α-MEM培养基。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述细胞裂解液为含有体积分数为0.5％～1％TritonX-100和20mM NH4OH的磷酸盐缓冲液细胞裂解液。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S1所述膜片培养基为含有体积分数8％～12％胎牛血清和终浓度为48～52μg/mL的抗坏血酸的α-MEM培养基。
5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述完全培养基为含有体积分数8％～12％胎牛血清的α-MEM培养基。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2中将牙髓干细胞膜片置于细胞裂解液中，37℃下处理5～30min。
7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2所述脱氧核糖核酸酶处理具体将细胞裂解液处理后的牙髓干细胞膜片置于脱氧核糖核酸酶中，36℃～38℃反应55min～65min。
8.根据权利要求1或7所述制备方法，其特征在于，所述脱氧核糖核酸酶的浓度为90U/mL～110U/mL。
9.利用权利要求1～8任一所述制备方法制得的脱细胞牙髓干细胞膜片。
10.权利要求9所述脱细胞牙髓干细胞膜片在作为治疗脊髓损伤的支架材料或在制备脊髓移植物中的应用。
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