KR101773669B1 - 생체적합성 각막세포 전구체 분화방법 및 각막세포 전구체 조성물 - Google Patents

생체적합성 각막세포 전구체 분화방법 및 각막세포 전구체 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체적합성 각막세포 전구체 분화방법에 관한 것으로 조직원으로부터 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포(human turbinate mesenchymal stromal cells, hTMSCs)를 제공하는 단계 및 상기 제공된 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포(human turbinate mesenchymal stromal cells, hTMSCs)를 KGF(keratocyte growth factor)가 첨가된 각막분화배지에서 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명은 기존에 불가능했던 분화 가능한 각막세포 전구체 조성물을 구현할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명을 통한 각막세포 전구체 조성물을 환자의 각막에 주입할 경우, 각막의 투명성을 보장하면서 단기간의 치료 효과를 누릴 수 있는 효과가 있다.

Description

생체적합성 각막세포 전구체 분화방법 및 각막세포 전구체 조성물 {BIOCOMPATIBILITY KERATOCYTE PROGENITOR CELL DIFFERENTIATION METHOD AND BIOCOMPATIBILITY KERATOCYTE PROGENITOR CELL COMPOSITION}
본 발명은 생체적합성 각막세포 전구체 분화방법 및 각막세포 전구체 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포로부터 각막세포 전구체로 분화하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.
의학의 발달에 따라 질병이나 외상에 의해 기능이 소실된 조직 또는 장기를 유사한 자가조직이나 기능이 동일한 장기로 대체하는 시술법이 개발되어 왔지만 이는 공여부 결손의 문제를 일으킨다. 최근에 이러한 문제를 해결하기 위해 공여부에서 소량의 세포를 얻어 세포배양기술을 이용해 증식시켜 이식하는 조직공학기법이 장기이식이나 조직이식을 대신할 수 있는 방법으로 시도되고 있다.
각막은 눈의 검은 동자의 표면을 덮고 있는 투명한 막을 말한다. 이것은 외부로부터 눈을 보호하는 일차적인 역할을 할 뿐만 아니라, 빛을 눈 안으로 받아들여 사물을 볼 수 있게 해주는 창문과 같은 역할을 한다.
각막에 기능적이거나 구조적으로 회복 불가능한 손상이 생기게 되면, 각막이 붓거나 혼탁해져 시력에 타격을 받는다. 각막 혼탁이 생기면 각막이 하얗게 변하고, 심해지면 미용상의 문제를 초래할 수 있다. 이와 같이 손상된 각막 치료하기 위해 공여부에서 소량의 세포를 얻어 세포배양기술을 이용해 증식시켜 이식하는 조직공학 기법이 시도되고 있다. 이러한 각막 치료 방법은 시력을 개선하기 위해서일 뿐만 아니라 눈의 구조를 유지하거나, 각막 질환 자체를 치료하기 위해서 그리고 미용적인 목적으로 시술하기도 한다.
한편, 이러한 각막 치료를 위하여 분화된 각막 세포 전구체가 요구되지만, 중간엽 기질세포(MSC)를 각막세포 전구체(keratocyte progenitor cell)로 분화시키는 것은 무척 어려운 일이며, 현재 제대로 분화가 성공하지 못하고 있는 실정이다.
대한민국 특허 공개번호 제 2013-0121685호
본 발명은 중간엽 기질세포(MSC)를 이용하여 각막세포 전구체(Keratocyte progenitor cell)로 분화를 유도하는 방법이다.
구체적으로, 본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위하여 기존에 사용되지 않았던 새로운 성장인자인 KGF(keratocyte growth factor)를 이용, 세포의 분화를 유도하여 각막세포 전구체 조성물을 생성하는 방법이다. 이러한 시도는 지금까지 세계적으로 성공한 사례가 없는 새로운 방법이다.
또한, 본 발명은 환자의 각막에 질병이 생겼을 경우에는 손상된 세포를 대체하는 동시에, 환자의 각막 투명도를 유지할 수 있는 완벽한 치료를 하기 위한 목적으로 한다.
본 발명에 따른 생체적합 각막세포 전구체 분화방법은 조직원으로부터 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포(human turbinate mesenchymal stromal cells, hTMSCs)를 제공하는 단계 및 상기 제공된 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포(human turbinate mesenchymal stromal cells, hTMSCs)를 KGF(keratocyte growth factor)가 첨가된 각막분화배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 각막분화배지에서 배양하는 단계는 성장 배양배지로 DMEM high glucose를 사용하며, 5-15% FBS, 0.5-1.5% P/S를 첨가하여 조성할 수 있다.
또한, 각막분화배지에서 배양하는 단계는 분화 배양배지로 DMEM/F12를 사용하며, 0.5-1.5% horse serum, KFG 8-12ng/ml 또는 EGF 8-12ng/ml을 첨가하여 조성할 수 있다.
또한, 생체적합 각막세포 전구체 분화방법은 분리된 사람의 하비갑개 조직을 절단한 후, 배양배지에 상기 하비갑개 조직을 유착시켜 배양한 다음, 상기 배양배지에 부착된 사람 하비갑개 유래의 중간엽 기질세포를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 각막분화배지에서 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포가 각막세포 전구체(keratocyte progenitor cell)로 분화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
그리고 생체적합 각막세포 전구체 조성물은 KGF(keratocyte growth factor)가 첨가된 각막분화배지에서 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포(human turbinate mesenchymal stromal cells, hTMSCs)를 분화하여 조성될 수 있다.
또한, 각막 손상 예방 또는 치료용 조성물은 상기 각막세포 전구체 조성물을 이용하여 각막 재생 또는 각막 이식을 수행할 수 있다.
그리고 생체적합 각막세포 전구체 분화방법은 분리된 사람의 하비갑개 조직을 절단한 후, 배양배지에 상기 하비갑개 조직을 유착시켜 배양한 다음, 상기 배양배지에 부착된 사람 하비갑개 유래의 중간엽 기질세포를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
기타 실시 예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.
본 발명에 따른 생체적합성 각막세포 전구체 분화방법 및 각막세포 전구체 조성물은 기존에 불가능했던 분화 가능한 각막세포 전구체 조성물을 구현할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명을 통한 각막세포 전구체 조성물을 환자의 각막에 주입할 경우, 각막의 투명성을 보장하면서 단기간의 치료 효과를 누릴 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 경우 건강한 세포의 중간엽 기질세포(MSC)를 이용하므로, 환자에게는 심리적에 따른 건강 회복면에서도 도움이 되는 것을 기대할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체적합성 각막세포 전구체 분화방법을 나타낸 순서도이다.
도 2 및 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 셀 소스(cell source)로 하고 성장인자를 KFG(keratocyte growth factor)로 하여 상기 셀 소스 분화를 통한 유전발현 정도를 나타낸 이미지이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 셀 소스(cell source)로 하고 성장인자를 KFG(keratocyte growth factor)로 하여 분화를 통한 유전발현 정도를 시간별로 확인한 이미지이다.
이하, 본 발명의 실시 예에 따른 생체적합성 각막세포 전구체 분화방법 및 각막세포 전구체 조성물에 대해 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 그러나 본 실시예의 이하에서 개시되는 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 한다.
따라서 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어서 이를 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체적합성 각막세포 전구체 유도 방법을 나타낸 순서도이다.
우선, 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포(human turbinate mesenchymal stromal cells, hTMSCs)를 제공하는 단계가 진행된다(S10).
상기 단계에서 각 세포로 분화하기 위해 사용하는 중간엽 기질세포(MSCs)로 사람 하비갑개 중간엽 기질세포(human turbinate mesenchymal stromal cells, hTMSCs)를 사용할 수 있다. 여기서 사람 하비갑개는 사람의 코 안에 존재하는 조직으로서, 내부에 망상의 정맥동이 다량 분포하고 이들 주위에 중간엽 기질세포가 다수 존재하는 점막하 조직이 풍부한 조직이다.
이는 코막힘 증상의 개선을 위해 이비인후과 영역에서 시행되는 하비갑개 부분 절제술의 과정에서 수득한 것을 사용할 수 있다. 또한, 수술실이 아닌 이비인후과 외래에서 환자의 통증 없이 짧은 시간 내에 쉽게 조직을 생검한 것을 사용할 수 있다.
상기 하비갑개 유래 중간엽 기질세포(turbinate mesenchymal stromal cells, TMSCs)는 당업계에 공지된 중간엽 기질세포 분리 방법이라면 모두 사용 가능하다. 일실시예로서, 척추동물로부터 채취한 세포를 밀도 구배 원심분리를 수행하여 세포 분획을 회수한 후, 중간엽 기질세포만을 분리하여 이를 배양함으로써 수득할 수 있다. 이때 상기 밀도 구배 원심분리는 일정한 비중을 가지는 세포 분획만을 수득할 수 있는 방법으로서, 밀도 구배 원심을 위한 용액, 예를 들면, 피콜(ficol), 퍼콜(percol) 및 히스토페이크(histopaque)와 같은 용액 내에서 세포가 그 비중에 상응한 위치를 차지하는데 충분한 시간동안 일정한 속도로 회전시키는 과정을 말한다.
상기와 같은 방법으로 수득한 하비갑개 유래 중간엽 기질세포는 이후 세포가 자라는 배양배지에 각막성장인자를 처리하고 배양함으로써 각막세포 전구체로 분화시킬 수 있다.
이후, 상기 제공된 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포(human turbinate mesenchymal stromal cells, hTMSCs)를 KGF(keratocyte growth factor)가 첨가된 각막분화배지에서 배양하는 단계를 진행할 수 있다(S20).
상기 제공된 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포(human turbinate mesenchymal stromal cells, hTMSCs)는 하비갑개 조직을 세척 또는 절단 등의 방법을 통하여 분리하고, 이를 중간엽 기질세포 배양용 배지에서 배양함으로써 수득할 수 있다. 상기 분리한 중간엽 기질세포는 2~5회, 바람직하게는 3~4회 계대 배양한 것을 사용할 수 있다.
또한, 사람의 하비갑개 조직을 절단한 후, 배양 접시에 상기 하비갑개 조직을 유착시켜 배양한 다음, 부착되지 않은 세포들은 제거하고, 상기 접시에 부착된 사람 하비갑개 유래의 중간엽 기질세포를 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 단계는 중간엽 기질세포(MSC)를 이용하여 각막세포전구체(keratocyte progenitor cell)로 분화를 유도하기 위한 배양배지를 만드는 과정으로, 배양배지는 통상적으로 사용하는 동물세포 배양용 배지라면 모두 사용 가능하며, 이에 제한되지는 않으나, DMEM, 알파-DMEM, 이글스 기본 배지(Eagle's basal mediu,), RPMI 1640 배지, NPBM(Neural progenitor cell basal medium: SClonetics) 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라 우선 세포를 안정화하기 위하여 성장 배양배지를 제공할 수 있다(S21). 상기 성장 배양배지는 DMEM high glucose를 사용하며, 5-15% FBS, 0.5-1.5% P/S를 포함하여 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 성장 배양배지는 DMEM high glucose를 사용하며, 10% FBS, 1% P/S를 포함하여 사용할 수 있다. 상기 세포 성장 배양배지에 상기 중간엽 기질세포(MSC)를 하루 동안 배양 한다.
그리고 상기 중간엽 기질세포(MSC)를 배양한 다음날 처음에 넣었던 성장 배양배지를 모두 버리고, 새로운 분화유도 배양배지를 사용한다(S23). 새로운 분화유도 배양배지는 DMEM/F12를 사용하며, 0.5-1.5% horse serum, KFG 8-12ng/ml 또는 EGF 8-12ng/ml을 포함하여 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 분화유도 배양배지는 DMEM/F12를 사용하며, 1% horse serum, KFG 10ng/ml 또는 EGF 10ng/ml을 포함하여 사용할 수 있다.
각막세포(keratocyte)는 신경에서 유래된 세포이며, 상피는 생체 외 환경과 접하고 있고 내피는 시신경과 연결되어 있는 가장 민감한 장기 중 하나이다. 그러나 질병이 있는 각막을 재건을 해야 하는 경우에 치료방법이 다양하지 않으며, 분리를 해서 외부에서 배양을 할 경우 대부분은 시각 장애를 일으키는 섬유세포(fibroblast)로 변하게 되는 제한점을 가지고 있다.
따라서 최근에는 이와 같은 문제점을 해결하고 보다 안전한 수술 방법을 개발하고자 하는 노력이 지속되고 있으며, 특히, 줄기세포에서 분화된 각막세포의 조직공학적 각막세포 제작은 각막세포화된 줄기세포 및 생분해성 지지체가 필수적이다. 즉, 각막세포(keratocyte)로 분화가 가능한 전구체를 만드는 것이 중요한 것이다. 각막세포(Keratocyte)로 분화 가능한 전구체는 건강한 경우에는 늘 어느 정도 각막에 존재하고 있다가, 질병이 생겼을 경우 병든 세포를 대체하고 각막의 투명도를 유지하게 하는 기능을 가지는 세포이다.
따라서 본 발명의 방법으로 제공될 수 있는 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포는 각막세포로의 분화가 가능하며, 증식력도 우수하고 투명도가 높은 장점을 가지고 있어서 세포 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다.
이러한 점에서 다분화능이 있고 신경세포로도 분화 가능한 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 이용하여 전구체 세포로 만드는 것은, 각막의 세포이식에 가장 큰 장점이라고 볼 수 있다.
또한, 상기 중간엽 기질세포(MSC)를 각막의 각막세포 전구체(keratocyte progenitor cell)로 분화시키는 것은 무척 어려운 일이다. 그래서 KFG(keratocyte growth factor)를 이용하여 특이적인 각막세로(keratocyte)로의 분화를 유도하였다. 기존에는 대부분의 방법들의 EGF, FGF를 이용하여 각막세포(keratocyte)를 배양하여 분화를 유도하였다. 하지만 이러한 방법은 아직까지 성공한 사례가 없었다. 그러나 KFG(keratocyte growth factor)를 이용하여 분화시켰을 경우, 매우 정확하고 빠른 분화 정도를 보여줌을 확인할 수 있었다.
분화유도 배양배지에서 각막세포 전구체를 분화 정도는, 상기 분화유도 배양배지는 2~3일이 지나면 갈아주면서 각막세포의 전구체가 형성되는 과정을 확인할 수 있다(S30).
이하, 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포(human turbinate mesenchymal stromal cells, hTMSCs)가 각막 세포 전구체(keratocyte progenitor cell)로 분화가 유리하게 진행되는지 여부를 확인하기 위한 실험 실시 과정을 설명한다.
상기 분화된 각막세포 전구체가 원하는 형태의 성질과 분화 능력을 확인하기 위하여 EGF 또는 KGF가 없는 배지를 대조군으로 하여 비교실험을 하였다.
도 2 및 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 셀 소스(cell source)로 하고 성장인자를 KFG(keratocyte growth factor)로 하여 분화를 통한 유전발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 셀 소스(cell source)로 하고 성장인자를 KFG(keratocyte growth factor)로 하여 분화를 통한 유전발현 정도를 시간별로 확인한 이미지이다.
각막세포 전구체(keratocyte progenitor cell)의 기능을 하는 유전자 발현 양상
각막세포(keratocyte)가 스트로마(stroma)에 콜라겐을 합성하게 할 수 있는 특이적 유전자 발현이 일어나는지 실험해 보았다.
구체적으로, Keratocan(KERA), Aldehyde dehydrogenase(ALDH) 및 전구체세포마커(progenitor cell marker)인 PAX6으로 유전자 발현정도를 확인해보았다. 그리고 섬유세포(fibroblast)에서만 발현하는 ACTA2 및 Cartilage oligomeric matrix protein(COMP)도 같이 발현양상을 여부를 확인해 보았다.
<유전자발현 실험 PCR>
유전자의 PCR 프라이머(primer)는 사람의 각막세포(keratocyte)에 있는 부위를 넣어서 만든 것을 이용하여 실험을 시행하였다. 그리고 GC의 함량은 40~60% 사이로 조절하여 실험하였다. 또한, 프라이머(primer)는 20~100 pmol로 1ul로 만들어서 추가하여 실험을 시행하였다.
이 실험에서는 DNA의 순도가 가장 중요한 요인이 된다. 그러므로 중간엽 기질세포(MSC)의 세포가 분화된 이후, 각막세포 전구체(keratocyte progenitor cell)의 RNA의 분리 순도 유지 및 함량이 중요하다. 즉, RNA의 분리 순도 유지 및 함량 만큼 분화유도가 된 세포들이 다량 존재한다는 것을 알 수 있다. 더욱이, 가장 중요한 것은 그런 분화유도가 된 모든 세포들에게서 사람의 각막세포(keratocyte)의 특이적 부위가 있어서 프라이머(primer)와 결합을 한다는 것이다. 그렇지 않으면 위의 결과와 같은 유전자 발현이 되지 않는 원리이다.
또한, ACTA2의 실험을 통하여, 각막세포 전구체(keratocyte progenitor cell) 이후, 섬유세포(Fibroblast)에서 발현이 되는지 확인하였다. 섬유세포(Fibroblast)에서 발현은 대부분 시각 장애를 일으키는 부정적 영향을 일으키지만, 본 발명은 이러한 각막세포로의 기능적 해가 되는 과정이 일어나지 않음을 확인할 수 있었다.
도 2 및 3을 참조하면, 각막세포(keratocyte)에서 특이적으로 발현하는 부위가 시기가 지날수록 점점 발현의 양이 늘어가는 것을 확인할 수 있다. 즉, 이는 중간엽 기질세포(MSC)의 다분화능(multipotent)한 성향이 각막세포에 적합한 특정 유전자로 발현(keratocyte specific) 되는 것으로 알 수 있는 결과이다. 분화 시기는 14일에 가장 많은 발현이 되는 것으로 보아 14일 부근에서 분화가 가장 잘 되었다는 것을 확인할 수 있었다.
<PAX-6 Immune florescence staining 실험>
도 4를 참고하면, 각막세포 전구체(keratocyte progenitor cell)에서 PAX-6의 부위도 발현이 되는 것을 확인하였다. 본 실험에서, 1차 안티바디는 PAX-6를 사용한다. 즉 세포에서 PAX-6의 안티바디와 인식부위가 있으면 안티바디와 결합을 한다. 이후, 2차 안티바디에는 형광을 발하면서 위치를 알게 해주게 된다. 즉, 세포의 어느 부위에서 원하는 목적 단백질이 발현하는지, 양적발현의 차이를 알게 해주는 실험이다.
시간이 지남(1일, 7일, 14일)에 따라 발현이 증가하는 것으로 보아 유전자의 발현의 양상과 유사하다는 것을 알 수 있다.
각막세포 전구체(keratocyte progenitor cell)로 분화 후 hTMSCs의 특성 변화 유무 검증
각막 세포 전구체로(keratocyte progenitor cell)의 분화 중 혹은 분화 후, 세포와 원래 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(human turbinate mesenchymal stromal cells, hTMSCs)의 특성에 변화가 없는지 검증하기 위하여, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 표면에 발현하는 면역 표현형 마커들의 발현양을 FACS 분석을 통해 확인하였다. 또한, 분화 중에 발현량이 높아 질 것이라 예상하는, Precursor marker: PAX6도 함께 확인 하였다.
각막 세포 전구체로 분화시킨 세포와 대조군세포를 1, 3, 7, 14, 21일 별로 회수한 후, 중간엽 줄기세포(turbinate mesenchymal stromal cells, TMSCs)의 면역 표현형 마커 중 ⅰ)hematopoietic lineage 표현형 마커인 CD14, CD19, CD34, CD29, ⅱ)mesenchymal stem cell의 표현형 마커인 CD73, CD90, CD105 ⅲ)면역거부반응의 표현형 마커인 HLA-DR 및 ⅳ)전구체 세포 표현형 마커인 PAX6을 단백질에 각각 특이적인 항체를 이용하여 FACS 분석을 수행하였다.
본 실험을 통하여 7일차 및 14일차에 가장 많이 각막세포 특이 유전자(Keratocyte specific gene)은 많이 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과들을 통하여 상기 하비갑개 유래 중간엽 기질세포는 상기 KGF가 포함된 배지 내에서 분화가 잘 유도되어 각막세포전구체(keratocyte progenitor cell)로서 발현되었음을 확인할 수 있다. 더불어 PAX6의 염색(staining)을 통하여 각막세포 전구체(Keratocyte progenitor cell)의 가장 큰 특징인 세포의 발현의 위치와 양상을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 실험을 통하여 각막세포(keratocyte)가 주요한 기능에 관련된 유전자발현을 확인되어 분화된 세포 전구체가 제대로 기능을 할 수 있음을 알 수 있었다. 그리고 각막세포(keratocyte)는 모양이 다른 세포와는 다른 모양을 하고 있으므로 그러한 것을 확인하였다.
결론적으로 본 발명은 셀소스(cell sorce)로 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포(human turbinate mesenchymal stromal cells, hTMSCs)를 이용하고 성장인자로 KFG(keratocyte growth factor)를 사용하여 유전자 발현도가 매우 높으며, 각막에 적합한 투명도를 유지하면서 면역거부반응이 거의 발생하지 않는 각막세포전구체(keratocyte progenitor cell)를 얻을 수 있음을 확인하였다.
따라서 이를 환자의 눈에 이식하는 경우, 환자의 각막의 치료효과가 기종에 비하여 월등하게 발달하고 심리적으로 안정적인 치료가 가능함을 알 수 있다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시 예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적인 특징들이 변경되지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것으로 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

  1. 조직원으로부터 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포(human turbinate mesenchymal stromal cells, hTMSCs)를 제공하는 단계;
    상기 제공된 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포(human turbinate mesenchymal stromal cells, hTMSCs)를 KGF(keratocyte growth factor)가 첨가된 각막분화배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 각막세포 전구체 분화방법.
  2. 제 1항에 있어서, 각막분화배지에서 배양하는 단계는
    성장 배양배지로 DMEM high glucose를 사용하며, 5-15% FBS, 0.5-1.5% P/S를 첨가하여 조성하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 각막세포 전구체 분화방법.
  3. 제 1항에 있어서, 각막분화배지에서 배양하는 단계는
    분화 배양배지로 DMEM/F12를 사용하며, 0.5-1.5% horse serum, KFG 8-12ng/ml 또는 EGF 8-12ng/ml을 첨가하여 조성하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 각막세포 전구체 분화방법.
  4. 제 1항에 있어서, 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포(human turbinate mesenchymal stromal cells, hTMSCs)를 제공하는 단계는,
    분리된 사람의 하비갑개 조직을 절단한 후, 배양배지에 상기 하비갑개 조직을 유착시켜 배양한 다음, 상기 배양배지에 부착된 사람 하비갑개 유래의 중간엽 기질세포를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 각막세포 전구체 분화방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 각막분화배지에서 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포가 각막세포 전구체(keratocyte progenitor cell)로 분화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 각막세포 전구체 분화방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
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