KR101970069B1 - 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 점막상피세포로의 분화방법 및 이의 용도 - Google Patents

사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 점막상피세포로의 분화방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 점막상피세포로의 분화방법, 상기 방법에 의해 분화된 점막상피세포, 및 상기 점막상피세포의 용도에 관한 것이다. 본 발명자들은 in vitro에서 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 점막상피세포로 효율적으로 분화시킬 수 있는 방법을 개발하였으며, 상기 방법으로 분화된 세포는 점막상피세포의 특징인 뮤신을 분비하고, 세포 표면의 섬모 및 세포 간 밀착연접이 형성되어 있으며, 상피세포 표지인자들을 발현하는 것을 확인하였는바, 본 발명에 따른 분화방법에 의해 분화된 점막상피세포는 상기 세포 결손 및 기능 부전에 의해 유발되는 다양한 질환을 치료하기 위한 세포치료제 및 생체모사 바이오칩 제작 용도로써 재생의학 분야에서 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

Description

사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 점막상피세포로의 분화방법 및 이의 용도 {Process for differentiation of airway mucosal epithelial cells from human nasal inferior turbinate derived mesenchymal stem cell and uses}
본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 점막상피세포로의 분화방법, 상기 방법에 의해 분화된 점막상피세포, 및 상기 점막상피세포의 용도에 관한 것이다.
의학의 발달에 따라 질병이나 외상에 의해 기능이 소실된 조직이나 장기를 유사한 자가 조직이나 기능이 동일한 장기로 대체하는 시술법이 개발되어 왔지만 이는 공여부 결손의 문제를 일으킨다. 최근에 이러한 문제를 해결하기 위해 공여부에서 소량의 세포를 얻어 세포배양기술을 이용해 증식시켜 이식하는 조직공학기법이 장기이식이나 조직이식을 대신할 수 있는 방법으로 시도되고 있다. 이러한 방법의 하나로써 줄기세포의 특성을 갖는 중간엽기질세포를 세포 공급원으로 이용하여 다양한 조직으로 분화시켜 조직 결손을 대체하기 위한 연구가 시도되고 있다.
중간엽 줄기세포(mesenchymal stromal cell)는 성체조직인 골수, 흡입된 지방조직, 제대혈, 탯줄 등에서 얻을 수 있으며 섬유모세포의 형태를 갖는다. 상기 세포는 시험관에서 무한정 증식이 가능하며, 혈액줄기세포와 달리 지방, 골세포, 연골세포, 심근세포, 신경세포 등 다양한 종류의 중요한 세포계열로 분화할 수 있어 조직공학과 재생의학의 영역에서 많은 연구가 이루어지고 있다.
하비갑개 조직은 좌우양쪽의 비강 하외측에 있는 패각상을 나타내는 독립한 작은 뼈로, 상악골 및 구개골에 부착하고 있다. 본 발명자들은 폐기되는 사람의 하비갑개 조직으로부터 중간엽 줄기세포를 분리하여 최근 연골세포, 골세포, 지방세포, 및 신경세포로 분화 가능함을 보고하였다(KR10-1327076).
한편, 코의 상피세포는 알레르기 유발 항원, 공기 중의 오염 물질 등을 포함한 모든 환경적 물질에 노출되었을 때 처음으로 만나게 되는 내피세포이다. 대부분의 오염물질들은 섬모청소(mucociliary clearance)에 의하여 제거된다. 점막상피세포는 기도뿐만 아니라 위장관의 넓은 부위에 분포하여 유해세균이나 바이러스, 유해물질을 분해하는 작용을 함으로써 인체 내에서 유해물질로부터 생체를 보호하는 작용을 하게 된다. 따라서 이러한 점막상피세포를 in vitro에서 효과적으로 분화할 수 있다면 보다 넓은 질환에서 용이하게 이용될 수 있을 것이다.
이에, 본 발명자들은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포가 가장 널리 이용되는 골수 유래 중간엽 줄기세포와 비교하여 점막상피세포로의 분화가능성이 높음을 실험적으로 확인함으로써 이를 기초로 in vitro에서 상기 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이용해 점막상피세포로 분화시킬 수 있는 방법을 개발하고자 하였다.
본 발명자들은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포가 점막상피세포로의 분화가능성을 가지고 있음을 실험적으로 확인하였으며, 이를 바탕으로 in vitro에서 상기 줄기세포를 점막상피세포로 분화시킬 수 있는 방법을 개발하였다.
이에, 본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 점막상피세포로의 분화방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 분화된 점막상피세포를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 분화된 점막상피세포를 포함하는 점막상피세포 결손 질환 치료용 세포치료제 및 생체모사 점막상피 바이오칩을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 점막상피세포로의 분화방법을 제공한다.
(a) 상부 챔버(apical chamber)에 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 분주하고 상부 챔버 및 하부 챔버(basal chamber)에 성장배지를 채워 배양하는 단계; 및
(b) 상부 챔버 내의 배지를 제거하고, 하부 챔버에만 상피세포 분화배지를 넣고 1 내지 3일 간격으로 배지를 갈아주면서 배양하여 분화시키는 단계.
또한, 본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 상피세포 분화배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 점막상피세포로의 분화방법을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 성장배지는 B-ALITM 성장 배지(growth medium)일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 단계 (a)에서 배양은 2 내지 5일 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 분화배지는 B-ALITM 분화 배지(differentiation medium)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단계 (b)에서 배양은 40일 내지 50일 동안 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 분화방법에 의해 분화된, 점막상피세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 점막상피세포를 유효성분으로 포함하는, 점막상피세포 결손 질환 치료용 세포치료제를 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 점막상피세포 결손 질환은 안면, 구강, 두경부 악성종양 수술 또는 방사선 항암치료 후 인후두, 구안, 및 기도의 점막 결손 또는 기능 부전; 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive lung disease)과 같은 만성 호흡기 질환; 낭포성 섬유증(Cystic fibrosis)과 같은 유전성 호흡기도 질환; 및 노화성 비염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 점막상피세포를 포함하는, 생체모사 점막상피 바이오칩을 제공한다.
본 발명자들은 in vitro에서 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 점막상피세포로 효율적으로 분화시킬 수 있는 방법을 개발하였으며, 상기 방법으로 분화된 세포는 점막상피세포의 특징인 뮤신을 분비하고, 세포 표면의 섬모 및 세포 간 밀착연접이 형성되어 있으며, 상피세포 표지인자들을 발현하는 것을 확인하였는바, 본 발명에 따른 분화방법에 의해 분화된 점막상피세포는 상기 세포 결손 및 기능 부전에 의해 유발되는 다양한 질환을 치료하기 위한 세포치료제 및 생체모사 바이오칩 제작 용도로써 재생의학 분야에서 유용하게 이용될 것으로 기대된다.
도 1은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 점막상피세포로의 분화가능성을 알아보기 위한 것으로, 웨스턴 블롯을 통해 상기 중간엽 줄기세포 및 골수유래 중간엽 줄기세포에서 섬모 형성에 필요한 FOXJ1 단백질의 발현수준을 비교하여 나타낸 것이다.
도 2는 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 각각 줄기세포 배양액 또는 상피세포 배양액으로 3일 또는 7일 동안 배양한 후 real-time PCR을 통해 점막상피세포 표지인자(β-tubulin Ⅳ, MUS5AC, E-cadherin, 및 FOXJ1) 및 상피 줄기세포 관련 표지인자(p63)의 mRNA 발현수준을 분석한 결과이다.
도 3은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 in vitro에서 점막상피세포로 분화시키기 위한 과정을 그림으로 도시한 것이다.
도 4는 도 3의 방법에 따라 분화시킨 세포에 대하여 점막세포에서 분비되는 뮤신이 분비되는지 알아보기 위해 알시안 블루(alcian blue) 염색을 실시한 결과이다.
도 5는 도 3의 방법에 따라 분화시킨 세포에서 섬모가 형성되었는지 확인하기 위해 주사전자현미경으로 세포 표면을 관찰한 결과이다.
도 6은 도 3의 방법에 따라 분화시킨 세포가 상피세포의 특징인 밀착연접을 형성하고 있는지 알아보기 위해 면역세포화학염색법을 통해 세포질막 표면에 존재하는 E-cadherin을 염색하고 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 7은 도 3의 방법에 따라 분화시킨 세포 내 점막상피세포의 표지인자들의 발현수준을 분석하기 위해, 분화 전 및 분화 후 세포들에 대하여 real-time PCR을 통해 상피세포 관련 표지자(β-tubulin Ⅳ, MUC5AC, E-cadherin, 및 FOXJ1), 및 상피줄기세포 관련 표지자(p63)의 mRNA 발현수준을 비교하여 나타낸 결과이다.
도 8은 ALI(air-liquid interface) 배양방법으로 골수 유래 중간엽 줄기세포를 점막상피세포로 분화시킨 세포와 도 3의 방법에 따라 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 점막상피세포로 분화시킨 세포를 비교하여 나타낸 결과이다.
본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 점막상피세포로의 분화방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명자들은 본 발명의 일실시예를 통해, 기존에 널리 이용되고 있는 골수 유래 중간엽 줄기세포와 비교하여 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포가 점막상피세포로의 높은 분화능을 가지며, 배양배지의 성분이 분화능에 영향을 미칠 수 있음을 확인하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, in vitro에서 본 발명에 따른 ALI(air-liquid interface) 배양방법으로 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 점막상피세포로 분화시켰으며, 상기 분화시킨 세포에 대하여 다양한 실험을 실시한 결과, 상기 세포는 점막세포와 같이 뮤신을 분비하고, 세포 표면에 섬모 및 세포 간 밀착연접이 형성되어 있으며, 분화 전 세포에 비하여 상피세포의 표지자를 높게 발현하는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, in vitro에서 ALI(air-liquid interface) 배양방법으로 골수 유래 중간엽 줄기세포를 점막상피세포로 분화시켰으며, 상기 분화시킨 골수 유래 중간엽 줄기세포와 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 점막상피세포로 분화시킨 세포를 비교하였다(실시예 3 참조).
이에, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 점막상피세포로의 분화방법을 제공한다.
(a) 상부 챔버(apical chamber)에 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 분주하고 상부 챔버 및 하부 챔버(basal chamber)에 성장배지를 채워 배양하는 단계; 및
(b) 상부 챔버 내의 배지를 제거하고, 하부 챔버에만 상피세포 분화배지를 넣고 1 내지 3일 간격으로 배지를 갈아주면서 배양하여 분화시키는 단계.
또한, 본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 상피세포 분화배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 점막상피세포로의 분화방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 줄기세포(stem cell)란, 개체를 구성하는 세포나 조직의 근간이 되는 세포로서 그 특징은 반복 분열하여 자가 재생(self-renewal)할 수 있고, 환경에 따라 특정한 기능을 지닌 세포로 분화할 수 있는 다분화 능력을 갖는 세포를 의미한다. 태아의 발생과정 중 모든 조직에서 생겨나며, 성인이 되어서도 골수, 상피조직 등 세포가 활발히 교체되는 일부 조직에서 발견된다. 줄기세포는 분화 가능한 세포의 종류에 따라 수정란이 첫 분열을 시작할 때 형성되는 전능성 줄기세포(totipotent stem cells)와, 이 세포들이 계속 분열해 만들어진 포배 내막에 있는 만능성 줄기세포(pluripotent stem cells), 그리고 성숙한 조직과 기관 속에 존재하는 다능성 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류된다. 이때, 다능성 줄기세포는, 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 세포로써 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직 손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있다. 이러한 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라고도 한다.
성체 줄기세포로 분류되는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)는 재생의학의 재료로 각광받고 있는 세포로, 골수, 제대혈, 지방조직, 탯줄 등의 조직에서 채취될 수 있으며, 혈액 줄기세포와 달리 지방세포, 골세포, 연골세포, 신경세포, 심근세포 등 다양한 인체 조직을 구성하는 세포로의 분화능을 가진다. 본 발명에서는 사람 하비갑개 조직으로부터 분리한 중간엽 줄기세포를 이용하였다.
본 발명에서 사용되는 용어, 분화(differentiation)란, 초기 단계의 상기 줄기세포가 각 조직으로서의 특성을 갖게 되는 과정을 일컫는 것으로서, 본 발명의 목적상 점막상피세포로서의 특성을 지니게 되는 것을 의미한다.
상기 단계 (a)에서, 상기 성장배지는 일반적인 줄기세포 성장배지를 의미하며, 보다 바람직하게는 B-ALITM growth medium일 수 있으나, 본 발명의 중간엽 줄기세포를 성장시킬 수 있는 배양배지라면 이에 제한되지 않는다.
상기 단계 (a)에서 배양은 2 내지 5일 동안 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는 3일 동안 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 분화배지는 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 점막상피세포로 분화시키기 위한 상피세포 성장배지일 수 있고, 보다 바람직하게는 B-ALITM differentiation medium일 수 있으며, B-ALI 분화배지에 소 뇌하수체 추출물(bovine pituitary extract; BPE), 인슐린(insulin), 히드로코르티손(hydrocortisone), GA-1000, 레티노산(retinoic acid), 트랜스페린(transferrin), 트리요오드티로닌(triiodothyronine), 에피네프린(epinephrine), 사람 표피세포성장인자(human epidermal growth factor; hEGF), 및 inducer를 첨가하여 사용할 수 있으나, 상기 분화배지의 종류가 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단계 (b)에서, 배양은 약 40일 내지 50일 동안 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는 45일 동안 배양할 경우 분화된 점막상피세포를 수득할 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 분화방법에 의해 분화된 점막상피세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 점막상피세포를 유효성분으로 포함하는 점막상피세포 결손 질환 치료용 세포치료제를 제공한다.
상기 점막상피세포 결손 질환은 안면, 구강, 두경부 악성종양 수술 또는 방사선 항암치료 후 인후두, 구안, 및 기도의 점막 결손 또는 기능 부전; 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive lung disease)과 같은 만성 호흡기 질환; 낭포성 섬유증(Cystic fibrosis)과 같은 유전성 호흡기도 질환; 및 노화성 비염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 점막상피세포를 포함하는 생체모사 점막상피 바이오칩을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 바이오칩은 알레르기비염 및 천식 등의 알레르기 호흡기 질환의 환자 맞춤형 정밀의학 치료를 위한 환자 맞춤형 호흡기도 점막 바이오칩, 점막상피를 투과하는 약물 스크리닝, 흡연과 미세먼지 등 호흡기 유해물질 영향 분석 등을 위한 용도로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 점막상피세포로의 분화가능성 확인
1-1. 사람 하비갑개 유래 및 골수 유래 중간엽 줄기세포의 섬모형성 관련 유전자 발현량 비교
사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포가 점막상피세포로 분화할 수 있는지 가능성을 알아보기 위해, 상기 중간엽 줄기세포 및 골수유래 중간엽 줄기세포를 대상으로 점막상피에서 중요한 역할을 하는 섬모를 형성하는데 필요한 FOXJ1 유전자의 발현량을 웨스턴 블롯을 통해 분석하였다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(1~8번 샘플)의 경우 조직 공여자에 따라 단백질 발현량에 차이는 있으나 모두 상기 FOXJ1 유전자를 발현하는 반면, 가장 널리 이용되는 골수유래 중간엽 줄기세포(9번 샘플)의 경우 거의 발현하지 않는 것을 관찰하였다.
상기 결과를 통해, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 점막상피세포로의 분화가능성을 확인하였다.
1-2. 배양액의 구성성분에 따른 영향 분석
사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 점막상피세포로 분화시키는데 있어서, 배양액의 구성성분이 영향을 미치는지 알아보기 위해, 상기 중간엽 줄기세포를 다른 조성의 배양액으로 각각 배양한 후 세포내 유전자의 발현 변화를 분석하였다. 보다 구체적으로, 상기 중간엽 줄기세포를 6웰 플레이트에 웰 당 1.5X105개씩 분주하고, 2일 동안 기본 줄기세포 배양액에서 배양하여 세포가 배양면적의 80%까지 증식하면 PBS로 세포를 충분히 세척하여 기본 배양액을 제거해주었다. 다음으로, 상기 세포를 각각 줄기세포 배양액 또는 상피세포 배양액을 이용하여 배양하면서 2일 간격으로 배양액을 교체해주고, 각각 3일 및 7일째에 세포에서 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하고, 이를 주형으로 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 통해 점막상피세포 표지인자(β-tubulin Ⅳ, MUS5AC, E-cadherin, 및 FOXJ1), 및 상피줄기세포 관련 표지인자(p63)의 RNA 발현수준을 분석하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 배양액의 차이만으로도 점막상피세포 표지인자들의 발현수준이 현저히 변화하는 것을 알 수 있었으며, 상기 중간엽 줄기세포가 점막상피세포로 충분한 분화가능성을 가지는 것을 확인하였다.
실시예 2. 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 점막상피세포로의 분화
2-1. ALI 배양방법을 이용한 in vitro 에서의 분화 유도
상기 실시예 1을 통해 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포가 점막상피세포로 분화가능성이 높음을 확인하였으므로, 실제로 in vitro에서 분화를 유도하고자 하였다. 이를 위해, ALI(air-liquid interface) 배양방법을 이용하여 진행하였으며, 실험과정 모식도를 도 3에 그림으로 도시하였다. 보다 구체적으로, 상부 챔버(apical chamber)에 상기 중간엽 줄기세포를 4X104개만큼 분주하고, 100 ㎕의 성장배지(B-ALITM growth medium)를 상부 챔버 및 하부 챔버(basal chamber)에 첨가하여 3일 동안 세포를 배양하였다. 이후 상부 챔버 내의 배지는 깨끗이 제거하고, 하부 챔버에만 100 ㎕의 상피세포 분화배지(B-ALITM differentiation medium, Lonza #00193514)를 넣어 2일 간격으로 배양액을 교환해 주며 45일 동안 분화시켰다. 이때 상기 분화배지는 B-ALI 분화배지에 소 뇌하수체 추출물(bovine pituitary extract; BPE), 인슐린(insulin), 히드로코르티손(hydrocortisone), GA-1000, 레티노산(retinoic acid), 트랜스페린(transferrin), 트리요오드티로닌(triiodothyronine), 에피네프린(epinephrine), 사람 표피세포성장인자(human epidermal growth factor; hEGF), 및 inducer를 첨가하여 사용하였다.
2-2. 분화시킨 세포 분석
실험 후 점막세포에 의해 분비되는 뮤신(mucin)이 분화시킨 세포로부터 분비되는지 확인하기 위해 알시안 블루(alcian blue) 염색을 실시한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 성장배지에서만 배양한 경우(Control medium)에 비하여 상기 방법에 따라 분화배지에서 배양한 경우 뮤신이 현저히 많이 분비되는 것을 관찰하였다.
상기 결과에 더하여, 분화시킨 세포에서 섬모가 형성되었는지 관찰하기 위해 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope)을 통해 세포의 표면을 관찰한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 다소 드물지만 섬모가 형성된 것을 확인하였다.
또한, 분화시킨 세포가 상피세포의 특징인 밀착연접(tight junction)을 형성하고 있는지 확인하기 위해 면역세포화학염색법을 통해 세포 사이에 있는 세포질 막 표면에 존재하는 E-cadherin을 염색하고 공초점 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 도 6에서 볼 수 있는바와 같이, 녹색 형광을 통해 분화시킨 세포들 사이에 E-cadherin이 다량 발현되고 있음을 확인하였다.
마지막으로, 상부 챔버에 있는 세포들을 모아 RNA를 추출하고 이로부터 cDNA를 합성한 후 real-time PCR을 통해 점막상피세포의 표지인자들의 RNA 발현수준을 측정하였다. 그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 상피줄기세포의 표지자인 p63은 분화 전(Cont)과 분화 후(diff)에 발현량의 차이가 없었으나, 섬모세포 표지자인 β-tubulin, 배상세포 표지자인 MUC5AC, 밀착연접 표지자인 E-cadherin, 및 섬모형성 관여 표지자인 FOXJ1의 경우 분화 전의 중간엽 줄기세포에 비해 45일 동안 점막상피세포로 분화시킨 세포에서 발현량이 증가된 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통해 상기 ALI 배양방법으로 분화시킨 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 점막상피세포로 분화된 것을 알 수 있으며, 나아가 분화된 점막상피세포는 기관의 결손, 안면골 골절, 및 폐의 기능장애 등에서 점막상피세포의 재생 연구에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
실시예 3. 골수 유래 중간엽 줄기세포에서 분화시킨 세포와의 비교
골수 유래 중간엽 줄기세포를 활용하여, 상기 실시예 2-1의 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포와 동일한 방법인 ALI(air-liquid interface) 배양방법으로 호흡점막 상피세포로의 분화를 진행하여 각 분화시킨 세포를 비교하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 상피세포로의 분화배지에서 하루 배양 후 상부 챔버 (apical chamber)의 멤브레인에 세포가 잘 부착 되어 있었으나, 이와는 달리, 골수 유래 중간엽 줄기세포는 분화배지를 넣어 분화를 유도한 다음 하루 뒤 현미경에서 관찰하였을 때, 상부 챔버의 멤브레인의 세포가 사멸하여 더 이상 실험을 진행할 수 없었으며, 이처럼 골수 유래 중간엽 줄기세포가 사멸되어 상부 챔버 멤브레인에 세포가 남아있지 않음을 광학 현미경을 통하여 확인할 수 있었다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (8)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 점막상피세포로의 분화방법:
    (a) 상부 챔버(apical chamber)에 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 분주하고 상부 챔버 및 하부 챔버(basal chamber)에 성장배지를 채워 배양하는 단계; 및
    (b) 상부 챔버 내의 배지를 제거하고, 하부 챔버에만 상피세포 분화배지를 넣고 1 내지 3일 간격으로 배지를 갈아주면서 배양하여 분화시키는 단계,
    상기 (b) 단계에 있어서, 상기 상부 챔버에는 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포 외의 점막상피세포는 분주하지 않음을 특징으로 함.
  2. 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 상피세포 분화배지에서 배양하는 단계를 포함하고, 상기 상피세포 분화배지에는 상기 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포에서 분화된 점막상피세포 외에 분주한 점막상피세포는 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 점막상피세포로의 분화방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)에서 배양은 2 내지 5일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 분화방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)에서 배양은 40일 내지 50일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 분화방법.
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